易栓癥分子遺傳學研究進展

楊旭虎,徐 伍,劉建成,楊海霞,馬 鑫,李玉潔,范 進,裴海峰

(1.西部戰區總醫院神經內科,四川 成都 610083;2.南方醫科大學第五附屬醫院泌尿外科,廣東 廣州510900;3.西部戰區總醫院康復科,四川 成都 610083;4.西部戰區總醫院兒科,四川 成都 610083;5.西部戰區總醫院心內科,四川 成都 610083)

易栓癥的發生與凝血系統、抗凝系統及纖溶系統密切相關,當多種遺傳或獲得性因素使得三者穩態失衡,導致機體出現容易發生血栓栓塞的疾病或狀態,即易栓癥。易栓癥最早是在報道家族性抗凝血酶缺陷時提出[1],突出表現為靜脈血栓栓塞(Venous thromboembolism,VTE),常見為下肢深靜脈血栓(Deep venous thrombosis,DVT)形成。DVT患者肺梗死的發生率約為30%,嚴重威脅人類生命健康。有研究表明,外源性損傷如脾臟破裂程度越嚴重,對凝血功能的影響越嚴重[2];部分凝血相關因子聯合心肌標志物,還可應用于冠心病的診斷[3]。而隨著對易栓癥研究的不斷深入,發現遺傳性因素在其發生中起著重要作用。通過分析國內外有關易栓癥的分子遺傳學研究,總結遺傳性易栓癥相關基因特征的研究進展,以期為進一步的研究提供思路。

1 易栓癥發病的人群特征

遺傳性易栓癥是一種常染色體顯性遺傳病,群體發病率約為7%,該病的患者VTE發生的風險是普通人群的3～20倍[4]。根據凝血系統和抗凝、纖溶系統不同的生理功能及各自基因突變產生的影響,可將易栓癥的分子遺傳學因素歸為兩大類:凝血相關因子和抗凝相關因子的基因突變或多態性。其發病特點,有著明顯的種族和地域差異:亞洲人群VTE的患病率為8%～30%,而高加索人群為1%～2%。其中,凝血因子Ⅴ Leiden G1691A 突變(FVL)和凝血因子Ⅱ (FⅡ) G20210A 突變主要見于西方人群,亞洲人群最常見的是抗凝血酶(AT)、蛋白C (PC)、蛋白S (PS)等基因突變[5]。

2 與凝血過程相關的基因及人群分布特點

人體凝血途徑分為內源性和外源性,均是在凝血相關因子參與下,完成的凝血過程,凝血相關因子的異常改變將會對凝血過程產生重大影響。從分子遺傳學角度,常見的凝血因子基因突變有FⅤ G1691A突變、FⅡ G20210A 突變等,凝血因子Ⅰ(FⅠ) 、VⅢ(FVⅢ)基因突變也有相關報道。此外,亞甲基四氫葉酸還原酶 (MTHFR)的基因多態性,也會對凝血過程產生影響。凝血因子Ⅲ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅻ及血管緊張素轉換酶(ACE)基因突變,與血栓形成的關系尚未見有顯著意義的研究成果或觀點尚未形成統一[6]。

2.1 凝血因子

2.1.1 凝血因子Ⅴ:FV是由肝臟產生的一種糖蛋白,為體內凝血酶原最主要的激活物,其編碼基因位于1號染色體長臂2區3帶(1q23)位點。變異后的FV即FVL,在1 q23染色體上第1691位點DNA核苷酸發生G→A突變,引起氨基酸序列出現 Arg506- Glu改變,抗活化蛋白C (APC)的裂解。這導致凝血酶原片段F1+D-二聚體(D-D)以及其他活化的凝血標志物水平升高,表現為輕度血栓形成前狀態,發生VTE的風險增加了2～5倍,是易栓癥的主要遺傳危險因素之一[7]。此外,在創傷、手術、妊娠和激素替代治療的患者中,FVL可能延長住院時間、增大復發可能。FVL突變占遺傳性易栓癥病例的40%～50%,在不同國家和地區的人群中其發生率差異較大,在歐美地區的發生率高于亞洲、非洲和澳大利亞地區,但FVL突變與地區的相關性也不是絕對的[8]。

2.1.2 凝血因子Ⅱ:FⅡ,即凝血酶原,在凝血過程中被激活形成凝血酶,導致血小板的活化。FⅡG20210A 突變,是指11pl1-11q12 20210位發生G→A突變,凝血酶原水平增加,引起VTE風險增加約3倍。而同時存在FⅤ G1691A和FⅡ G20210A突變的攜帶者,VTE風險增加約16倍。FⅡG20210A 突變在南歐常見(3%),北歐次之(1.7%),希族塞人的患病率(7.8%)比歐洲人高2.2倍,而在亞洲和非洲人群中非常罕見[9]。

2.1.3 凝血因子Ⅰ (FⅠ)、Ⅷ (FⅧ):FⅠ(即纖維蛋白原)分子量為340 kD,是由三條對稱分布的肽鏈(Aα,Bβ,γ)組成的糖蛋白二聚體,其由三個纖維蛋白原基因(FGA、FGB和FGG)編碼,均位于4q23-4q32。Salomon等[10]研究表明,在FGA 基因中 c.259A>C 突變與易栓癥密切相關。FⅧ分子量為300 kD,基因定位于Xq28,外顯子數26。血漿中FⅧ由兩條肽鏈組成,重鏈由A1-A2-B或A1-A2結構域組成,分子量為90～200 kD不等; 輕鏈由A3-C1-C2所組成,分子量為80 kD,二條肽鏈間由Ca2+連接;有研究發現FⅧ與妊娠早期絨毛膜下血腫(SCH)相關[11]。凝血因子FⅢ、FⅦ、FⅨ、FⅩ、FⅫ等與血栓形成的關系目前尚未見有意義的研究成果。

2.2 其他凝血相關因子 亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)可使高半胱氨酸水平升高,增加VTE風險。其基因位于1p36.3位置,全長20374 kb,共有11個外顯子,mRNA全長7,150 bp,編碼656個氨基酸殘基組成的蛋白,外顯子5和6具有最多的突變[12]。MTHFR催化5,10-亞甲基四氫葉酸還原為5-甲基四氫葉酸,將甲基供體轉化為甲硫氨酸的高半胱氨酸。MTHFR基因主要由C677T和A1298C兩個多態性變異組成。C677T多態性位于第4外顯子,密碼子222處的丙氨酸轉化為纈氨酸,該區域是MTHFR輔助因子黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的堿基結合位點。A1298C多態性位于第7外顯子,谷氨酸在密碼子429處轉化為丙氨酸。MTHFR基因多態性會引起其構象變化,改變酶的活性[13]。在歐洲,MTHFR C677T等位基因的患病率很高,西西里島和意大利發病率高達47.3%和45%,非洲和非裔美國人中C677T等位基因的發生率(3%)明顯較低[14]。ACE基因突變是指ACE基因內含子16的287堿基對片段的插入(I)或缺失(D)組成的多態性。導致三種基因型:D/D和I/I純合子和I/D雜合子。ACE是腎素-血管緊張素系統的關鍵酶,血管緊張素Ⅱ對纖溶系統的影響通過增加纖溶酶原激活劑1的水平而實現。

3 抗凝相關因子基因及人群分布特點

人體抗凝系統和纖溶系統分別起到抑制凝血過程和清除已形成血栓的作用。抗凝系統中,抗凝血酶Ⅲ(AT-3)、肝素、蛋白C(PC)和組織因子途徑抑制物等物質抑制血凝過程。纖溶系統中,纖溶酶可清除纖維蛋白凝塊和血管內的血栓,保證血液在血管內的暢通。在抗凝系統中,PS、PC、AT占比分別為7.3%、3.2%、0.5%,三者是目前研究最多的抗凝因子,亦是中國人群最主要的遺傳性易栓危險因素[15]。其中,AT-3與PC基因的突變頻率相當,PS基因突變較少[16]。此外,血栓調節蛋白(TM) THBD基因突變和狼瘡抗凝物(LA) APOH基因突變也有所報道。

3.1 蛋白S(PS)相關基因 PS是一種重要的抗凝血劑,也是APC的非酶輔助因子。PS缺乏被定義為低血漿PS水平,其改變與VTE的可變風險相關。目前已知的PS基因在人類基因組中共有2個,均定位于 3q11.1-3q11.2:一個是 PSα 或 PR0S1,具有活性,基因長度約為80 kb,包含15個外顯子和14個內含子;另一個是 PSβ 或 PROS2,無活性[17]。 PS主要在肝臟中合成,也可見于血管內皮細胞和血小板α顆粒,是一種維生素K依賴性的抗凝血蛋白,分子量為71 kD,由多個蛋白質結構域組成[18]。PS作為APC的一個非酶性的輔因子結合在磷脂表面,能加速APC滅活FⅤ、FⅧ,亦能使凝血酶和FX的活性有所減弱,使APC的抗凝活性增強。PS常以兩種形式存在于血漿中:游離型占40%,具有APC輔因子的活性;無活性的結合型與經典補體途徑中的補體4 結合蛋白以 1∶1 的比例形成復合物,約占60%。在我國,約50%VTE患者PS活性降低,但中國人群PS缺乏癥的遺傳學背景具有明顯的異質性,不存在引起易栓癥的優勢變異[4]。

3.2 蛋白C(PC)相關基因 PC是一種在肝臟中合成的維生素K依賴性抗凝蛋白。凝血酶和血栓調節蛋白的復合物將PC激活為活化PC (APC),APC對內皮表面發揮重要的抗凝作用。APC及其輔因子PS通過滅活FⅤa和FⅧa抑制凝血酶的生成。健康人PC缺乏癥的發病率約為0.2%～0.5%,VTE風險增加,凝血控制能力受損。PC的基因位于染色體2q13-2q14上,包括9個外顯子和8個內含子,常見為C6152T突變(位于第7外顯子),其中錯義和無義變異最為常見。較為嚴重的雜合子PC缺乏,可導致新生兒暴發性紫癜或彌散性血管內凝血(DIC)等危及生命的疾病。雜合子PC缺乏可分為兩種類型,Ⅰ型是PC的定量缺陷,抗原水平低和活性降低,占比75%～80%;Ⅱ型是一種定性缺陷,抗原水平正常,但PC活性降低[19]。

遺傳性PC缺乏是公認的VTE危險因素,歐洲人群中PC缺乏癥的患病率約為0.3%。與非攜帶者相比,雜合子的靜脈血栓形成風險增加約7倍。無癥狀PC缺乏癥發病率為0.2%～0.5%,而有臨床意義的PC缺乏病發病率約為0.005%[20]。

PC缺乏癥和PS缺乏癥是亞洲VTE患者主要的遺傳性危險因素,發病率分別為8.9%～10.7%和10.7%～17.8%,80%～90%的患者發生DVT或肺栓塞(PE)。中國VTE患者中,PC基因缺陷可能比AT基因缺陷更為普遍。

3.3 抗凝血酶(AT)相關基因 AT是一種天然抗凝血劑,通過共價結合凝血酶的活性絲氨酸和活化因子X使凝血酶失活。AT具有肝素結合位點在結合肝素后,其抗凝活性明顯增強。遺傳性AT缺乏癥是一種罕見的與VTE相關的疾病,表現為常染色體顯性遺傳,其患病率介于0.2%～0.02%之間。

編碼AT-3的SERPINC1基因位于1q25.1,共包含7個外顯子區域。該基因對于微小的遺傳缺陷敏感性高,任何錯義突變都可能導致其編碼的AT-3缺陷。臨床上根據對編碼的蛋白質結構/功能影響的不同,分為兩型。Ⅰ型:經典型缺乏,患者合成AT-3障礙,血漿AT-3抗原和活性均顯著降低超過50%;Ⅱ型:主要影響與凝血酶或肝素結合的結構域功能,但血漿AT-3抗原含量正常、活性減弱。其中,錯義突變及框內缺失和插入所引起的基因改變常引起Ⅱ型AT-3缺陷,且編碼功能異常蛋白的含量正常。最近報道了一種新的雜合錯義突變 c.1385G>A (Cys462Tyr),導致279Cys-462Cys二硫鍵斷裂,引發Ⅰ型遺傳性AT缺陷[21]。

SERPINC1突變在日本患者中已有報道,且發現了一個新的雜合突變(單核苷酸T插入7916和7917處,Glu 272終止于第4外顯子)。在中國VTE患者中,遺傳變異c.881G>T (p.Arg294Leu)和c.883G>A (p.Val295Met)占主導地位[22]。

3.4 血栓調節蛋白(TM)相關基因 TM 基因THBD由1728個堿基編碼的575個氨基酸殘基構成,包括1個疏水的信號肽序列,1個凝集素區域,6個表皮生長因子 (EGF)區,1個低度保守連有硫酸軟骨素鏈的絲氨酸蘇氮酸富集區,1個跨膜區和1個胞質尾區,無內含子存在。EGF4-6結合凝血酶并活化PC,EGF 5-6片段也可與凝血酶結合,但復合物無法激活PC。凝血酶通過氫鍵與EGF4結合,同時通過疏水鍵與EGF5結合,EGF4和EGF5之間通過一個短環相連,Met388位于此短環之中。Met388的突變或氧化導致EGF4和EGF5四級結構發生變化,導致TM無法與凝血酶或PC正常結合,造成凝血異常[23]。

研究證實THBD c.1418C>T多態性與下肢DVT有關,主要發生在亞洲人群,THBD c.-151G>T變異引起基因的表達水平下降,在中國人群易栓癥中也較為常見[24]。

3.5 狼瘡抗凝物(LA)相關基因 LA在體內主要通過抑制生理性抗凝物質PC的激活和干擾外周血血栓烷A2和前列環素的變化,促進血栓形成。測序發現LA的APOH基因中可編碼β2-糖蛋白I的四個多態性c.-32C>A、c.422T>C、c.461G>A 和 c.1004G>C,它們處于高度連鎖不平衡狀態,可能導致三種單倍型,即野生型H1、雜合型H2、純合型H3。 H2和H3導致VTE 風險分別增加了大約1.5倍和7倍[25]。

APOH基因單倍型是LA產生的遺傳易感因素,在中國人群中相關功能測試表明,其突變型 β2-糖蛋白I延長凝血酶凝固時間和增加凝血酶生成潛力的能力顯著降低[25]。

3.6 其 他 組織因子途徑抑制物(TFPI)基因突變,有研究認為其P1511 L、C-399 T、T287-C、C536 T等基因突變可導致VTE的發生,但也有研究表明C-399 T多態性的出現可能與VTE的發生沒有明顯的相關性,甚至T-287C和T-33C等位基因突變可能與降低血栓形成風險有關。

4 易栓癥的篩查與基因診斷

易栓癥的篩查常常用到血栓形成試驗,但會受到許多生物學和分析變量的影響,如:急性炎癥狀態或抗凝期間、暫時性危險因素(手術、創傷或長期靜止等),在上述特殊情況下發生VTE的患者不進行血栓形成試驗,以避免因假陽性誤診,而使患者接受長期抗凝治療,增加出血風險和醫療費用。大多數VTE管理指南也建議將易栓篩查限制在特定的臨床場景中,以避免試驗結果的偏差對抗凝治療決定產生重大影響。因此,迫切需要新的易栓癥篩查方法,基因診斷能避免生物學和分析變量的影響,在易栓癥的診斷中有著廣泛的應用前景。在臨床工作中,可以根據具體場景,分別或先后給予易栓癥的常規篩查和基因診斷。

4.1 易栓癥的常規篩查 通常可以通過凝血篩選試驗、特殊因子檢測進行易栓癥的常規篩查。凝血篩選試驗主要包括活化部分凝血活酶時間(APTT)、凝血酶原時間和凝血酶時間。對于急性VTE,低、中危險度血栓可能性患者可聯合D-D檢測,結果陰性可排除,陽性則可通過影像學檢查來進一步明確。但D-D檢測的診斷特異度在陳舊性血栓患者和老年人中較差(14%),不具有排除 VTE 的價值。特殊因子檢測主要包括抗凝蛋白檢測、抗磷脂綜合征相關檢測以及其他檢測如血漿同型半胱氨酸,凝血因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ和纖溶蛋白等。常見有血栓形成試驗包括PC、PS和AT缺乏的定性分析;FVL和PT G20210A的基因分型;APLA檢測(血清抗心磷脂和抗β2糖蛋白I抗體檢測和狼瘡抗凝劑檢測)。

4.2 易栓癥的基因診斷 VTE 易感基因存在于5%～10%的普通人群和至少 40%的 VTE 患者中,但并非所有易栓癥患者都需要進行基因診斷。例如,在靜脈血栓栓塞的急性期,PC/PS/AT水平可能較低,建議此時不檢查PC/PS/AT水平,除非出現如暴發性紫癜的新生兒這類特殊情況。另有研究提出,只有當難以達到治療性抗Xa水平時,才應檢查AT水平,此外,在做MTHFR基因分析前,首先應篩選患者的同型半胱氨酸水平。因此,易栓癥的基因診斷主要針對需要采取預防措施的VTE 患者或者是在 VTE 發生后需要特定或者長期治療的患者。下面是基因診斷流程:①確定候選者:首先,所有首次自發性 VTE發作的患者都不是遺傳性易栓癥篩查的候選者。②基因診斷方法:用外周血血細胞、體液等生物樣本,采用測序、對重點候選基因進行定量PCR、Sanger等方法進行檢測,并對患者的直系親屬進行相同基因突變位點驗證。

此外,Delate等使用國際疾病分類第9版(ICD-9),在易栓癥基因的敏感性、特異性、陽性預測值(PPV)和陰性預測值,以及95%CI方面,產生最高的 PPV(41.5%,95%CI:26.3%～57.9%)和高特異性(95.9%,95%CI:94.0%～97.4%),為易栓癥的基因診斷,提供了更好的理論依據。

5 展 望

由于凝血過程的瀑布效應,任何一個凝血相關因子的變化都會使凝血過程發生幾何級的改變,未來可通過基因治療藥物對易栓癥基因進行干擾、修復等,將對抑制血栓性疾病的發生具有重要的意義,但目前需要加強易栓癥基因的篩查、診斷和靶向干預。

易栓癥基因的篩查目前通常是在沒有明確檢測指征的患者和結果可能不可靠的時候進行,未來的研究需要找到更好的評估方式,以減少不利影響。加強對不同種族和地域人群易栓癥遺傳易感性的調查研究,可以使患者血栓形成的風險預測更加準確。易栓癥的基因診斷為明確血栓病因提供了科學依據,但如何精準高效地開展值得我們深思。隨著二代測序技術的日趨成熟,可對易栓癥相關基因進行突變檢測,使數據更加準確;CNV plex高通量多重基因拷貝數檢測技術,使數據更加全面;建立易栓癥基因檢測Panel,使數據的獲取更加快速準確。但由于易栓癥基因涉及凝血、抗凝血、纖溶、抗纖溶等多個系統,建立同時涵蓋這些基因的高通量測序技術,并使其能夠全面和精準地診斷遺傳性易栓癥,將是未來易栓癥基因診斷的發展趨勢。