環狀RNA在心血管疾病中的研究進展

任佳容,張 蕓

(1.內蒙古醫科大學,內蒙古 呼和浩特010059;2.內蒙古醫科大學附屬醫院全科醫學科,內蒙古 呼和浩特010050)

近年來由于社會老齡化的增加、生活節奏的加快和飲食習慣的改變,我國心血管疾病(Cardiovascular diseases,CVD)病死率占全球CVD比例不斷上升[1]。雖然近年CVD在診斷和治療上取得一些進步,但我國CVD的發病率及病死率仍呈上升趨勢,大多患者遠期預后效果較差,發病年齡也逐漸呈年輕化趨勢,從分子水平上尋找早期診斷疾病的新型生物標志物是這幾年的熱點。已有研究發現,circRNA是一類不編碼蛋白質的特殊RNA,呈共價閉合環狀結構,通過參與調控基因的轉錄與翻譯在細胞增殖、凋亡、衰老等多種生命活動及疾病中發揮著重要調控作用,其中circRNA在心血管疾病中的發生發展機制、功能作用、早期診斷等方面越來越受到重視。本文就其在心血管疾病中的研究現狀及進展進行系統綜述以期為治療心血管疾病提供新方案。

1 環狀RNA的生成機制

近年來,隨著生物信息學技術的飛速發展,在不同生物體內發現了環狀RNA[2],如病毒、真菌和哺乳動物等。與傳統線性RNA結構不同,circRNA是信使RNA(messenger RNA,mRNA)前體加工后的一個重要產物,其過程是前體mRNA下游3’端與其上游的5’端在剪接體和RNA聚合酶Ⅱ(RNA Polymerase Ⅱ,RNA Pol Ⅱ)的共同作用下反向相連形成由3’-5’磷酸二酯鍵構成的環狀閉合轉錄產物,這種剪接機制稱為反向剪接[3]。目前已有的報道指出環狀RNA通過四種剪接方式形成[4],分別是外顯子跳躍形成套索驅動模型、富含Alu重復序列的內含子自身反向互補配對環化的驅動模型、拉近相鄰兩個側翼內含子的RNA結合蛋白(RNA Binding Protein,RBP)介導模型、內含子套索去脫分支化。基于選擇性剪接,可分為三種環狀RNA:僅由外顯子組成的環狀RNA(Exonic circRNA,ecircRNA)、僅由內含子組成的環狀RNA (Circular intronic RNA,ciRNA)及外顯子內含子均包括的環狀RNA(Retained-intron circRNAs,EIciRNA)。大多數已知的環狀RNA多為第一種環狀RNA,被運輸到細胞質中[2],少數環狀RNA為第二種和第三種類型包含內含子序列的環狀RNA,局限于細胞核中[2]。作為一種新型內源性非編碼RNA,circRNA具有一定的穩定性、組織時空特異性及保守性使得circRNA有望成為新型診斷生物標記物及心血管疾病分子治療新靶點,是分子生物學領域的最新研究熱點。

2 環狀RNA的功能

隨著研究者們不斷深入研究非編碼RNA,circRNA的作用機制及生物學功能也日益被人們所揭曉。目前有研究認為其主要功能有以下幾個方面:

2.1 環狀RNA作為微小RNA分子海綿 環狀RNA充當miRNA的海綿分子的機制是指circRNA含有能與微小RNA(microRNA,miRNA)結合的應答元件,通過競爭性結合miRNA并抑制其活性,最終影響其目標基因表達,從而參與各種疾病的病理發展進程。如性別決定區Y區(circSRY)產生的睪丸特異性circRNA,通過16個miR-138的結合位點[2],結合miRNA并抑制miRNA與目標mRNA結合的能力,導致mRNA的表達增加。目前有很多研究發現大多環狀RNA擁有這一功能[5],這也是研究circRNA功能里最為成熟的一種。

2.2 環狀RNA作為基因表達轉錄后調節因子 circRNA可以通過增強親本基因的表達發揮功能,如由胰島素基因的第二個內含子產生的ciRNAs[6],其主要定位于核內,可與一種叫做RBP即DNA結合蛋白43(DNA-binding protein 43,TDP43)相互作用,進而控制胰島素分泌相關基因的轉錄,這種circRNA的水平在2型糖尿病患者的胰島中降低,這表明它可能有助于疾病的發展。

2.3 環狀RNA 海綿環狀RNA還可作為蛋白質海綿,circFoxo3上同時存在MDM2 (Mouse double-minute 2,MDM2)和p53蛋白的結合位點,circFoxo3能促使MDM2誘導的p53泛素化,導致p53蛋白的整體降解[7]。最新研究發現,N6-甲基腺嘌呤 (N6-methyladenosine,m6A)修飾的環狀RNA能與m6A識別蛋白結合,m6 A閱讀蛋白通過募集適配器蛋白12,介導核糖核酸內酶復合物降解環狀RNA[8]。

2.4 circRNA 可編碼蛋白質因為5’端7-甲基鳥嘌呤-3磷酸核苷帽子結構和3’端多聚腺甘酸尾巴結構是成功編碼RNA的重要條件,而circRNA缺乏以上結構,基于這個特點circRNA被認為無法進行蛋白翻譯過程。但近來有研究在心肌炎病毒中發現,根據特異的短RNA序列即內部核糖體進入位點(Internal ribosome entry site,IRES)[9],circRNA也可與核糖體識別并結合IRES進行蛋白質的合成過程,這提示了circRNA的蛋白質翻譯不依賴5’帽子結構也可進行,一項研究發現circβcatenin的蛋白編碼能力均由IRES驅動[10]。除此之外,在5’ 非編碼區域m6A修飾是另一種環狀RNA翻譯機制,具體起始翻譯的機制尚不清楚,但目前已有研究發現,m6A介導的翻譯需要真核翻譯起始因子4和m6A讀卡器,甲基轉移酶3和甲基轉移酶14可以增強m6A的翻譯,而去甲基化酶脂肪塊和肥胖相關蛋白和烷基化DNA修復蛋白阻斷m6A介導的翻譯過程,這表明m6A的修飾是可逆的[11]。然而,circRNA翻譯的調控機制以及延伸和終止的過程目前仍未完全了解。

3 環狀RNA與心血管疾病

全世界死亡的主要原因之一就是心血管疾病,每年大約有1790萬人死于心血管疾病,心血管疾病已對人類生命健康構成重大威脅。目前越來越多的非編碼RNA在心血管疾病的發生和發展過程中扮演著重要角色,包括心肌梗死、心臟衰竭、動脈粥樣硬化、高血壓、心肌纖維化。下面具體介紹不同環狀RNA作為“miRNA海綿分子”在心血管相關疾病中的作用。

3.1 心肌梗死 有研究表明miR-133a是一種心臟傷害因子[12],其作用是抑制結締組織因子表達,加速了心肌細胞的凋亡。而作為miR-133a的海綿,circHipk3在新生小鼠心肌中的表達量遠高于成年小鼠,隨后研究發現circHipk3/miR-133a/Notch1調控軸是促進心肌梗死后心臟修復,改善心功能的有效治療靶點,受上游轉錄因子Gata4正向調控的circHipk3一方面通過誘導下游分子Notch1胞內結構域(Notch1 intracellular domain,N1ICD)乙酰化增加蛋白穩定性,另一方面調控細胞周期進程促進心肌細胞(Myocardial cells,CM)增殖。此外,過表達的circHIPK3可參與CM與內皮細胞(Endothelial cells,EC)之間的通信,不同于傳統觀點認為細胞間通訊是circHIPK3協調CM和EC的關鍵環節,Si等推測circHIPK3通過誘導血運重建向再生組織提供營養和氧氣有利于CM增殖,但該研究未指出circHIPK3是否通過其他方式如細胞膜供受體作用或釋放生長因子等可溶性分子參與心肌再生與血管生成之間的通信。同理,circCDYL被證實也參與調控心肌梗死后心臟再生和修復,Zhang等[13]研究發現隨著上調circCDYL,細胞增殖指標表達也增加,有趣的是,敲除或下調circCDYL后心臟再生作用被抑制減弱。通過生物信息學預測證實了circCDYL能夠充當miR-4793-5p的海綿并對其負調控。此研究再次證明環狀RNA是一種新的心臟再生調控因子,其穩定性強不易受核酸酶水解影響,在血液中作用持續時間長,為該病的臨床預后和有效的干預治療提供實驗依據。這些研究為心肌梗死調控通路、治療及預后提供全新的思路。綜上所述,circ-010567通過靶向結合miR-141間接調控不同信號通路,最終影響心肌梗死發展進程,這提示circ-010567是治療MI的潛在靶點,對于circ-010567是否還存在其他調節機制如miR-141相關的其他信號通路及新的靶miRNA,有待進一步深入研究。

3.2 心力衰竭 Han等[14]建立心衰組5例及對照組4例,采集外周血通過下一代測序技術進行差異性表達分析發現心衰組外周血共有56個差異表達的環狀RNA,其中29個上調,27個下調,增加樣本量后通過聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction,PCR)分析驗證circ-0097435水平顯著升高。研究還發現在阿霉素治療的心肌細胞中circ-0097435水平明顯上升,而沉默circ-0097435則抑制心肌細胞凋亡。進一步研究證實隨著circ-0097435表達增加,多個miRNA被顯著下調(miR-6799-5P、miR-5000-5P、miR-609、miR-1294),這提示circ-0097435可能通過結合上述miRNA在心力衰竭中發揮作用。然而該研究關于circ-0097435如何間接調控miRNA下游靶基因的表達仍存在局限,需要后續進一步探討。環狀RNA調控心肌細胞凋亡不僅可負向調控也可以正向調控,比如circHIPK3加速心力衰竭的作用已被證實,Deng等[15]發現心肌梗死后的小鼠心臟中circHIPK3水平顯著升高,而下調circHIPK3可減輕心肌梗死后繼發的心肌纖維化及心力衰竭。生物信息學分析表明circHIPK3參與腎上腺素能信號轉導通路,其主要通過miR-17-3p-腺苷環化酶6型(Adenosine cyclase 6,ADCY6)軸增強腎上腺素對心臟的激活作用從而參與心力衰竭的發生。進一步分析發現鈣濃度的增加與circHIPK3的過表達密切相關,下調circHIPK3后鈣濃度也隨之降低,而ADCY6是miR-17-3p的靶基因,其中ADCY6屬于鈣抑制家族的一種亞型,過表達的circHIPK3通過與miR-17-3p結合,上調ADCY6表達水平。而心力衰竭是急性心肌梗死的常見并發癥之一,心力衰竭的發生可增加心肌梗死治療后主要心血管事件的發生率,有研究指出circHIPK3也參與心肌梗死發展進程,我們猜想circHIPK3可能是心肌梗死后合并心力衰竭潛在診斷靶點,但其中的作用機制目前尚未闡明。已有研究[16]發現敲除AGC蛋白激酶家族成員3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶 1(PDK1)后加重心肌梗死誘導的心力衰竭小鼠心血管重塑,其機制可能與PDK1基因敲除加重炎性反應有關,這項研究提示circHIPK3也可能通過調控炎癥因子從而參與心肌梗死后心衰的發生,其具體作用機制仍有待深入研究。

3.3 動脈粥樣硬化 動脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)是心血管疾病的病理基礎,是指由于血管內皮細胞暴露于各種致病因素如氧化低密度脂蛋白(Oxidized low density lipoprotein,ox-LDL),內皮完整性因被破壞釋放各種細胞因子參與AS的同時促使血中過多脂肪在血管壁沉積并不斷刺激發生慢性炎癥反應,不穩定斑塊破裂后引發血栓形成,最終堵塞動脈管腔造成不同程度的狹窄和閉塞。除了肌鈣蛋白、肌酸激酶同工酶等心肌標志物及凝血酶時間等凝血功能指標[17]可用于臨床診斷冠心病,目前已有多種不同環狀RNA被發現可能參與冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的發展[18]。已知ox-LDL是造成動脈粥樣硬化的危害因素之一,一項涉及30例AS患者的研究中發現相較于健康對照組circPTPRA表達量明顯增加,隨后構建的ox-LDL處理血管平滑肌細胞(Vascular smooth muscle cells,VSMCs)檢測circPTPRA表達也明顯上調。通過生物信息學技術檢測結果表明過表達的circPTPRA通過抑制miR-636和上調特異性蛋白1(Specificity protein 1,SP1)信號軸可促進ox-LDL誘導的VSMCs的增殖,抑制細胞凋亡,調節AS進展[19]。此外,Wang等[20]結果表明,在ox-LDL誘導的巨噬細胞中,過表達circ-0050486通過靶向miR-1270及miR-145調節炎癥因子的表達。實驗表明,circ-0050486能夠充當miR-1270及miR-145的海綿作用并抑制其活性,故下調circ-0050486后可對炎癥因子白介素6(Interleukin-6,IL-6)和腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)起到抑制作用,眾所周知,炎癥在AS進展中起著關鍵作用,故推測circ-0050486還可通過影響炎癥發展改善AS進程。也有體內研究發現circ-0001946表達量在冠心病患者外周血中顯著上調,并作為冠心病發病的獨立風險因素[21],circ-0001946也稱為小腦變性相關蛋白1反義轉錄本,其具有miR-7-5p的結合位點,通過海綿化調控作用于miR-7-5p上調多聚adp-核糖聚合酶1 (Poly adp ribose polymerase,PARP1)的表達,這表明circ-0001946-miR-7-5p-PARP1聯合軸對評估冠心病風險嚴重程度具有重要意義。綜上所述,多種試驗表明冠狀動脈粥樣硬化的發生發展可能與circRNA-miRNA-mRNA軸密切相關,再次表明了circRNA是冠心病的前瞻性臨床診斷生物標志物。

3.4 高血壓 高血壓是以動脈血壓持續升高為特征的慢性疾病,是由環境因素和遺傳因素引起的多因素疾病,分為原發性和繼發性高血壓,如今越來越多的人受到高血壓的影響,并以原發性高血壓(Essential hypertension,EH)較常見,但其病因仍未具體明確。有研究表明相較于對照組,EH組和TNF-α處理的人主動脈內皮細胞(Human aortic endothelial cells,HAECs)組、人臍靜脈內皮細胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)組中circ-0105015的表達明顯更高,是EH的獨立危險因素。研究發現在EH組、HAECs組和HUVECs組中miR-637呈低表達,生物信息學軟件預測circ-0105015 與miR-637之間有兩個預測的結合位點,故推測circ-0105015可能通過靶向miR-637參與EH的發生發展。而TNF-α是一種重要的促炎因子,通過促進活性氧的產生誘導氧化應激,導致內皮功能障礙,從炎癥和內皮功能障礙的角度認為circ-0105015-miR-637-TNF-α軸對高血壓的發病機制具有潛在診斷價值[22]。另一項研究根據芯片分析結果顯示circ-0037897在EH組高表達[23],通過進一步技術分析發現circ-0037897可海綿結合并負向調控能參與血管平滑肌細胞(Vascular smooth muscle cell,VSMC)表型轉化的miR-145-5p,后者又通過干擾能影響VSMC重構的Wnt信號通路最終導致EH的形成。除此之外,介導血管緊張素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ,AngⅡ)生成增加的血管緊張素轉換酶(Angiotensin converting enzyme,ACE)也是miR-145-5p的靶基因,而AngⅡ表達增加是高血壓危險因素之一,miR-145-5p通過抑制ACE的表達成為保護因子。這些結果表明circ-0037897為EH的早期診斷、治療和預后評估提供依據。除了高血脂、高血壓的危險因素還包括高血糖、精神緊張等,我們還可以研究探索環狀RNA與其余危險因素發生發展的關系,從而在治療高血壓的方向開辟新的治療思路。

3.5 心肌纖維化 心臟纖維化(Myocardial fibrosis,MF)主要是由于心臟成纖維細胞(Cardiac fibroblasts,CFs)功能被激活,分泌過多的細胞外基質引起心臟組織變性,長期發展最終導致健康心肌逐漸被纖維組織替代發生心臟重構。circRNA-miRNA-mRNA軸通過影響CFs生成機制參與調節心肌纖維化發生。已有研究證實CFs增殖和表型轉化是AMI后心肌纖維化重要的影響因素,CFs受巨噬細胞分泌物刺激轉變為肌成纖維細胞可發生纖維化修復梗死區域,長期持續刺激則導致心肌組織硬化。研究發現,心肌梗死小鼠和經腎素血管緊張素Ⅱ(Renin angiotensin Ⅱ,AngⅡ)處理的CFs中circCELF1的表達量顯著減少,其過表達能夠抑制AngⅡ對CFs的激活,這是由于過表達的circCELF1通過上調脂肪量和肥胖相關蛋白表達降低DKK2 中m6A水平從而抑制miR-636與DKK2的結合,促進DKK2的表達,而DKK2不僅抑制纖維化過程而且能增強血管生成,由此可知circCELF1可通過m6A和miR-636調控DKK2的表達,抑制MF的進展[24]。另外一項研究發現從LAS1L基因轉錄而來的circLAS1L在AMI患者中呈低表達,但過表達的circLAS1L可以與miR-125b吸附結合抑制其活性從而上調靶基因卷曲相關蛋白5(Secretfrizzle related protein 5,SFRP5)的表達,最終抑制CFs的激活、增殖和遷移及促進細胞凋亡[25]。這些發現為進一步了解發病病因提供了基礎,尋找新的治療靶點,提高心肌纖維化的診斷和預后具有重要意義。

4 展 望

由于飲食、生活習慣等影響,心血管疾病表現是多方面的,不同年齡臨床表現也不盡相同,如今在高速發展的時代,越來越多的人長期熬夜超負荷工作,精神壓力大等等導致發病率病死率不斷上升,因此早期診斷心血管疾病對治療和預后具有關鍵作用,傳統診斷不具有特異性,而circRNA具有豐度高、穩定性好、保守性及特異性高等優點。綜上所述目前已有多項研究報道,circRNA可通過作為miRNA的分子海綿,在調控許多心血管疾病諸如心肌梗死、心力衰竭、冠心病等疾病的發生發展過程中具有極其重要的臨床實踐價值,成為心血管疾病診療的新突破。circRNA有望成為新的心血管疾病診斷標志物,能夠早期干預治療,有效改善廣大患者的遠期預后,提高人們的生活質量。

盡管在心血管疾病患者外周血中發現了大量circRNA發生表達變化,但外周血中circRNA含量較少,PCR法因易受到外在摻雜雜質影響使定量檢測準確性存疑。再者,實驗中過程中事實性和可重復性分析方法、樣品收集和處理、設備和程序等情況需要制定公認的circRNA識別和量化方案。除此之外,circRNA的詳細降解機制是怎樣的呢?有研究表明[26],通過一種稱為胞外囊泡的釋放實現了circRNA的清除,也可能涉及其他降解機制,這也提示研究者們circRNA與外分泌體的關系也密不可分。與此同時,circRNA在臨床上的應用也有諸多困難。首先,現階段大多數研究處于動物模型階段,缺乏大規模臨床試驗數據支撐;動物模型外周血中檢測到的潛在生物標志物是否可在人體中檢測到,畢竟目前心血管疾病的發生還包括外界高壓力環境因素導致內分泌系統方面失調,這些影響因素在動物模型中都是無法模擬的。其次,大多數心血管病人多年服用各種藥物,目前沒有相關研究證明這些藥物是否影響潛在生物標志物的產生或轉歸。最后,目前研究circRNA大多聚集在單個心血管疾病,而人群患病常合并多種嚴重并發癥,但關于研究circRNA在多種心血管疾病中的作用尚存在不足,仍需研究者進一步深入研究。作為非編碼RNA家族的一員,目前對其確切分子機制及生理病理調控作用的理解還不夠全面深刻,仍處于初級階段,有待當前醫療界研究者進一步深入探索、挖掘。相信在不久的未來,隨著生物醫學技術的與時跟進以及研究者們的不斷得深入研究,越來越多circRNA的調控機制及生物學功能研究日趨成熟,屆時通過檢測circRNA表達水平即可確定心血管疾病嚴重程度,并根據生物標志物的分子生理病理機制研發出靶向藥物延緩甚至逆轉疾病進展,成為未來心血管疾病的診斷和治療的新靶點。