益智仁聯合參芪四物湯加味對糖尿病視網膜病變大鼠視網膜細胞增殖抑制作用的實驗研究

【摘要】目的 觀察益智仁聯合參芪四物湯加味對糖尿病視網膜病變（DR）大鼠視網膜細胞增殖抑制作用的影響。方法 取SPF級SD雄性大鼠80只，依據隨機數字表法分為對照組、模型組、干預一組及干預二組，每組20只。對照組大鼠給予基礎飼料喂養，模型組、干預一組及干預二組大鼠均予建立DR模型。建模成功后對照組、模型組大鼠給予等體積生理鹽水灌胃，干預一組大鼠給予參芪四物湯加味灌胃、干預二組大鼠給予益智仁聯合參芪四物湯加味灌胃，持續干預4周。比較4組大鼠雙眼視網膜血流相關指標、細胞凋亡率及血管內皮生長因子（VEGF）水平。結果 模型組、干預一組、干預二組大鼠收縮期血流速度峰值、舒張期血流速度峰值低于對照組，阻力指數高于對照組（Plt;0.05）；干預一組、干預二組大鼠收縮期血流速度峰值、舒張期血流速度峰值高于模型組，阻力指數低于模型組（Plt;0.05）；干預二組大鼠收縮期血流速度峰值、舒張期血流速度峰值高于干預一組，阻力指數低于干預一組（Plt;0.05）；模型組、干預一組、干預二組大鼠的視網膜組織細胞凋亡率高于對照組，干預一組、干預二組低于模型組，干預二組低于干預一組（Plt;0.05）；模型組、干預一組、干預二組大鼠的VEGF表達水平高于對照組，干預一組、干預二組低于模型組，干預二組低于干預一組（Plt;0.05）。結論 益智仁聯合參芪四物湯加味用于治療DR大鼠有良好的治療作用。

【關鍵詞】糖尿病視網膜病變；益智仁；參芪四物湯；細胞增殖；細胞凋亡

【中圖分類號】R276.7 【文獻標識碼】A 【文章編號】2096-2665.2023.11.0137.04

DOI：10.3969/j.issn.2096-2665.2023.11.046

糖尿病視網膜病變（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病微血管疾病的并發癥之一，因其發病機制尚未明確，臨床治療效果欠佳，因此尋找有效的治療方法，對DR患者的身體健康具有重要的意義[1]。有研究認為，DR發生發展過程的核心機制為氣陰兩虛、血行瘀滯，導致患者氣血不能上聚于目，出現目視不清、眼睛干澀等癥狀[2]。參芪四物湯具有益氣補血、活血化瘀之功效[3]。益智仁具有溫補腎氣之功效，能夠降血糖及尿中微量白蛋白的排泄量，進而對腎臟起保護作用[4]。但臨床關于益智仁聯合參芪四物湯加味治療DR機制的研究較少，本研究主要觀察益智仁聯合參芪四物湯加味對DR模型大鼠的眼部血液流變性及血流動力學的影響，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 取SPF級SD雄性大鼠80只[北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號：SCXK（京）2012-0001]，飼養于溫度為20～25 ℃、濕度為40%～70%的動物室，確保大鼠的生存環境干燥，飼養期間大鼠可以自由飲水，日夜交替12 h，適宜喂食1周。本實驗經海南醫學院中醫學院動物實驗倫理審查批準。

1.2 主要實驗試劑 高糖高脂飼料（北京博泰宏達生物技術有限公司）、鏈脲佐菌素（美國Sigma公司）、磷酸鹽緩沖液（PBS）（上海研生實業有限公司）、蘇木精伊紅（HE）試劑盒（碧云天生物技術研究所）、二甲苯（北京化學試劑公司）、蛋白酶K（上海源葉生物）、4%多聚甲醛組織固定液[康迪斯化工（湖北）有限公司]、3%H2O2-甲醇封閉液（Bioss公司）、原位末端標記法（TUNEL）試劑盒、Coveter-POD液（瑞士Roche公司）、蛋白裂解液（RIPA裂解液）（北京諾博萊德科技有限公司）、蛋白定量試劑盒（碧云天生物技術研究所）、山羊抗兔IgG二抗（北京中杉金橋生物）。

1.3 實驗儀器 多普勒激光血流儀（Moor公司，型號：VMS-LDF1型）、光學顯微鏡（日本Olympus公司，型號：OLYMPUS-BH2）、脫色搖床（海門市其林貝爾儀器制造有限公司，型號：TS-2000A型）、電泳儀（thermo公司，型號：EC250-90型）、低溫高速離心機（長沙湘智離心機儀器有限公司，型號：TGL16型）、凝膠成像系統（thermo公司，型號：CA91786U.S.A UVP GDS-8000System）、酶標儀（深圳雷杜生命科學股份有限公司，型號：RT-6100型）。

1.4 實驗組方 益智仁15 g。參芪四物湯基本組方：黨參15 g、黃芪30 g、當歸15 g、熟地20 g、川芎10 g、白芍15 g；加味：密蒙花10 g，谷精草10 g。均購自于海南省海南醫學院附屬醫院藥劑科。

1.5 動物模型的建立、分組及給藥方法 80只SD大鼠依據隨機數字法將其分為對照組、模型組、干預一組及干預二組，每組20只。對照組大鼠予以基礎飼料喂養，模型組和干預一組、干預二組大鼠給予高糖高脂飼料喂養8周。8周后，對照組大鼠注射等體積生理鹽水，模型組和干預組大鼠經腹腔注射40 mg/kg的鏈脲佐菌素建立DR大鼠模型。于3 d后取大鼠尾部靜脈血檢測其血糖，糖尿病大鼠造模成功標準為[5]：血糖≥16.7 mmol /L，尿糖3+以上。糖尿病大鼠造模成功后繼續喂養4周，對照組及模型組大鼠給予等體積生理鹽水灌胃；干預一組大鼠給予參芪四物湯加味灌胃，根據大鼠與人體表面積轉換公式，參芪四物湯加味劑量為9.2 g/kg，藥體積10 mL/kg；干預二組大鼠給予益智仁聯合參芪四物湯加味灌胃，益智仁聯合參芪四物湯加味為9.2 g/kg，各組1次/d。4周后進行眼底血管熒光造影檢查。4 周后做眼底血管造影，DR大鼠造模成功標準[6]：血管迂曲擴張、背景熒光增強和新生血管熒光滲漏等癥狀。

1.6 大鼠眼部血流測定 采用激光血流儀檢測各組大鼠視網膜血流，包括收縮期血流速度峰值、舒張期血流速度峰值及阻力指數，阻力指數=（收縮期血流速度峰值-舒張期血流速度峰值）/收縮期血流速度峰值。

1.7 實驗動物標本收集 實驗4周，在最后一次測量大鼠眼部血流并加以記錄后，收集大鼠視網膜。采用水合氯醛腹腔麻醉，大鼠全眼球切除，并取全視網膜。用無菌磷酸緩沖鹽清洗，4%甲醛固定24 h后，常規脫水透明，石蠟包裹，切片4 μm，在-80 ℃下貯存，進行細胞凋亡實驗檢測。另外，在80 ℃下，取一部分視網膜組織進行免疫印跡分析。

1.8 細胞凋亡檢測 取大鼠視網膜組織切片，用二甲基苯浸膏脫蠟，用乙醇進行梯度水化，HE染色。PBS漂洗3次，每次5 min。加入2 μg/mL蛋白酶K于37 ℃條件下進行30 min的孵育，PBS沖洗3次，每次5 min。添加2 μg/mL的蛋白酶K后在37 ℃育溫箱中靜置30 min，再次PBS漂洗3次，每次5 min。加入4%多聚甲醛組織固定液后在37 ℃育溫箱中靜置30 min，再次PBS漂洗3次。加入3%H2O2-甲醇封閉液在室溫下封閉30 min，再次PBS漂洗3次。取TUNEL試劑盒，配置結合緩沖液，加蓋玻片，37 ℃下孵育1 h，PBS漂洗3次。在DAB室溫避光顯色10 min后，用蒸餾水沖洗，封片。400倍光學顯微鏡下，選取7種不同的視野，各區域對200個細胞進行計數，并測定其細胞凋亡率。

1.9 蛋白質印跡檢測 將大鼠視網膜組織切片，加入預冷的細胞組織快速裂解液（RIPA）中勻漿，離心取上清液，蛋白質定量檢測法測蛋白質濃度，取20 μg蛋白變性上樣，聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳后轉至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，加入一抗孵育過夜，加辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔二抗IgG，搖床孵育120 min，TBST洗膜，顯影后用Image J軟件分析血管內皮生長因子（VEGF）蛋白的相對表達水平并與以肌動蛋白（β-actin）為內參照進行比較。

1.10 統計學分析 采用SPSS 21.0統計學軟件進行數據分析。計量資料以（x）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較行LSD-t檢驗。以Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠雙眼血流相關指標變化情況比較 模型組、干預一組、干預二組大鼠的收縮期血流速度峰值、舒張期血流速度峰值低于對照組，阻力指數高于對照組，差異有統計學意義（Plt;0.05）；干預一組、干預二組大鼠的收縮期血流速度峰值、舒張期血流速度峰值高于模型組，阻力指數低于模型組，差異有統計學意義（Plt;0.05）；干預二組大鼠收縮期血流速度峰值、舒張期血流速度峰值高于干預一組，阻力指數低于干預一組，差異有統計學意義（Plt;0.05），見表1。

2.2 各組大鼠視網膜組織細胞凋亡情況比較 模型組、干預一組、干預二組大鼠的視網膜細胞凋亡率高于對照組，干預一組、干預二組低于模型組，干預二組低于干預一組，差異有統計學意義（Plt;0.05），見表2、圖1。

2.3 各組大鼠VEGF表達水平比較 模型組、干預一組、干預二組大鼠的VEGF表達水平高于對照組，干預一組、干預二組低于模型組，干預二組低于干預一組，差異有統計學意義（Plt;0.05），見表3、圖2。

3 討論

DR是一種慢性、進展性視力損害性疾病，由視網膜微循環功能紊亂引起[7]。目前，DR的發病機制尚未完全清楚，但相關研究表明，視網膜中央動脈的收縮期血流速度和舒張期血流速度在DR早期階段就有明顯變化，隨后視網膜中央動脈血流速度減緩，對眼部血流狀態造成一定影響[8-9]。另外，細胞凋亡率升高及存活率降低是DR發生發展的主要特征之一，因此，減少視網膜組織細胞凋亡，有助于保護視網膜功能[10]。

本研究結果顯示，DR大鼠給予益智仁聯合參芪四物湯加味灌胃治療后，眼部血流相關指標均優于模型組，且干預二組優于干預一組。劉敏等[11]認為，DR的根本原因在于氣血不足，無法將精氣運至雙眼，而中氣不足，則無法控制血液，導致血管堵塞。這提示DR與氣虛血少、精液耗損有關。益智仁能夠溫補腎氣，對尿量增多、尿頻及蛋白尿等癥狀有良好療效[12-13]。參芪四物湯中黨參、黃芪益氣調中，當歸、熟地、川芎、白芍益氣養血、行氣活血，密蒙花、谷精草清熱明目退翳。上述諸藥合用，共奏益氣活血，疏通經絡，滋陰生精，補腎益髓，通竅明目之功效。通過影響眼部的血液循環，改善毛細血管阻塞和血瘀癥狀，增加眼前節及視網膜的血流量，使血管軟化、擴張，改善眼部血流動力學情況，從而使患者視力得到改善[14]。細胞凋亡參與DR的病理過程，但其具體的通路和機制尚不明確，且導致視網膜細胞凋亡的途徑較多。DR患者玻璃體中VEGF水平顯著升高，可以促進病理性新生血管形成[15-16]。本研究結果還顯示，益智仁聯合參芪四物湯加味灌胃治療DR大鼠后，視網膜細胞凋亡率及VEGF水平顯著下降。這提示益智仁聯合參芪四物湯加味能夠抑制視網膜細胞凋亡。原因可能為益智仁聯合參芪四物湯加味能夠抑制細胞凋亡和壞死、增強免疫能力等作用，同時還能抑制VEGF的表達，從而降低和延遲視網膜新生血管的發生和發展。現代藥理學研究表明，益智仁、黃芪具有抑制細胞凋亡、促進血管修復和再生及改善微循環灌注的藥理作用，可以抑制細胞凋亡，改善微循環灌注，擴張血管，清除氧自由基[17-18]。此外，黃芪還能通過作用于Akt-VEGF信號轉導途徑產生抗炎作用，降低糖尿病性視網膜病變中白細胞的黏附力，并能抑制其凋亡及基底膜增厚[19-20]。

綜上所述，益智仁聯合參芪四物湯加味治療能改善糖尿病視網膜病變大鼠視網膜血流，降低VEGF水平，抑制視網膜細胞凋亡和視網膜血管異常增殖。

參考文獻

譚玉聰，蔡立柏，羅莉，等.復雜性視網膜脫離患者疾病感受與圍手術期體驗的質性研究[J].中國臨床護理， 2021， 13（11）： 683-688.

陳美蘭，蔡季平. 糖尿病視網膜病變發病機制[J]. 中國實用眼科雜志， 2011， 29（6）： 521-524.

齊策. 參芪桃花四物湯藥理研究及臨床應用[J/CD]. 中西醫結合心血管病電子雜志， 2019， 7（1）： 37-38.

姚宇劍，倪雅麗，武素，等. 基于網絡藥理學探討益智仁-烏藥治療糖尿病腎病的有效成分及作用機制[J]. 中國中醫藥現代遠程教育， 2020， 18（3）： 59-63.

陳向東，孫淑銘，聶輔嬌，等.鏈脲佐菌素誘導Brown Norway大鼠糖尿病視網膜病變模型的建立[J].中醫藥導報， 2018， 24（18）： 15-19.

李才銳，姜德詠. 糖尿病視網膜病變動物模型[J]. 國外醫學（眼科學分冊）， 2005， 29（1）： 44-48.

徐家兵，汝靜.羥苯磺酸鈣與血栓通對早期糖尿病視網膜病變患者眼部血流的影響[J].現代中西醫結合雜志， 2020， 29（36）： 4064-4067.

蔡倩，劉劍.羥苯磺酸鈣聯合眼底激光方案在糖尿病視網膜病變治療中的作用分析[J/CD].現代醫學與健康研究電子雜志， 2022， 6（21）： 4-7.

萬光明，薛瑢. 從視網膜氧化應激與微血管改變談糖尿病視網膜病變的發病機制和防治策略[J]. 眼科新進展， 2022， 42（7）： 505-509.

趙寧，于洪丹，馮珍，等.紅景天苷抑制高糖誘導大鼠視網膜Müller細胞的凋亡[J].中國組織工程研究， 2021， 25（11）： 1664-1669.

劉敏，李蘭.益氣升清活絡法治療糖尿病視網膜病變體會[J].廣州中醫藥大學學報， 2015， 32（3）： 556-558.

李凱，馬天鵬，牛坤，等.益智仁防治糖尿病腎病相關研究述評[J].中國中醫藥現代遠程教育， 2021， 19（3）： 192-195.

芮凱，王獻，趙靖宇，等. 基于網絡藥理學探討補腎祛風法代表藥對\"益智仁-防風\"在糖尿病腎病治療中的有效成分及作用機制[J]. 海南醫學院學報， 2022， 28（17）： 1288-1293.

李磊，王剛，馬遠程.眼底激光聯合羥苯磺酸鈣治療糖尿病視網膜病變60例療效分析[J].安徽醫藥， 2019， 23（7）： 1452-1455.

焦軍杰，常昆，姚文艷，等.基于網絡藥理學和實驗驗證探究白藜蘆醇治療糖尿病視網膜病變的作用機制[J].現代藥物與臨床， 2022， 37（5）： 942-951.

唐穎，周倩倩. 糖尿病性視網膜病變應用抗VEGF藥物治療的效果分析[J]. 醫藥前沿， 2021， 11（27）： 59-60.

黃凌. 益智仁揮發油對實驗性帕金森病的作用研究[D]. 重慶：重慶醫科大學， 2008.

柯坤茂，安美霞. 基于網絡藥理學分析黃芪與枸杞子在糖尿病視網膜病變中的作用[J]. 眼科新進展， 2020， 40（12）： 1119-1124.

孫曉紅，錢科威，周瑜，等.當歸補血湯加味治療糖尿病視網膜病變療效及機制研究[J].現代中西醫結合雜志， 2019， 28（28）： 3152-3155， 3170.

劉俊輝，李春江，李玉濤. 黃芪多糖對糖尿病大鼠視網膜病變的保護作用[J]. 河北醫科大學學報， 2017， 38（7）： 797-800.