γ-干擾素釋放試驗與結(jié)核分枝桿菌DNA熒光檢測技術(shù)聯(lián)合診斷肺結(jié)核的價值

【摘要】目的 探討γ-干擾素釋放試驗與結(jié)核分枝桿菌-DNA熒光檢測（PCR）技術(shù)聯(lián)合診斷肺結(jié)核的價值，為臨床診斷提供參考。方法 選取2021年1月至12月廣西醫(yī)科大學附屬武鳴醫(yī)院收治的123例肺結(jié)核患者為肺結(jié)核組，選取同期于廣西醫(yī)科大學附屬武鳴醫(yī)院進行體檢的100例健康體檢者為健康組進行回顧性分析。所有研究對象進行γ-干擾素釋放試驗及結(jié)核分枝桿菌-DNA PCR。以結(jié)核分枝桿菌涂片培養(yǎng)為金標準。比較不同診斷方式的結(jié)果及診斷效能，比較兩組研究對象的常規(guī)生化檢測指標。結(jié)果 γ-干擾素釋放試驗診斷為陽性101例，陰性122例。結(jié)核分枝桿菌-DNA-PCR診斷為陽性97例，陰性126例。γ-干擾素釋放試驗、結(jié)核分枝桿菌-DNA-PCR聯(lián)合診斷為陽性117例，陰性106例。γ-干擾素釋放試驗、結(jié)核分枝桿菌-DNA-PCR聯(lián)合診斷的準確度高于γ-干擾素釋放試驗、結(jié)核分枝桿菌-DNA-PCR單獨檢測（Plt;0.05）。兩組研究對象腺苷脫氫酶水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05）；肺結(jié)核組研究對象紅細胞沉降率高于健康組，淋巴細胞計數(shù)低于健康組（Plt;0.05）。結(jié)論 在肺結(jié)核的臨床診斷中，γ-干擾素釋放試驗聯(lián)合結(jié)核分枝桿菌-DNA PCR具有較高的診斷效能，能夠為臨床診斷提供依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】γ-干擾素釋放試驗；肺結(jié)核；結(jié)核分枝桿菌；熒光檢測

【中圖分類號】R521 【文獻標識碼】A 【文章編號】2096-2665.2023.11.0134.04

DOI：10.3969/j.issn.2096-2665.2023.11.045

肺結(jié)核是由結(jié)核分枝桿菌感染引起的呼吸道傳染疾病，主要病灶位于肺組織、氣管、支氣管及胸膜，表現(xiàn)為咳嗽、咳痰等呼吸道癥狀。由于肺結(jié)核晚期病死率較高，所以應(yīng)重視肺結(jié)核的早期診斷及治療，預(yù)防病情遷延發(fā)展，降低重癥發(fā)生率，改善患者預(yù)后情況[1]。目前臨床診斷肺結(jié)核的金標準是結(jié)核分枝桿菌涂片培養(yǎng)，能夠了解病原菌感染情況及肺內(nèi)組織狀態(tài)，臨床應(yīng)用較廣，診斷準確率較高[2]。臨床經(jīng)驗顯示，涂片培養(yǎng)周期較長，對于肺結(jié)核的診斷缺乏時效性[3]。γ-干擾素釋放試驗也是檢測結(jié)核分枝桿菌的一種途徑，能夠通過特異性抗原刺激，檢測T淋巴細胞釋放的γ-干擾素水平，具有良好的特異性，但是結(jié)果僅提示機體感染過結(jié)核分枝桿菌，并不代表處于活動期，因此診斷結(jié)果并不全面[4]。結(jié)核分枝桿菌-DNA熒光檢測（DNA-PCR）則是通過檢測結(jié)核分枝桿菌的DNA定量，判斷是否有感染常作為臨床對本病的輔助診斷[5]。本研究探討γ-干擾素釋放試驗聯(lián)合結(jié)核分枝桿菌-DNA-PCR的診斷效能，為臨床及早診斷肺結(jié)核提供參考，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2021年1月至12月廣西醫(yī)科大學附屬武鳴醫(yī)院收治的123例肺結(jié)核患者為肺結(jié)核組，選取同期于廣西醫(yī)科大學附屬武鳴醫(yī)院進行體檢的100例健康體檢者為健康組進行回顧性分析。肺結(jié)核組患者中男性101例，女性22例；年齡50～65歲，平均年齡（57.54±2.14）歲。健康組研究對象中男性81例，女性19例；年齡50～62歲，平均年齡（57.36±2.20）歲。兩組研究對象一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05），組間具有可比性。本研究經(jīng)廣西醫(yī)科大學附屬武鳴醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。納入標準：①患者符合《肺結(jié)核基層診療指南（實踐版·2018）》[6]中肺結(jié)核的診斷標準，且經(jīng)影像學檢查顯示明顯滲出性浸潤病灶；②患者結(jié)核分枝桿菌涂片培養(yǎng)陽性；③無自身免疫系統(tǒng)疾病者。排除標準：①合并嚴重肝、腎等重要臟器功能障礙者；②哺乳期或妊娠期者。

1.2 研究方法 對所有研究對象均進行結(jié)核分枝桿菌涂片培養(yǎng)、γ-干擾素釋放試驗及結(jié)核分枝桿菌-DNA PCR。以結(jié)核分枝桿菌涂片培養(yǎng)為金標準[7]。結(jié)核分枝桿菌涂片培養(yǎng)：采集研究對象清晨第一口痰液樣本，取樣前囑研究對象清水漱口，用力咳出深部痰液于無菌管中，連續(xù)收集3 d的痰液樣本分別保存于不同的無菌管中，以羅氏培養(yǎng)法進行結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)及涂片找抗酸桿菌。γ-干擾素釋放試驗：采集研究對象晨起空腹肘靜脈血5 mL，使用枸櫞酸鈉抗凝劑（四川南格爾生物科技有限公司，國藥準字H20058914，規(guī)格：160 mL∶6.4 g）抗凝后進行抗原刺激及γ-干擾素濃度測定，操作過程嚴格按照說明書進行γ-干擾素釋放試驗。結(jié)核分枝桿菌-DNA PCR：采集痰液樣本，取5 mL樣本與5 mL的4%NaOH混勻，室溫下靜置30 min，提取1 mL樣本離心，棄上清，加入1 mL生理鹽水，采用離心機（德國WIGGENS，型號：BIOCEN 22R）進行多次重復(fù)“離心-丟棄上清液-加入緩沖液清洗-加入緩沖液打散混勻沉淀物”，加入DNA提取液50 μL，然后以結(jié)核桿菌檢測試劑盒進行細菌培養(yǎng)，進行結(jié)核分枝桿菌-DNA-PCR。震蕩混勻5～10 s，瞬時離心數(shù)秒，100 ℃恒溫處理10 min，離心（10 000 r/min，5 min）后備用，然后將PCR反應(yīng)液40 μL與Taq酶液3 μL充分混勻，然后按43 μL管分裝至0.2 mL離心管中備用，向0.2離心管內(nèi)加入處理后的樣品，質(zhì)控品上清液，離心后放入儀器樣品漕，設(shè)置循環(huán)條件：93℃ 2 min、93℃ 45 s、55 ℃ 60 s，10個循環(huán)；93 ℃ 30 s、55 ℃ 45 s，30個循環(huán)，PCR反向雜交法菌種鑒定試劑由深圳亞能生物技術(shù)有限公司提供。

1.3 觀察指標 ①分析γ-干擾素釋放試驗診斷肺結(jié)核結(jié)果。②分析結(jié)核分枝桿菌-DNA-PCR診斷肺結(jié)核結(jié)果。③分析γ-干擾素釋放試驗、結(jié)核分枝桿菌-DNA-PCR聯(lián)合診斷肺結(jié)核結(jié)果。④比較不同檢查方式診斷肺結(jié)核的效能。以其中一項檢測陽性為聯(lián)合檢測陽性。⑤比較兩組研究對象的常規(guī)生化檢測指標。采集兩組研究對象清晨空腹肘靜脈血5 mL，采用離心機（湖南恒諾儀器設(shè)備有限公司，型號：4-20R）以1 500 r/min離心7 min，分離血清，采用全自動生化分析儀（美國雅培，型號：C16000）測定腺苷脫氫酶、紅細胞沉降率及淋巴細胞計數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據(jù)。計數(shù)資料以[例（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗；計量資料以（x）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 γ-干擾素釋放試驗診斷肺結(jié)核結(jié)果 γ-干擾素釋放試驗診斷為陽性101例，陰性122例，見表1。

2.2 結(jié)核分枝桿菌-DNA-PCR診斷肺結(jié)核結(jié)果 結(jié)核分枝桿菌-DNA-PCR診斷為陽性97例，陰性126例，見表2。

2.3 γ-干擾素釋放試驗、結(jié)核分枝桿菌-DNA-PCR聯(lián)合診斷肺結(jié)核結(jié)果 γ-干擾素釋放試驗、結(jié)核分枝桿菌-DNA-PCR聯(lián)合診斷為陽性117例，陰性106例，見表3。

2.4 不同檢查方式診斷肺結(jié)核的效能比較 γ-干擾素釋放試驗、結(jié)核分枝桿菌-DNA-PCR聯(lián)合診斷的診斷準確度高于γ-干擾素釋放試驗、結(jié)核分枝桿菌-DNA-PCR單獨檢測，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=11.254，Plt;0.05），見表4。

2.5 兩組研究對象常規(guī)生化檢測指標水平比較 兩組研究對象腺苷脫氫酶水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05），肺結(jié)核組研究對象紅細胞沉降率高于健康組，淋巴細胞計數(shù)低于健康組，差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05），見表5。

3 討論

肺結(jié)核是結(jié)核分枝桿菌感染的主要類型，對肺內(nèi)組織細胞的破壞性較強，并且具有較強的傳染性，能夠通過患者的痰液、飛沫等進行擴散傳播，隨著疾病的進展，肺內(nèi)形成空洞，結(jié)核分枝桿菌也可能通過血液傳入其他臟器，從而導(dǎo)致全身性感染，因此早期診斷及治療意義重大。早期肺結(jié)核主要是滲出性病變，機體局部血供尚良好，能夠使治療藥物進入病灶組織，有效控制感染水平，縮短傳染周期。痰結(jié)核桿菌涂片培養(yǎng)和影像學檢查是臨床常見的肺結(jié)核診斷方式，其中痰結(jié)核桿菌培養(yǎng)在定量培養(yǎng)之前將痰液標本進行液化和勻化，若最終結(jié)果顯示有結(jié)核分枝桿菌則可診斷為肺結(jié)核，同時也能夠進行藥敏試驗，幫助臨床選擇高敏感的抗結(jié)核藥物，有助于保證后續(xù)治療的療效，但是此診斷方法周期較長，一般需要6～8周才能得出結(jié)果，因此在臨床應(yīng)用中具有一定的局限性[8]。

近年來，有關(guān)肺結(jié)核的免疫學診斷研究較多，其中γ-干擾素釋放試驗具有較高的關(guān)注度，其檢驗原理是肺結(jié)核患者體內(nèi)的T細胞經(jīng)結(jié)核桿菌抗原致敏或產(chǎn)生免疫活性，在體外受到相同抗原的刺激后可特異性產(chǎn)生大量的γ-干擾素，因此可通過檢測γ-干擾素水平評估肺結(jié)核的感染情況[9]。然而臨床經(jīng)驗提示，γ-干擾素釋放試驗結(jié)果顯示為陽性也不能確定患者的病情發(fā)展情況，因為其結(jié)果只反映機體具有結(jié)核桿菌感染史（T細胞具有免疫效應(yīng)的記憶），并不能說明檢測當下的時間患者處于感染階段，不能作為單獨或決定性的診斷依據(jù)，需要結(jié)合患者臨床癥狀或其他相關(guān)檢查結(jié)果[10]。肺結(jié)核包括顯性感染及潛伏性感染，多項研究認為γ-干擾素釋放試驗?zāi)軌蚺袛嗍欠窀腥窘Y(jié)核桿菌，但無法確定是否處于活動性感染階段，因此診斷價值有限。DNA-PCR是分子水平的檢測技術(shù)，在基因分離克隆和核酸序列分析等基礎(chǔ)研究中應(yīng)用廣泛，此外也應(yīng)用于多種病原菌感染性疾病的診斷鑒別中[11]。DNA-PCR技術(shù)是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，原理是通過熒光染料或熒光標記的探針，對樣本的聚糖擴增產(chǎn)物進行標記跟蹤，測定樣本中的DNA，最后通過反饋的結(jié)果判斷臨床樣本中是否存在某種病原體的感染情況，在臨床上常作為疾病的輔助檢查[12]。在具體操作上，DNA-PCR由高溫變性、低溫退火及適溫延伸等反應(yīng)形成1個周期，循環(huán)進行，使目標DNA迅速擴增，具有特異性強、敏感度高、操作簡便、省時等特點。在肺結(jié)核的診斷中，通過檢測樣本中是否含有結(jié)核分枝桿菌的DNA，診斷是否為肺結(jié)核。

在本研究結(jié)果中顯示，γ-干擾素釋放試驗診斷為陽性101例，陰性122例。結(jié)核分枝桿菌-DNA-PCR診斷為陽性97例，陰性126例。γ-干擾素釋放試驗、結(jié)核分枝桿菌-DNA-PCR聯(lián)合診斷為陽性117例，陰性106例。γ-干擾素釋放試驗聯(lián)合結(jié)核分枝桿菌-DNA-PCR診斷肺結(jié)核的準確度高于γ-干擾素釋放試驗、結(jié)核分枝桿菌-DNA-PCR，這提示聯(lián)合診斷具有較高的臨床價值。目前對于γ-干擾素釋放試驗的特異性研究上，低危人群的篩查占大部分，若是在肺結(jié)核感染較普遍的人群中應(yīng)用，則特異性會隨之降低[13]。

在肝臟疾病、結(jié)核病中，腺苷脫氫酶水平表現(xiàn)為異常升高，而在免疫缺陷性疾病中則表現(xiàn)為下降趨勢。在本研究結(jié)果中，兩組研究對象腺苷脫氫酶水平比較，差異無統(tǒng)計學意義，這提示此指標在臨床診斷中的價值尚不明確。紅細胞沉降率、淋巴細胞計數(shù)則是感染、免疫相關(guān)疾病中較常用的監(jiān)測指標，本研究結(jié)果顯示，肺結(jié)核組研究對象紅細胞沉降率高于健康組，淋巴細胞計數(shù)低于健康組，這提示在肺結(jié)核患者機體的血液、免疫系統(tǒng)存在異常情況。結(jié)核分枝桿菌引發(fā)的肺內(nèi)感染主要引起細胞免疫，該過程主要由T淋巴細胞開展免疫效應(yīng)，因此對免疫相關(guān)指標檢測具有一定的臨床意義。紅細胞沉降率是肺結(jié)核患者常見的檢查指標，該指標增快提示正處于活動性肺結(jié)核階段，但特異度較差，因此作為臨床診斷或疾病監(jiān)測的輔助性指標。

綜上所述，在肺結(jié)核的診斷中，采用γ-干擾素釋放試驗、結(jié)核分枝桿菌-DNA-PCR聯(lián)合診斷具有較高的應(yīng)用價值，可結(jié)合患者病情及生化指標進行綜合診斷。

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