miR-7-5p/FGFR4軸與膽囊癌臨床病理特征及預后的關系

陳正民　李乃樹　劉子祥　姚超　孫發締　許兆龍

【摘要】 目的：探討微小核糖核酸-7-5p（miR-7-5p）/成纖維細胞生長因子受體4（FGFR4）軸與膽囊癌病理特征、預后的關系。方法：選取蚌埠醫學院第二附屬醫院2018年4月—2022年4月收治的膽囊癌患者108例為膽囊癌組，按照2∶1比例選取同期收治的良性膽囊疾病患者54例為良性組。比較兩組miR-7-5p mRNA、FGFR4 mRNA表達水平，分析二者表達與膽囊癌病理特征的關系。以患者入院第1天作為隨訪起始日，截至2023年4月30日，記錄隨訪期間的生存率，分析miR-7-5p mRNA、FGFR4 mRNA表達與膽囊癌預后的關系。結果：膽囊癌組miR-7-5p mRNA表達低于良性組，FGFR4 mRNA表達高于良性組，差異均有統計學意義（P<0.05），且膽囊癌患者miR-7-5p mRNA與FGFR4 mRNA表達呈負相關（P<0.05）。臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、腫瘤最大直徑≥3 cm、有淋巴結轉移、低分化患者的miR-7-5p mRNA表達水平均低于臨床分期Ⅰ～Ⅱ期、腫瘤最大直徑<3 cm、無淋巴結轉移、中-高分化患者，差異均有統計學意義（P<0.05）。臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、腫瘤最大直徑≥3 cm、有淋巴結轉移、低分化患者的FGFR4 mRNA表達水平均高于臨床分期Ⅰ～Ⅱ期、腫瘤最大直徑<3 cm、無淋巴結轉移、中-高分化患者，差異均有統計學意義（P<0.05）。miR-7-5p mRNA高表達組生存率高于低表達組，平均生存期長于低表達組，兩組生存曲線比較，差異有統計學意義（P<0.05）。FGFR4 mRNA高表達組生存率低于低表達組，平均生存期短于低表達組，兩組生存曲線比較，差異有統計學意義（P<0.05）。COX回歸分析提示，miR-7-5p mRNA表達增高是膽囊癌預后的保護因素，FGFR4 mRNA表達增高是膽囊癌預后的危險因素（P<0.05）。結論：膽囊癌組織中miR-7-5p mRNA表達下調，FGFR4 mRNA表達上調，二者存在相關性，且與臨床分期、腫瘤大小、淋巴結轉移、分化程度密切相關，是膽囊癌預后的獨立影響因素，有望成為預測膽囊癌預后的重要指標。

【關鍵詞】 膽囊癌 微小核糖核酸-7-5p 成纖維生長因子受體4 病理特征 預后

Relationship between miR-7-5p/FGFR4 Axis and Clinicopathological Features and Prognosis of Gallbladder Carcinoma/CHEN Zhengmin， LI Naishu， LIU Zixiang， YAO Chao， SUN Fadi， XU Zhaolong. //Medical Innovation of China， 2023， 20（33）： 00-007

[Abstract] Objective： To investigate the relationship between microRNA-7-5p （miR-7-5p）/fibroblast growth factor receptor 4 （FGFR4） axis and pathological features and prognosis of gallbladder carcinoma. Method： A total of 108 patients with gallbladder carcinoma admitted to the 2nd Affiliated Hospital of BBMC from April 2018 to April 2022 were selected as the gallbladder carcinoma group， and according to the ratio of 2∶1， 54 patients with benign gallbladder disease admitted during the same period were selected as the benign group. The expression levels of miR-7-5p mRNA and FGFR4 mRNA were compared between the two groups， and the relationship between the expression and pathological features of gallbladder carcinoma were analyzed. With the first day of the patient's admission was taken as the start date of follow-up， and as of April 30， 2023. The survival rate during follow-up was recorded， and the relationship between the expression of miR-7-5p mRNA and FGFR4 mRNA and the prognosis of gallbladder carcinoma was analyzed. Result： The expression of miR-7-5p mRNA in gallbladder carcinoma group was lower than that in benign group， and FGFR4 mRNA expression in gallbladder carcinoma group was higher than that in benign group， the differences were statistically significant （P<0.05）， and miR-7-5p mRNA was negatively correlated with FGFR4 mRNA expression in gallbladder carcinoma patients （P<0.05）. The expression levels of miR-7-5p mRNA in patients with clinical stage Ⅲ-Ⅳ， maximum tumor diameter ≥3 cm， with lymph node metastasis and poorly differentiation were lower than those in patients with clinical stage Ⅰ-Ⅱ， maximum tumor diameter <3 cm， no lymph node metastasis and moderate-well differentiation， the differences were statistically significant （P<0.05）. The expression levels of FGFR4 mRNA in patients with clinical stage Ⅲ-Ⅳ， maximum tumor diameter ≥3 cm， with lymph node metastasis and poorly differentiation were higher than those in patients with clinical stage Ⅰ-Ⅱ， maximum tumor diameter <3 cm， no lymph node metastasis and moderate-well differentiation， the differences were statistically significant （P<0.05）. The survival rate of the high expression group of miR-7-5p mRNA was higher than that of the low expression group， and the average survival time of the high expression group was longer than that of the low expression group， and the survivorship curve of the two groups was statistically significant （P<0.05）. The survival rate of the high expression group of FGFR4 mRNA was lower than that of the low expression group， and the average survival time of the high expression group was shorter than that of the low expression group， and the survivorship curve of the two groups was statistically significant （P<0.05）. COX regression analysis suggested that the increased expression of miR-7-5p mRNA was a protective factor for the prognosis of gallbladder carcinoma， and the increased expression of FGFR4 mRNA was a risk factor for the prognosis of gallbladder carcinoma （P<0.05）. Conclusion： The expression of miR-7-5p mRNA is down-regulated and FGFR4 mRNA expression is up-regulated in gallbladder carcinoma tissues， and the two are correlated. And they are closely related to clinical staging， tumor size， lymph node metastasis and differentiation degree. They are independent factors influencing the prognosis of gallbladder carcinoma， and are expected to be an important indicator for predicting the prognosis of gallbladder carcinoma.

[Key words] Gallbladder carcinoma miR-7-5p FGFR4 Pathological features Prognosis

First-author's address： The 2nd Affiliated Hospital of BBMC， Bengbu 233000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2023.33.001

膽囊癌是惡性程度較高的一種消化系統腫瘤，死亡率在各類惡性腫瘤中居第6位，但若能盡早確診，及時行根治性手術，5年生存率較理想[1]。然而，膽囊癌早期發病隱匿，缺乏典型癥狀，當出現明顯癥狀時，往往已發展為中晚期，錯過最佳干預時機，預后欠佳[2]。臨床必須尋求新的膽囊癌相關標志物與治療靶點，為治療提供依據，提高遠期生存率，改善預后。研究表明微小核糖核酸（microRNA，miRNA）與腫瘤發生、進展密切相關，它能直接降解靶基因mRNA，或對蛋白翻譯過程進行抑制，經轉錄后調控靶基因表達水平，參與細胞增殖、黏附、侵襲、轉移、凋亡等過程，可通過作用于下游分子及相關信號通路，發揮抑癌或促癌作用[3]。既往研究發現，miR-7-5p可以通過靶向絲氨酸/蘇氨酸激酶11的3UTR對非小細胞肺癌的A549細胞凋亡進行調控[4]。這表明miR-7-5p與腫瘤疾病存在關聯，但與膽囊癌病理特征、預后的關系尚未徹底明確。另有研究指出，成纖維細胞生長因子受體（fibroblast growth factor receptor，FGFR）能與其配體相互作用，參與腫瘤細胞的增殖、遷移等過程，FGFR4作為FGFR家族的成員，亦與腫瘤發生有關[5]。基于此，本研究旨在分析miR-7-5p/FGFR4軸與膽囊癌病理特征、預后的關系，進一步明確miR-7-5p與FGFR4的關系，以及二者在膽囊癌中的作用機制，為該病日后的治療提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取蚌埠醫學院第二附屬醫院2018年4月—2022年4月收治的膽囊癌患者108例為膽囊癌組，按照2︰1比例選取同期收治的良性膽囊疾病患者54例為良性組。（1）納入標準：膽囊癌組，①經手術病理證實為膽囊癌，且留取組織樣本檢測miR-7-5p mRNA、FGFR4 mRNA表達水平；②年齡≥18歲；③精神狀態及認知、表達能力正常，可配合隨訪。良性組，①良性膽囊疾病，同期于本院接受手術治療，留取樣本組織檢測miR-7-5p mRNA、FGFR4 mRNA表達水平；②年齡≥18歲；③精神狀態、認知、表達正常。（2）排除標準：①同時患其他原發性腫瘤；②此次因膽囊癌復發入院接受手術治療；③術前行新輔助放療、化療；④出血性疾病、心臟病、血液系統疾病；⑤肝、腎、腦等重要臟器功能不全。研究方案獲本院醫學倫理委員會批準。患者或家屬對研究知情同意。

1.2 方法

1.2.1 主要儀器與試劑 利用逆轉錄定量聚合酶鏈反應（reverse transcription quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）檢測膽囊樣本組織中miR-7-5p mRNA、FGFR4 mRNA表達水平。主要儀器為離心機（Avanti JXN-30型，美國貝克曼庫爾特有限公司）、PCR檢測儀（ABI 7500型，美國ABI公司）、熒光定量PCR儀（LightCycler96型，瑞士羅氏公司）。主要試劑為Trizol試劑（美國Invitrogen公司）、實時熒光定量PCR試劑（美國貝克曼庫爾特有限公司）。

1.2.2 檢測方法 通過手術獲取樣本組織，并存放在液氮內完全冷凍，研磨成粉末狀，經Trizol試劑完全裂解，對總RNA進行提取，測定其純度與濃度，存至低溫環境（-80 ℃）。將RNA逆轉錄合成cDNA，引物采用Primer 5.0軟件設計，以β-actin為內參，上、下游引物序列具體如下，（1）miR-7-5p：5-TAATGGTGTTGGGAATGATGGAAT-3、5-TTGGTGGGTGGGGTGGGAAAATA-3；（2）FGFR4：5-TATGGTGGGAAATGGATGGAT-3、5-TAATGGGTAGTGGAATGTTGTAT-3；（3）β-actin：5-TTTGTGGGGTGAATGTAAAATGG-3、5-TGGTGAAGTGGGGTGGAATG-3。PCR反應條件：95 ℃ 5 min（預變性）；95 ℃ 30 s（變性），62 ℃ 35 s（退火），72 ℃ 30 s（延伸），35個循環。根據2-ΔΔCt法確定目標基因的表達水平。

1.3 隨訪

以患者入院第1天作為隨訪起始日，截至2023年4月30日，采用電話/微信隨訪，記錄患者的生存率，每3個月進行1次隨訪。

1.4 統計學處理

經SPSS 20.0軟件統計數據。計數資料以率（%）表示，行字2檢驗；滿足正態分布的計量資料以（x±s）表示，多組間比較行單因素方差分析，兩兩比較行LSD檢驗，兩組間比較行獨立樣本t檢驗；利用Kaplan-Meier法與log-rank檢驗進行生存分析；兩計量資料的相關性采用Pearson線性相關分析；miR-7-5p mRNA、FGFR4 mRNA表達與膽囊癌預后的關系采用COX回歸分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組一般資料比較

兩組一般資料比較，差異均無統計學意義（P>0.05），具有可比性，見表1。

2.2 兩組miR-7-5p mRNA、FGFR4 mRNA表達比較

膽囊癌組miR-7-5p mRNA表達低于良性組，FGFR4 mRNA表達高于良性組，差異均有統計學意義（P<0.05），見表2。Pearson線性相關分析提示，膽囊癌患者miR-7-5p mRNA與FGFR4 mRNA表達呈負相關（r=-0.735，P<0.05）。

2.3 膽囊癌患者miR-7-5p mRNA表達與病理特征的關系

臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、腫瘤最大直徑≥3 cm、有淋巴結轉移、低分化患者的miR-7-5p mRNA表達水平均低于臨床分期Ⅰ～Ⅱ期、腫瘤最大直徑<3 cm、無淋巴結轉移、中-高分化患者，差異均有統計學意義（P<0.05），見表3。

2.4 膽囊癌患者FGFR4 mRNA表達與病理特征的關系

臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、腫瘤最大直徑≥3 cm、有淋巴結轉移、低分化患者的FGFR4 mRNA表達水平均高于臨床分期Ⅰ～Ⅱ期、腫瘤最大直徑<3 cm、無淋巴結轉移、中-高分化患者，差異均有統計學意義（P<0.05），見表4。

2.5 miR-7-5p mRNA、FGFR4 mRNA表達與膽囊癌預后的關系

本次隨訪時間為12～36個月，中位隨訪時間24個月。（1）以膽囊癌患者miR-7-5p mRNA表達的均值2.45為界（≥均值為高表達，<均值為低表達），分為miR-7-5p mRNA高表達組（n=58）與低表達組（n=50）。結果提示，miR-7-5p mRNA高表達組生存率為74.14%（43/58），平均生存期32個月，低表達組生存率為42.00%（21/50），平均生存期26個月。miR-7-5p mRNA高表達組生存率高于低表達組，平均生存期長于低表達組，兩組生存曲線比較，差異有統計學意義（log-rank 字2=11.727，P<0.001），見圖1。（2）以膽囊癌患者FGFR4 mRNA表達的均值34.69為界（≥均值為高表達，<均值為低表達），分成FGFR4 mRNA高表達組（n=61）與低表達組（n=47）。結果提示，FGFR4 mRNA高表達組生存率為47.54%（29/61），平均生存期28個月，低表達組生存率為74.47%（35/47），平均生存期32個月。FGFR4 mRNA高表達組生存率低于低表達組，平均生存期短于低表達組，兩組生存曲線比較，差異有統計學意義（log-rank 字2=7.429，P=0.006），見圖2。

2.6 miR-7-5p mRNA、FGFR4 mRNA表達與膽囊癌預后的COX回歸分析

在調整了性別、年齡、臨床分期、腫瘤最大直徑、淋巴結轉移、分化程度、病理類型后，COX回歸分析提示，miR-7-5p mRNA表達增高是膽囊癌預后的保護因素，FGFR4 mRNA表達增高是膽囊癌預后的危險因素（P<0.05），見表5。

3 討論

目前，臨床對膽囊癌診療已取得了一定進展，但由于早期診斷難度大，部分患者就診時已出現早期淋巴結轉移，甚至侵犯肝臟，即便行手術治療，術后復發風險仍較高[6-7]。臨床亟須進一步掌握膽囊癌的發病與進展機制，尋求新的治療靶點。膽囊癌侵襲、轉移過程非常復雜，涉及多種信號通路、效應因子、腫瘤微環境等因素[8]，但具體機制現階段尚無定論。miRNA是非編碼單鏈小分子RNA，能對各種生物過程進行調控，如調節細胞的增殖、分化、凋亡，并且參與了免疫應答、神經元發育等過程，與腫瘤發生、進展密切相關[9]。miR-7-5p則在多類惡性腫瘤中發揮了調控作用，且通過不同途徑影響患者病情[10-11]，但關于其對膽囊癌的作用機制有待進一步探討。FGFR4在肝癌等腫瘤組織中存在異常表達，參與了腫瘤血管形成過程[12]。通過分析miR-7-5p、FGFR4與膽囊癌進展、預后的關系，便于更深入掌握與之相關的治療靶點。

本次結果發現，與良性膽囊疾病組織相比，膽囊癌組織中miR-7-5p mRNA表達下調，而FGFR4 mRNA表達上調，且在膽囊癌患者中二者呈負相關。研究指出miR-7-5p是一種腫瘤抑制因子，對腫瘤生長、侵襲有抑制作用[13]。王富霞等[14]發現，miR-7-5p能與聚合酶ε基因4[polymerase （DNA-directed） epsilon 4，POLE4]靶向結合，對非小細胞肺癌的腫瘤細胞增殖、侵襲、轉移進行抑制。劉志洋等[15]研究提示，miR-7-5p能對POLE4表達進行靶向抑制，從而抑制神經母細胞瘤的增殖、侵襲。彭慧等[16]發現，食管癌組織中miR-7-5p呈低表達，Krüppel樣因子4（Krüppel-like factor 4，KLF4）呈過表達，miR-7-5p能通過靶向抑制KLF4對食管癌細胞的增殖及轉移能力進行調控。這進一步提示miR-7-5p具有腫瘤抑制作用，本研究亦證實miR-7-5p在膽囊癌組織中呈低表達，表明患者體內的抑癌作用削弱。FGFR4是FGFR家族的重要成員，亦是一種癌蛋白，FGFR4過表達可致Wnt/β-連環蛋白（Wnt/β-catenin）、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylin-ositol-3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）、Janus激酶/信號轉導及轉錄活化因子（Janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT）等下游信號通路處于失調狀態，增強腫瘤細胞的增殖、轉移能力，這是FGFR4促進癌癥進展的重要機制[17]。董慶旭等[18]指出，通過抑制FGFR4表達，能對口腔鱗癌細胞增殖進行抑制，促進腫瘤細胞凋亡，亦表明FGFR4的過表達具有促癌作用。本次發現miR-7-5p與FGFR4表達存在相關性，miR-7-5p能抑制膽囊癌細胞增殖，促進癌細胞凋亡，而FGFR4可促進癌細胞增殖，抑制癌細胞凋亡，故二者在膽囊癌患者中呈負相關。

本研究提示，miR-7-5p、FGFR4表達均與膽囊癌臨床分期、腫瘤大小、淋巴結轉移、分化程度相關，提示二者對膽囊癌進展有調控作用。miR-7-5p的主要靶基因為AKT1、磷脂酰肌醇-3-激酶催化亞單位α基因（phosphatidylinositol 3-kinase catalytic alpha polypeptide gene，PIK3CA）等[19]。FGFR4則可影響PI3K/Akt信號通路，與miR-7-5p存在相同靶基因，即二者具有相同下游信號通路。當miR-7-5p表達受到抑制后，FGFR4表達上調，膽囊癌細胞侵襲能力增強，促進病情進展，miR-7-5p/FGFR4軸可能通過上述機制，影響膽囊癌患者病情。本次結果提示，miR-7-5p高表達及FGFR4低表達患者的預后更好，遠期生存率更高，總生存期延長，且二者均為膽囊癌預后影響因素。研究表明miR-7-5p聯合miR-152-3p能對Wnt/β-catenin通路進行調控，影響乳腺癌的化療耐藥[20]，這提示miR-7-5p可影響腫瘤化療效果，化療效果則與預后密切相關。FGFR4能通過調控Wnt/β-catenin、PI3K/Akt、JAK/STAT等信號通路，產生促癌作用，導致病情進展，影響預后。miR-7-5p/FGFR4軸在膽囊癌進展中有重要調控作用，最終影響患者的遠期生存率。

綜上所述，miR-7-5p/FGFR4軸對膽囊癌進展有調控作用，與患者的腫瘤分期、腫瘤大小、淋巴結轉移、分化程度和預后密切相關，二者均為膽囊癌預后的獨立影響因素。但本研究也有不足，如最長隨訪時間為36個月，受研究時間限制，未能進行更遠期的隨訪，之后還需延長隨訪時間予以觀察。

參考文獻

[1] LEIGH N，SOLOMON D，PLETCHER E，et al.Adeno-squamous and squamous cell carcinoma of the gallbladder： the importance of histology in surgical management[J].Am J Surg，2020，220（5）：1242-1248.

[2]劉穎斌，陳煒.重視膽囊癌的規范化診斷和治療[J].中華外科雜志，2021，59（4）：249-254.

[3]胡晟，鄒浩，周磊，等.非編碼RNA在膽管惡性腫瘤的研究進展[J].醫學研究雜志，2019，48（1）：4-6.

[4]王國芳，王玉娟，郎華.miR-7-5p靶向絲氨酸/蘇氨酸激酶11調控非小細胞肺癌細胞A549的凋亡[J].解剖學研究，2019，41（6）：487-492.

[5]董航，王碩，吳沛鴻，等.FGFR4基因狀態與晚期非小細胞肺癌患者臨床病理特征及預后的關系[J].現代腫瘤醫學，2020，28（15）：2609-2613.

[6] LV T R，YANG C，REGMI P，et al.The role of laparoscopic surgery in the surgical management of gallbladder carcinoma： a systematic review and meta-analysis[J].Asian J Surg，2021，44（12）：1493-1502.

[7]朱沂，趙華，謝敏杰，等.經皮經肝膽道鏡治療膽腸吻合口良性狹窄九例的臨床效果[J].中華外科雜志，2021，59（4）：289-292.

[8] MEHROTRA R，TULSYAN S，HUSSAIN S，et al.A systematic review with in silico analysis on transcriptomic profile of gallbladder carcinoma[J].Semin Oncol，2020，47（6）：398-408.

[9]成亞飛，王斌，王世明.microRNA在膽囊癌中的作用[J].臨床肝膽病雜志，2020，36（8）：1900-1904.

[10]尚念紅.微小RNA-7-5p靶向調節鋅指蛋白核轉錄因子4基因抑制口腔鱗狀細胞癌細胞增殖和誘導凋亡的體外研究[J].安徽醫藥，2021，25（12）：2470-2474.

[11]靳彩玲，趙樹鵬，姬穎華，等.敲除OIP5-AS1基因通過miR-7-5p/PARP1軸增強非小細胞肺癌細胞的化學敏感性[J].臨床與實驗病理學雜志，2020，36（9）：1029-1035.

[12]王敏，張謹陽，王雨薇，等.FGFR4：一種有望治療肝癌的靶點[J].藥學學報，2021，56（7）：1832-1844.

[13]葉志強，郭貴龍，陳涵斌，等.miR-7-5p抑制胰腺癌細胞放療后加速再增殖的體外實驗研究[J].肝膽胰外科雜志，2020，32（5）：297-303.

[14]王富霞，姚菲菲，李增艷.miR-7-5p通過調控POLE4對非小細胞肺癌細胞增殖侵襲的影響及作用機制[J].腫瘤防治研究，2021，48（7）：709-713.

[15]劉志洋，董蒨，韓蘆蘆，等.miR-7-5p靶向調控POLE4對神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y體外增殖和侵襲的影響研究[J].中華小兒外科雜志，2019，40（9）：844-848.

[16]彭慧，陳丹，李東林，等.miR-7-5p靶向KLF4基因調控食管癌細胞的增殖和遷移能力[J].腫瘤，2021，41（4）：238-247.

[17] ROHR M W，LESSANS S，ALJABBAN J，et al.S0118 fibroblast growth factor receptor 4 is a putative suppressor of pancreatic cancer cell migration and Gemcitabine resistance[J].Am J Gastroenterol，2020，115（1）：S57-S58.

[18]董慶旭，趙鄭莉.成纖維細胞生長因子受體4基因沉默對口腔鱗癌細胞增殖和凋亡的影響及其作用機制[J].解剖學雜志，2021，44（4）：312-318.

[19] XIN L，LIU L，LIU C，et al.DNA-methylation-mediated silencing of miR-7-5p promotes gastric cancer stem cell invasion via increasing Smo and Hesl[J].J Cell Physiol，2020， 235（3）：2643-2654.

[20]李娜，張哲瑩，朱會芳，等.miR-7-5p和miR-152-3p聯合調控Wnt/β-catenin通路對乳腺癌細胞上皮-間質轉化及化療耐藥的影響[J].臨床與實驗病理學雜志，2021，37（7）：765-770.