外源激素和⁶⁰Co-γ輻射對苜蓿愈傷組織分化及內源激素水平的影響

摘要：為探討外源激素和⁶⁰Co-γ輻射對苜蓿愈傷組織分化和內源激素水平變化的影響，本研究以未輻射和輻射苜蓿種子（輻射劑量600 和 800 Gy）植株葉片誘導的愈傷組織和分化苗為試驗材料（標記為CK，G600，G800），將愈傷組織在附加2，4-D與6-BA的MS培養基中進行分化培養，利用高效液相色譜法測定愈傷組織和分化苗中3種內源激素水平的變化。結果表明：MS培養基附加激素濃度為2.00 mg·L^-12，4-D和1.00 mg·L^-16-BA時，CK，G600，G800愈傷組織芽點分化率分別為100%，375%，115%，帶芽點愈傷組織在無激素MS培養基均可分化出根、莖和葉。分化苗CK，G600，G800根、莖和葉的IAA含量均低于愈傷組織，GA₃含量高于愈傷組織，ABA含量在根中最高，IAA/ABA比值在愈傷組織中最高，GA₃/ABA和IAA/GA₃比值在莖中最高。因此，外源和內源激素水平的變化可實現苜蓿愈傷組織芽點產生和再分化，一定劑量輻射處理可促進苜蓿愈傷組織再分化，并影響內源激素水平的變化。

關鍵詞：紫花苜蓿；⁶⁰Co-γ輻射；愈傷組織；植物激素；再分化

中圖分類號：S945.45 文獻標識碼：A 文章編號：1007-0435（2023）07-2162-08

Effects Calli Differentiation of Alfalfa and Endogenous Hormones Levels under Exogenous Hormones and ⁶⁰Co-γ Radiation

REN Zhong-ming， LIU Chang， LI Shan-shan*， LI Bo

（College of Agriculture， Forestry and Life Sciences， Qiqihar University， Heilongjiang Provincial Key Laboratory of Resistance Gene Engineering and Protection of Biodiversity in Cold Areas， Qiqihar， Heilongjiang Provine 161006， China）

Abstract：To discuss effects of ⁶⁰Co-γ radiation on differentiation of alfalfa calli and changes of endogenous level，calli and differentiated seedlings induced from plant leaves of non irradiated and irradiated alfalfa seeds （radiation doses 600 and 800 Gy） were used as experimental materials（marked as CK，G600，G800）. Differentiation culture of calli in MS medium supplemented with 2，4-D and 6-BA and use high-performance liquid chromatography to determine the changes in the levels of three endogenous hormones in calli and differentiated seedlings. The results showed that when the concentration of additional hormones in MS medium is 2.00 mg·L^-1 2，4-D and 1.00 mg·L^-1，the bud differentiation rates of CK，G600，and G800 callus were 100%，375% and 115%，respectively. Calli with bud points can differentiate into roots，stems and leaves in MS medium without hormones. The IAA content in roots，stems and leaves of CK，G600 and G800 differentiated seedlings was lower than that of calli，and the GA₃content of was higher than that of calli. The ABA content was the highest in roots. The IAA/ABA ratio of CK，G600 and G800 was the highest in calli，and the GA₃/ABA and IAA/GA₃ratio was the highest in stems. Therefore，changes in the levels of exogenous and endogenous hormones can achieve buds point generation and redifferentiation of alfalfa calli. A certain dose of radiation treatment can promote the redifferentiation of alfalfa calli and affect the changes in endogenous hormone levels.

Key words：Alfalfa；⁶⁰Co-γ radiation；Callus；Plant hormones；Redifferentiation

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）是豆科草本植物，為世界種植面積最廣且經濟價值最高的豆科牧草之一，其營養價值豐富，粗蛋白含量18%以上，是優質的蛋白質飼料^[1-2]。但苜蓿的優良的種苗較稀少，這使得紫花苜蓿在開發利用的過程中受到了限制，如何提高紫花苜蓿的產量以及優良苜蓿品種選育成為了目前科研工作者的主要研究方向之一。輻射誘變育種是一種較為簡單、能夠穩定變異和有高繁殖效率的育種手段，較傳統育種高效、快速，較轉基因育種更為經濟，是產生新品種的有效手段之一^[3-4]。常采用x射線、γ射線、β射線進行輻射處理，后代變異率高，變異性狀穩定，能夠在較短時間內獲得突變體，尤其是⁶⁰Co-γ射線輻射應用最廣泛，育種效果最為顯著^[5-6]。在輻射苜蓿種子誘變劑量篩選中，不同輻射劑量對苜蓿種子萌發和幼苗生長均有影響，高輻射劑量（1 200～1 500 Gy）對苜蓿種子萌發和幼苗生長的抑制作用高于低輻射劑量（600～900 Gy），且在輻射劑量為600，800和900 Gy時收獲到第二代種子^[7]。輻射誘變在苜蓿突變體篩選研究已取得了一定的成果，張學云等^[8]研究了‘新疆大葉’紫花苜蓿體細胞胚的輻射誘變及耐鹽性，比較 0～100 Gy輻射劑量在氯化鈉脅迫胚性愈傷組織芽分化率，隨著鹽脅迫時間的延長，不同輻射劑量處理的芽分化率呈下降趨勢，苜蓿體細胞胚的適宜輻射強度為 2～8 Gy，得到了耐鹽性高達 1.0% 的突變株；馬海燕^[9]對苜蓿輻射突變體誘導和愈傷組織高效再生的研究，建立了三品種的 17 個高再生能力的基因型，包括‘新疆大葉’苜蓿6個、‘新牧 1號’雜花苜蓿5個和‘新疆野生’黃花苜蓿6個，其試管苗移栽在土壤中生長良好。

在植物組織培養過程中，激素可以調節愈傷組織的誘導及胚性結構的形成，植物基因的表達、生長發育以及植物對某些環境刺激的反應均受其體內多種激素的控制。不同激素配比對紫花苜蓿幼苗4種外植體愈傷組織誘導效果不同，獲得紫花苜蓿葉最佳誘導培養基為MS + 1.0 mg·L^-12，4-D +0.75 mg·L^-16-BA^[10]。有關愈傷組織和分化苗的內源激素含量測定方法常采用高效液相色譜（High performance liquid chromatography，HPLC）和酶聯免疫吸附測定法，郭敏敏等^[11]對棉花胚性愈傷組織發生過程中4種植物內源激素進行了測定和分析，包括吲哚-3-乙酸（IAA）、玉米素（ZT）、赤霉素（GA₃）和脫落酸（ABA）；肖關麗等^[12]對甘蔗愈傷組織分化綠苗內源激素IAA、細胞分裂素（Cytodinin，CTK）、GA₃進行測定和變化規律研究，不同外源激素對愈傷組織內源激素影響存在一定的差異，內源激素IAA和CTK是分化苗產生的重要因子。本研究利用輻射誘變和植物組織培養技術相結合，以輻射苜蓿種子后代篩選獲得的變異植株，對其葉片進行愈傷組織誘導，分析外源激素和輻射對苜蓿愈傷組織再分化和內源激素水平的變化，為利用愈傷組織實現苜蓿輻射育種提供基礎材料和理論研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以‘龍牧806’苜蓿3組愈傷組織（CK，G600，G800）為材料，其中CK為對照，G600和G800為⁶⁰Co-γ射線輻射種子后代變異植株獲得的材料。

⁶⁰Co-γ射線輻射和未輻射的‘龍牧806’苜蓿種子由黑龍江省農業科學院畜牧獸醫分院提供，輻射種子于 2017 年在中國農業科學院原子能利用研究所進行輻射處理。對輻射和未輻射苜蓿種子種植在黑龍江省農業科學院畜牧獸醫分院試驗基地，收獲后獲得二代苜蓿種子。將輻射和對照（Control，CK）的二代苜蓿種子用 35 ℃溫水浸泡 2 h，播種于營養土∶珍珠巖= 2∶1育苗盆中，每盆播 30 粒種子，每個劑量 10 盆，置于溫室內培養 75 d后標記變異植株。其中G600 和G800 分別為輻射劑量 600 和 800 Gy苜蓿變異植株的高株葉片誘導愈傷組織^[13]，CK為未輻射苜蓿植株葉片愈傷組織。

1.2 方法

1.2.1 苜蓿愈傷組織繼代培養 將前期CK，G600和G800植株的葉片誘導的愈傷組織分別切成 0.5 cm³左右小塊，接種在MS+1.0 mg·L^-12，4-D+0.75 mg·L^-1 6-BA+30 g·L^-1蔗糖的固體培養基中，進行愈傷組織繼代培養，其培養條件為光照強度 25 μmol·m^-2·s^-1，光照周期16 h光/ 8 h暗，在溫度 25 ℃光照培養箱中培養。

1.2.2 苜蓿愈傷組織再分化 將CK，G600和G800愈傷組織分別切成 0.5 cm³左右小塊，轉接在愈傷組織芽分化培養基中，進行愈傷組織芽分化培養。愈傷組織芽分化培養基為MS基本培養基，附加不同濃度的2，4-D和6-BA，2，4-D濃度為 1.00和2.00 mg·L^-1，6-BA濃度為 0.25，0.50，0.75和1.00 mg·L^-1，兩種激素進行組合配比，每個組合接種3～4瓶愈傷組織，共接種22～27塊愈傷組織，統計愈傷組織分化的綠色芽點數，計算愈傷組織芽點分化率。愈傷組織在光照培養箱中培養，光照強度為25 μmol·m^-2·s^-1，光照周期為16 h光/8 h暗，培養溫度為 25 ℃。

將CK，G600和G800愈傷組織切成 0.5 cm³左右小塊，接種在篩選的最佳愈傷組織芽分化培養基中，進行愈傷組織芽點分化培養，然后將帶有芽點的愈傷組織小塊轉接在無激素的MS基本培養基，繼續進行愈傷組織莖、葉和根的分化培養。

1.2.3 內源激素含量的測定 流動相、標準溶液的配制與最優檢測波長的確定

流動相配制：用超純水配制1% 乙酸和80%色譜純甲醇，將兩者按照52∶48的比例混合，用 0.22 μm的微孔濾膜過濾后超聲脫氣 30 min，除去流動相混合液中的氣體，密封保存備用;

標準溶液配制：精密稱取IAA，GA₃和ABA標準品各5 mg，分別用流動相溶液溶解，定溶于50 mL的容量瓶中作為母液，分別吸取上述3種標準品溶液0.5，1.0，3.0和5.0 ml配制成混合溶液，定容到10 mL，其濃度分別為5，10，30和50 μg·mL^-1的混合標準溶液;

最優檢測波長確定：將上述溶液配制成系列濃度梯度的混合標準溶液，利用紫外分光光度計進行紫外全波長（200～400 nm）掃描，通過空白和樣品掃描后得光譜圖，確定IAA，GA₃和ABA最優紫外吸收波長。

樣品的制備與分析方法

樣品制備：稱取 1 g愈傷組織（繼代15 d）和分化苗（60 d）的根、莖、葉，加入 5 mL 80% 甲醇在冰浴下研磨成勻漿，4 ℃浸提過夜。10 000 rpm下4 ℃離心 15 min，殘渣用甲醇懸浮，再次離心，合并上清液定至 8 mL，棄殘渣;

上清液過C-18固相萃取柱萃取：50% 甲醇沖洗平衡柱→上樣→去除樣品→去離子水洗柱→80% 甲醇洗脫柱（循環此過程 3次）。將過柱后的樣品轉入5 mL離心管中，真空濃縮至干燥，除去提取液中的甲醇，用流動相液定容至 1.5 mL，經 0.22 μm微孔濾膜過濾后進行HPLC分析;

HPLC分析：利用Agilent Technologies 1 290 Infinity II高效液相色譜儀，采用二極陣列（DA）檢測器檢測波長，色譜柱為ZORBA×RRHD EClipse plus C18，1.8 μm，柱體積 2.1×50 mm，流動相為甲醇∶1% 乙酸水溶液=48∶52，流速0.5 mL·min^-1，進樣量1.0 μL，柱溫30 ℃，檢測波長為確定最優檢測波長。

式中：X為樣品中激素含量（μg·g^-1），A2為樣品峰面積（mAU*S），C為樣品標準液濃度（μg·mL^-1），V為樣品體積（L），A1為標準品峰面積（mAU*S），W為樣品質量（g）。

1.2.4 數據處理與分析 采用Excel 2010 對數據進行整理，SPSS 21.0 分析軟件對試驗數據進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 外源激素和輻射對苜蓿愈傷組織再分化的影響

愈傷組織分化受激素水平和比例的調控，CK，G600和G800愈傷組織綠色芽點分化狀況見圖1和表1。2，4-D與6-BA兩種激素的不同濃度配比影響了3組愈傷組織綠色芽點的分化，在2，4-D濃度為1.00和2.00 mg·L^-1與6-BA濃度為 0.25，0.50，0.75和1.00 mg·L^-1配比均可誘導3組愈傷組織分化出綠色芽點，但在綠色芽點分化率上產生很大的差異，輻射促進愈傷組織綠色芽點的分化，G600和G800愈傷組織綠色芽點分化率顯著高于CK。

在2，4-D和6-BA濃度均為1.00 mg·L^-1時，CK，G600和G800愈傷組織綠色芽點分化率分別為77.78%，237.50%和150.00%，當2，4-D和6-BA濃度分別為2.00和1.00 mg·L^-1時，CK，G600和G800愈傷組織綠色芽點分化率分別為100.00%，375.00% 和115.38%。除G600的2.00 mg·L^-12，4-D和1.00 mg·L^-16-BA組合綠色芽點分化率低于1.00 mg·L^-12，4-D和1.00 mg·L^-16-BA配比外，其他各激素濃度配比的愈傷組織綠色芽點分化率均為2，4-D濃度 2.00 mg·L^-1高于1.00 mg·L^-1。3組愈傷組織綠色芽點分化率大小為G600愈傷組織＞G800愈傷組織＞CK愈傷組織，輻射促進苜蓿愈傷組織綠色芽點的分化。

對愈傷組織芽點分化率進行外源激素和輻射劑量的雙因素方差分析，在考慮雙因素的交互效應時，把激素看成因素A，輻射劑量看成因素B，因素A和因素B對愈傷組織芽點分化率的可重復雙因素方差分析發現，因素A、因素B和交互效應A×B對苜蓿愈傷組織芽點分化率影響極顯著（P＜0.01）（表2）。因素B的F值與臨界值差值大于因素A的F值與臨界值差值，說明因素B對愈傷組織芽點分化率的影響最顯著，其次是因素A，而A和B對苜蓿愈傷組織芽點分化率影響存在交互作用。

苜蓿愈傷組織在不同濃度的2，4-D與6-BA配比下，3組愈傷組織均有大量的綠色芽點分化，且CK、G600和G800愈傷組織在2，4-D 1.00或 2.00 mg·L^-1與6-BA 1.00 mg·L^-1組合的固體培養基上綠色綠色芽點分化率均最高，將3組帶有綠色芽點的愈傷組織小塊轉接在無激素的MS基本培養基中，均可分化出帶有根芽的苜蓿分化苗（圖2），實現愈傷組織的再分化。

2.2 苜蓿愈傷組織和分化苗的內源激素含量及比值的變化

2.2.1 檢測波長和回歸方程確定 將3種激素標準溶液在紫外分光光度計上進行紫外全波長（200～400 nm）掃描，結果表明在206 nm附近三者吸光度均較大，均衡3種激素的檢測效果，最終選擇206 nm作為檢測波長。

依據3種激素標準品系列濃度梯度溶液，按所選擇的色譜條件進樣1.0 μL，獲得不同濃度IAA，GA₃和ABA的峰面積，建立峰面積y與標準溶液濃度x（μg·mL^-1）之間的關系，得到回歸方程和相關系數見表3，各激素的線性相關性均較好。

2.2.2 內源激素含量的變化 在去除外源激素后苜蓿愈傷組織及分化苗各器官中3種內源激素含量的變化見圖3。CK和輻射愈傷組織（G600，G800）的IAA含量均高于分化苗的各器官，GA₃和ABA含量均低于分化苗的各器官，除G600和G800的愈傷組織與分化苗莖的ABA含量差異不顯著外，其他各組分化苗的根、莖和葉的IAA，CA₃和ABA含量與其愈傷組織比較均差異顯著（P＜0.05）。

在3組愈傷組織的3種內源激素含量變化中，除G600愈傷組織的IAA含量略低于其CK外，G600和G800愈傷組織的IAA，GA₃和ABA含量均高于其CK（圖3A-3C）。G600愈傷組織的IAA，GA₃和ABA含量分別為其CK的0.99，1.14和1.07倍，G800愈傷組織的IAA，GA₃和ABA含量分別為其CK的1.28，1.29和1.26倍。IAA含量為G800＞CK＞G600，GA₃和ABA含量為G800＞G600＞CK，一定輻射處理可促進愈傷組織3種內源激素水平的提升。

在3組分化苗各器官的3種內源激素含量變化中，莖和葉的IAA和GA₃含量均高于根，ABA含量均低于根，莖的IAA和GA₃含量最高，根的ABA含量最高（圖3A-3C）。G800分化苗各器官的IAA和GA₃含量高于G600，但與CK比較變化不一，G800分化苗的根、莖和葉的IAA含量分別為其CK的1.82，0.90和0.86倍，GA₃含量分別為其CK的1.05，1.09和0.92倍；除G800分化苗根的ABA含量高于G600外，G600分化苗的莖和葉的ABA含量均低于G800，G800分化苗的根、莖和葉的ABA含量分別為其CK的0.90，0.57和0.84倍。輻射處理對分化苗的根、莖和葉的3種內源激素水平產生不同的影響。

2.2.3 苜蓿愈傷組織和分化苗內源激素比值的變化 去除外源激素后，苜蓿愈傷組織及分化苗各器官的3種內源激素比值不同（圖4）。CK和輻射愈傷組織（G600、G800）的IAA/ABA和IAA/GA₃比值均高于分化苗的各器官，GA₃/ABA比值均低于分化苗的各器官。除CK和G600分化苗莖與葉間的IAA/ABA比值、G600和G800分化苗根、莖與葉間的IAA/GA₃比值外，其他各分化苗的根、莖與葉間激素比值差異均顯著（P＜0.05）。

在3組愈傷組織的內源激素比值變化中，除G600愈傷組織的IAA/ABA低于CK外，G600和G800愈傷組織的IAA/ABA和GA₃/ABA比值均高于其CK（圖4A，4B），IAA/GA₃比值均低于其CK（圖4C）。G600愈傷組織的IAA/ABA，GA₃/ABA和IAA/GA₃比值分別為其CK的0.94，1.09和0.87倍，G800愈傷組織的IAA/ABA，GA₃/ABA和IAA/GA₃比值分別為其CK的1.01，1.03和0.98倍，輻射處理對愈傷組織的3種內源激素比值的產生不同影響。

3組苜蓿分化苗的各器官內源激素比值變化中，CK，G600和G800分化苗莖的IAA/ABA，GA₃/ABA和IAA/GA₃比值均高于其葉和根（圖4A，4B，4C）。苜蓿分化苗的IAA/ABA比值為G800＞CK＞G600，G600分化苗根、莖和葉的IAA/ABA比值分別為其CK的2.00，1.58和1.02倍；除G600分化苗葉的GA₃/ABA比值外，輻射組分化苗根、莖、葉的GA₃/ABA比值均高于其CK，G800分化苗根、莖和葉的GA₃/ABA比值分別為其CK的1.16，1.92和1.10倍；除G800分化苗根的IAA/GA₃比值略高于其CK外，輻射組分化苗各器官的IAA/GA₃比值均低于其CK，G800分化苗根、莖和葉的IAA/GA₃比值分別為其CK的1.73，0.82和0.93倍。一定輻射處理提高分化苗的根、莖和葉的IAA/ABA和GA₃/ABA比值，降低IAA/GA₃比值。

3 討論

3.1 愈傷組織分化與激素關系

植物外植體的脫分化和愈傷組織的再分化受外源激素發育信號的刺激作用，而其作用的效果與外植體及愈傷組織自身的內源激素種類和水平關系密切，外源激素附加及比值只有在一定范圍內才能引起內源激素水平的變化，從而促進細胞分化，外源激素通過內源激素才能發揮作用^[14]。紫花苜蓿愈傷組織的誘導需要外源激素為高濃度的 2，4-D，而體細胞胚的形成則要降低 2，4-D濃度，否則胚性愈傷組織無法形成體細胞胚或再生植株^[15]。本研究發現在2，4-D誘導的苜蓿愈傷組織繼代培養5～6次后可以產生帶有芽點的愈傷組織，愈傷組織的芽自身合成的內源生長素滲入到無激素的MS培養基中，由于內源生長素的作用，進而形成的芽極易再分化出根^[16]。肖關麗等^[17]研究內源激素變化與甘蔗愈傷組織分化綠苗也得到了同樣的結果。

植物的生長過程是植物內源各激素水平間的動態平衡過程，內源激素對植物愈傷組織生長和分化有調控作用^[18-19]。蔡陽光等^[20]研究魔芋愈傷組織和叢生芽的分化，內源細胞分裂素和生長素的總比值應維持在相對適宜的水平，各種激素協同作用促進細胞的生長和分化。在對苜蓿愈傷組織和分化苗的內源激素研究發現，愈傷組織階段的IAA含量最高，是胚性愈傷組織形成和提高體細胞胚胎發生不可缺少的因子，且一定濃度的ABA和GA₃可維持細胞胚性結構不被破壞，并具有一定的促進作用^[21]。從各內源激素比值分析，IAA/ABA和IAA/GA₃均在愈傷組織階段保持在一個相對較高水平，豐富的內源激素是體細胞脫分化并分化形成胚性細胞和保持胚胎發生能力不可缺少的因子，而GA₃/ABA在分化苗，特別是分化苗的莖中水平最高，說明GA₃/ABA的比值對芽體的伸長有重要的影響。

3.2 輻射對愈傷組織分化的影響

植物組織培養技術與輻射誘變相結合可在較短的時間內獲得大量突變體，以加速創造牧草新種質資源^[22-23]。植物材料的不同部位對輻射敏感度不同，生長最旺盛的分生組織最為敏感，而利用愈傷組織直接進行輻射處理會抑制愈傷組織的生長和再分化^[24]。孟祥茹^[25]對⁶⁰Co-γ射線對人參愈傷組織的輻射效應的研究發現隨著輻射劑量的增加，延長了人參愈傷組織恢復培養的時間，減緩愈傷組織的增值速率。張學云等^[21]研究‘新疆大葉’紫花苜蓿胚性愈傷組織芽分化率的影響，比較0～100 Gy輻射劑量分別在0%～1.0% 鹽濃度脅迫1～3個月下的胚性愈傷組織芽分化率，發現隨著鹽處理時間的延長，不同輻射劑量處理的芽分化率均呈現下降的趨勢。本研究結果的芽分化率有所不同，可能與輻射處理的對象有關，多數研究者利用愈傷組織直接進行輻射處理，而本研究對苜蓿種子進行輻射，對變異植株葉片進行愈傷組織誘導，種子的耐輻射能力更強，可耐輻射劑量更高，增加了對后代的選擇性。

3.3 激素和輻射互作與對愈傷組織分化

外源激素水平變化會影響愈傷組織芽點產生，同時輻誘變處理可導致IAA，GA₃和ABA等內源激素水平的改變，進而影響愈傷組織再分化。趙云龍等^[26]研究⁶⁰Co-γ射線輻射對大白杜鵑的矮化效應，20～60 Gy輻射處理后IAA和GA₃、玉米素核苷（ZR）含量降低，ABA含量增加，較高水平的ABA含量有利于植株的矮化。本研究發現⁶⁰Co-γ輻射導致愈傷組織IAA，GA₃和ABA含量增加，使愈傷組織階段的內源激素水平維持在一定范圍內，盡而影響了3種內源激素的比值，促使愈傷組織綠色芽點分化和根芽再分化；在愈傷組織的分化苗中，一定的輻射劑量可以提高IAA，GA₃和ABA水平，但600和800 Gy輻射劑量的分化苗各器官的3種激素水平變化存在差異，影響了IAA/ABA，GA₃/ABA和IAA/GA₃比值，說明在不同內源激素和輻射劑量互作下影響了愈傷組織的再分化。

4 結論

CK，G600和G800苜蓿愈傷組織在MS+2.00 mg·L^-12，4-D+6-BA 1.00 mg·L^-1可實現綠色芽點分化，輻射促進苜蓿愈傷組織綠色芽點分化；愈傷組織在MS培養基上不添加外源激素可直接分化成苗；愈傷組織中IAA含量、IAA/ABA和IAA/GA₃比值最高，GA₃含量和GA₃/ABA在莖中最高，ABA含量在根中最高。輻射處理影響了愈傷組織和分化苗3種激素水平和比值變化。內源激素IAA，GA₃和ABA是分化苗產生的重要因子，通過外源激素和內源激素誘導可實現愈傷組織的綠色芽點產生和再分化過程。

參考文獻

[1] 范燕闖，王俊鋒，高嵩，等.芽菜收獲對松嫩鹽堿化紫花苜蓿草地綜合收益的影響[J].草地學報，2022，30（9）：2460-2468

[2] 趙嬌陽，李小艷，朱慧森，等.偏關苜蓿種子萌發及植株再生體系優化[J].草地學報，2020，28（4）：947-955

[3] 王萌，張康成，范希峰，等. ⁶⁰Co-γ射線對青綠苔草種子萌發及幼苗生長的影響[J]. 草地學報，2022，30（12）：3279-3283

[4] PATADE V Y，SUPRASANNA P，BAPAT V A.Gamma irradiation of embryogenic callus cultures and in vitro selection for salt tolerance in sugarcane （Saccharum officinarum L.）[J].Agricultural Sciences in China，2008，7（9）：1147-1152

[5] 孫小富，王雷挺，趙麗麗，等.牧草輻射誘變育種的研究進展[J].貴州農業科學，2019，47（11）：18-26

[6] ARIRAMAN M，GNANAMURTHY S，DHANAVEL D，et al. Mutagenic effection seed germination，seedling growth and seedling survival of Pigeonpea（Cajanuscajan L.Millsp）[J].Internation Letters of Natural Sciences，2014，21（16）：41-49

[7] 李波，劉暢，李紅，等. ⁶⁰Co-γ輻射苜蓿種子的變異植株葉片愈傷組織誘導及其誘變效應分析[J]. 干旱地區農業研究，2021，39（2）：164-171

[8] 張學云，楊麗，范金，等. 紫花苜蓿體細胞胚的輻射誘變及耐鹽性篩選[J]. 中國草地學報，2015，37（3）：31-36

[9] 馬海燕. 苜蓿輻射突變體誘導和愈傷組織高效再生的研究[D]. 烏魯木齊：新疆農業大學，2005：11-32

[10]王立爽，孟令媛，王沛鑾，等.不同激素配比對紫花苜蓿幼苗4種外植體愈傷組織誘導效果的影響[J].高師理科學刊，2020，40（1）：51-53，76

[11]郭敏敏，王清連，胡根海. 利用高效液相色譜法分離和測定棉花組織培養過程中4種內源激素[J]. 生物技術通訊，2009，20（2）：213-216

[12]肖關麗，楊清輝，李富生，楊生超. 甘蔗愈傷組織分化綠苗內源激素變化規律研究[J]. 西南農業大學學報，2002，24（4）：337-339

[13]李波，劉暢，李紅，等.⁶⁰Co-γ輻射苜蓿種子的變異植株葉片愈傷組織誘導及其誘變效應分析[J]. 干旱地區農業研究，2021，39（2）：164-171

[14]張媛媛，馬暉玲，俞玲，等. 草地早熟禾愈傷組織誘導和分化中內源激素水平分析[J]. 甘肅農業大學學報，2013，48（2）：74-79，85

[15]王曉春，師尚禮，梁慧敏，等.2，4-和6-BA組合配比對金達苜蓿愈傷組織誘導與分化的影響[J]. 草地學報，2010，18（2）：219-222

[16]馬暉玲. 植物激素作用時間對煙草外植體器官分化的影響[J]. 甘肅農業大學學報，2001（3）：333-335，340

[17]肖關麗，楊清輝，李富生，等. 內源激素變化與甘蔗愈傷組織分化綠苗關系研究[J]. 種子，2003，127（1）：13-14

[18]馬生健，曾富華，余炳生，等. 高羊茅愈傷組織的誘導與內源激素含量研究[J]. 湛江師范學院學報，2002，23（6）：57-60

[19]張慧君，陳勁楓. 植物組織培養生理機制的研究進展[J]. 江蘇農業科學，2015，43（3）：33-35

[20]蔡陽光，段龍飛，覃劍鋒，等. 魔芋不同生理狀態的愈傷組織和叢生芽內源激素及抗氧化酶研究[J]. 西南大學學報（自然科學版），2022，44（9）：61-67

[21]杜文平，宋軍，徐利遠，等. ⁶⁰Co-γ射線對小麥幼胚離體后的誘變效應[J]. 西南農業學報，2015，28（6）：2355-2359

[22]潘林，鄔婷婷，李波. 輻射苜蓿愈傷組織對高溫脅迫的生理響應分析[J]. 黑龍江畜牧獸醫，2021，（3）：103-108，113，161

[23]孫小富，王雷挺，趙麗麗，等. 牧草輻射誘變育種的研究進展[J]. 貴州農業科學，2019，47（11）：18-26

[24]郭少玲，高健，徐有明，等. ⁶⁰Co-γ輻射對毛竹種子萌發過程中內源激素含量的影響[J]. 中國農學通報，2013，29（25）：26-31

[25]孟祥茹. ⁶⁰Co-γ射線對人參愈傷組織的輻射效應研究[D]. 長春：吉林農業大學，2018：9-13

[26]趙云龍，李朝嬋，陳訓. ⁶⁰Co-γ射線輻射對大白杜鵑的矮化效應[J]. 北方園藝，2012（19）：48-50

（責任編輯 彭露茜）