草坪草再生體系研究進展

摘要：草種是草坪業的基礎，但我國缺乏自己培育的草坪草品種，所用草坪草種主要依賴于進口，因此草坪草育種工作亟待加強。常規育種周期長、效率低且難以實現精準靶向育種，而現代生物技術為草坪草育種提供了新的有效途徑，其中構建草坪草高效再生體系，加快繁殖速度，對擁有再生體系的草坪草種進行遺傳轉化是其關鍵。本文主要綜述了近年來對部分冷季型和暖季型草坪草的再生體系研究，總結了影響再生過程的關鍵因素、存在問題等，同時對未來草坪草再生領域的發展進行了展望，以期對今后草坪草新品種的研發、推廣和應用提供參考。

關鍵詞：草坪草；組織培養；再生體系；愈傷組織

中圖分類號：S688.4;Q943.1 文獻標識碼：A 文章編號：1007-0435（2023）08-2241-12

Research Progress on Regeneration System of Turfgrass

MA Cheng-ze， CUI Hui-ting， HU Qian-nan， WANG Lu-yu， JIA Fang， WANG Chu，

QIAO Jia-yue， LI Yue*， SUN Yan*

（College of Grassland Science and Technology， China Agricultural University， Beijing 100193， China）

Abstract：Grass seeds are the foundation of lawn industry，but we lack our own turfgrass varieties and the turfgrass seeds used in practice mainly rely on importation from abroad. Therefore，turfgrass breeding needs to be strengthened urgently. The conventional breeding cost a long period of time，low efficiency and is difficult to achieve precise targeted breeding. However，modern biotechnologies provide a new and effective way for turfgrass breeding，in which the key is a construction of an efficient regeneration system for turfgrass to accelerate the propagation speed，and be carried out its genetic transformation with regeneration system. This review mainly summarized the researches on the regeneration systems of some cold season and warm season turfgrasses in recent years，and focused on the key factors and existing problems affecting the regeneration process，and prospected the future development of turfgrass regeneration，with a view to provide a reference for the research，development，promotion，and application of new turfgrass varieties in the coming days.

Key words：Turfgrass;Tissue culture;Regeneration system;Callus

草坪建植是城市綠地的基礎，其對綠化城市、保護環境、維持生態平衡起著重要作用［1］。目前，常用的草坪草主要是禾本科（Gramineae）植物，如草地早熟禾（Poa pratensis L.）、高羊茅（Festuca arundinacea Schreb.）、多年生黑麥草（Lolium perenne L.）、匍匐翦股穎（Agrostis stolonifera L.）、結縷草（Zoysia japonica Steud.）、狗牙根（Cynodon dactylon （L.） Pers.）等［2］。據了解，目前我國高質量草地和草坪草用種主要依賴于進口，統計顯示牧草種子進口量占需求量 60% 以上，草坪草種子進口量占需求量 90% 以上，這種情況大大制約了我國草坪產業的發展［3］。因此，選育開發我國特有的優良草坪草品種至關重要。隨著現代生物技術的蓬勃發展，以生物技術為核心的植物品種改良方法的應用也越來越廣。無論采用基因工程還是細胞工程創制作物新品種，其前提都是要建立起高效的組織培養再生體系，這樣才能夠大大縮短育種周期，提高育種效率，同時也能夠為今后的遺傳轉化工作奠定基礎。

植物組織培養是指對離體的植物器官、組織、細胞或原生質體等在無菌條件下接種在含有各種營養物質及植物激素的培養基上進行人工培育以獲得再生的完整植株的過程，該技術能夠較好的保存植物體原本的遺傳特性［4］。植物組織培養的理論基礎是來源于1902年德國植物學家Haberlandt［5］提出的植物細胞具有全能性的概念，其指的是植物的每個細胞都包含著該物種的全部遺傳信息，從而具備發育成完整植株的遺傳能力。我國對植物組織培養的研究起步于20世紀50年代［6］。到目前為止，我國已經對農作物、園藝作物、觀賞植物等多種類型植物開展了大量組織培養研究并且取得了較為豐碩的成果。

植物再生是指植物組織或器官在受到傷害或脅迫后，進行自我修復和替換（再生出各種器官）的過程［7］。廣義上講，植物再生體系也屬于植物組織培養，區別在于植物組織培養的側重點在于提高植物的增殖系數和繁殖效率，而植物再生體系的建立通常是為后續遺傳轉化工作奠定基礎。國外早在 20 世紀初就開始致力于草坪草的轉基因及育種方面的工作，最先開始是在1988年，Horn等［8］通過原生質體再生方式首先獲得了轉基因鴨茅（Dactylis glomerata L.）植株。而我國在這方面的研究起步相對較晚，且到目前為止成熟的草坪草再生及遺傳轉化體系仍屈指可數，為了加快我國草坪草育種進程，突破我國草坪草現代育種工作中的技術瓶頸，并最終提升我國草坪草種自給能力，草坪草再生體系相關研究工作亟待開展。

我國草坪草組織培養的研究工作較農作物稍晚，始見于20世紀末，至21世紀初相關研究工作逐漸增多。相較于其他植物而言，草坪草多為低矮的根莖型、匍匐型或叢生型植物，具有旺盛的生命力和繁殖能力，除具備種子繁殖力外，還具備極強的無性繁殖能力。絕大多數的草坪草為草本植物，質地柔軟，與木本植物相比，草本植物外植體的木質化程度相對較低，在組織培養過程中褐化現象相對不易出現［9］。但在具體研究中，褐化和玻璃化現象仍然普遍存在。另外，由于草坪草種子等器官相對較小，且一般具有較強的表面張力，在進行組織培養過程中，對于外植體的取材和消毒工作往往較為繁瑣。草坪草的這些特點對其再生體系的建立更增加了不確定性。

本文綜述了近年來幾種常見草坪草的組培再生體系研究，并對其外植體類型及再生方式等進行了整合歸類，同時對再生過程中的影響因素、存在問題等進行了總結，并對草坪草再生體系的構建提出了建議和展望，以期為后續草坪草的再生及遺傳轉化工作提供理論參考依據。

1 再生體系建立的途徑

20世紀70年代以來，科研工作者對植物再生體系的研究做了大量的工作。1975年，Ahloowalia［10］建立了冷季型草坪草多年生黑麥草的再生體系，是草坪草再生體系構建的早期研究。1980年，Dale［11］用一年生黑麥草（Lolium multiflorum Lam.）的未成熟胚建立植株再生體系。自此以后，許多研究者對草坪草進行了組織培養研究，對早熟禾屬（Poa L.）、黑麥草屬（Lolium L.）、結縷草屬（Zoysia Willd.）和翦股穎屬（Agrostis L.）等的一些種建立了較為完善的植株再生體系。之后許多研究工作者對草坪草組織培養進行不斷研究，相繼建立了一系列草坪草的植株再生體系。本文表1對部分常見已建立再生體系草坪草的外植體種類與再生方式進行了比較。植物組織培養方式主要包括胚性愈傷組織培養、懸浮細胞培養、原生質體培養以及花藥離體培養等［12］。不同再生途徑的優缺點及影響因素等不同，表2對不同再生方式在這些方面的特點進行了總結。

1.1 胚性愈傷組織培養

胚性愈傷組織培養是指將母體植物上某一部分切下形成外植體，接種到無菌培養基上進行胚性愈傷組織的誘導、生長與發育，是最為常見的草坪草再生方法。通常植物組織均能被誘導形成愈傷組織，由外植體形成愈傷組織也就標志著植物組織培養的開始。對于草坪草這種絕大多數為單子葉的植物而言，選用胚性愈傷組織培養的途徑是最為理想的，因為單子葉植物懸浮系的建立以及原生質體的再生都較為困難，而由器官直接分化再生植株的難度更大，且草坪草的穎花微小，在穗上進行花粉管導入和微注射幾乎難以實現［67］。對于胚性愈傷組織培養還有一個重要的環節就是繼代培養，待外植體長出突起狀愈傷組織后，將其剝下轉移到新的誘導培養基中，由于愈傷組織在生長過程中會不斷消耗誘導培養基中的營養物質并積累代謝產物，因此每隔一定時間就要更換新的誘導培養基，愈傷組織通常培養約2周左右就需要繼代一次，繼代次數一般不超過三次。較早的關于草坪草胚性愈傷組織培養的研究報道是在1984年Ahn等［68-69］對狗牙根的研究，并于1987年以未成熟花序為外植體，成功誘導出愈傷組織并再生出新的植株。

1.2 原生質體培養

原生質體是指脫去細胞壁的“裸露細胞”，具有細胞全能性，將其在適宜的條件下進行培養，最終會得到新的再生植株［70-71］。對于禾本科植物的原生質體培養，首次報道是在上世紀80年代。1980年，Vasil等［72］探索出了雜交狼尾草（Pennisetum americanum × Pennisetum purpureum）懸浮細胞原生質體的植株再生體系。對于草坪草而言，早期的研究是在1993年，Nielsen等［73］建立了草地早熟禾的原生質體培養體系。目前國內對于草坪草的原生質體培養的研究還相對較少。

對原生質體培養而言，原生質體分離的材料及其生長狀態是至關重要的影響因素。植物的根、莖、葉、下胚軸、愈傷組織以及懸浮細胞等都可以作為原生質體的分離材料，并且只有處在較高分化水平狀態下的組織或器官才能夠獲得高活力和高產的原生質體［74］。其中，最早應用的原生質體分離材料是懸浮細胞，之后隨著原生質體培養技術的不斷完善，愈傷組織也逐漸成為較常用的分離材料，1996年，Inokuma等［75］以成熟種子誘導出結縷草胚性愈傷組織，之后將分離出的原生質體放到培養基中培養從而獲得再生植株。對于愈傷組織而言，應選擇淡黃色、顆粒狀的胚性愈傷組織，并且選用胚性愈傷組織作為原生質體分離材料，具有材料易獲取，培養時間較短，胚性愈傷組織分裂和分化能力旺盛等優點。另外，由于葉肉細胞較易制備并且其遺傳背景相對統一，因此也是分離原生質體較好的材料。

1.3 懸浮細胞培養

植物懸浮細胞培養通常是指將來自胚性愈傷組織的細胞或較小的細胞團懸浮在液體培養基中進行振蕩培養的一種細胞培養方式。最早的關于懸浮細胞培養的研究只是得到了白化苗，對于正常植株的再生報道最早見于1989年，Zaghmout等［76］對紫羊茅（Festuca rubra L.）的懸浮培養物培養后經體細胞發生途徑得到再生植株。

外植體的選擇對于植物懸浮細胞培養具有重要影響，應選擇未成熟的且具有較強分生能力的組織，對于禾本科植物而言常用的外植體有未成熟的胚、種子、幼穗等。另外，愈傷組織的接種密度也是一個重要的影響因素。劉思妤等［77］指出，起始接種密度必須達到一定的有效密度才能夠維持細胞的分裂和生長。接種密度過高會導致培養基中養分加速消耗，使細胞生長發育受限，并且需要頻繁更換培養基造成人力物力的浪費；接種密度過低則容易造成懸浮細胞褐化甚至死亡。目前已有越來越多的植物建立了懸浮細胞培養體系，該培養方式具有細胞分散性、均一性好、生長速度快且易于控制等優點，廣泛應用于分子生物學、遺傳學、細胞學等領域，但該方法的一個不足之處就是容易產生遺傳變異及胚胎發生能力的下降，這也是目前單子葉植物在懸浮細胞培養方面存在的主要問題之一。

1.4 花藥離體培養

花藥離體培養是一種獲得單倍體植株的主要方法，是指通過培養使小孢子細胞離開正常發育途徑而分化成為單倍體植株。1985年，Kasperbauer等［78］發現利用高羊茅單倍體和純合二倍體培育新品種能夠縮短育種進程。研究發現，在培養過程中，花藥只有在特定時期才會較為敏感的響應外界刺激。花藥離體培養最大的優點是能夠縮短育種年限，但同時也存在一些問題，如愈傷組織分化成苗的概率低，容易產生大量白化苗等。

2 影響再生過程的因素

植物再生過程中的影響因素是至關重要的，其直接決定了植株再生的成功與否。本文針對幾種常見且重要的影響因素進行了詳細的討論，具體闡述如下。

2.1 外植體的選擇

植物組織培養過程中外植體的選取既是基礎環節也是能否培育出合格幼苗的核心步驟［79］。不同的外植體對再生也有一定的影響。在草坪草的組織培養研究中，多數是以種子作為外植體的，另外還有幼穗、莖尖等也可作為外植體材料，但以幼穗等作為外植體存在的主要問題是受季節影響較大且取材難度也相對較大，而利用種子作為外植體則不受季節限制，易取材并且受污染幾率較小。另外，研究表明處于幼體發育階段的外植體比成年外植體具有更高的再生性和全能性［80］。如朱根發等［15］發現幼穗是草地早熟禾再生培養的最佳外植體。表1中列舉了部分草坪草再生體系所選用的外植體的類型。

2.2 基因型的選擇

研究表明，植物組織培養存在很強的物種依賴性以及基因型特異性［81］。因此，不同草坪草種或同一草坪草種中的不同品種之間由于內源激素含量以及體細胞胚胎發生能力不同等因素，導致其愈傷誘導能力有所差異。

陳陽等［82］通過對4個草地早熟禾品種的再生研究發現，在相同的培養基條件下，4個品種的愈傷誘導情況不同。支大英等［83］通過研究8個不同高羊茅品種的組培再生發現，8個品種在相同的分化培養基中的分化情況存在差異。不僅如此，類似的研究結果在小麥（Triticum aestivum L.）及高粱（Sorghum bicolor L.）等作物中也被發現［84-85］。結合表2并查閱大量文獻后發現，無論哪種再生途徑，基因型對再生結果的影響都是至關重要的。

2.3 基礎培養基種類

培養基是植物組織培養過程中必不可少的一部分，它能夠為植物外植體愈傷的誘導、分化及生根等提供多種營養物質，從而使其完成再生過程。常見的培養基包括MS培養基、N6培養基、B5培養基以及WPM培養基等，其都能夠顯著影響組織培養過程中植物的再生能力［81］。

MS培養基最早是由Murashige和Skoog［86］于1962年為培養煙草材料而設計的。其含有的無機鹽濃度較高，尤其是銨鹽和硝酸鹽的含量高，能夠使愈傷組織較快生長，但MS培養基不適合生長緩慢、對無機鹽要求比較低的植物，尤其不適合因銨鹽濃度過高而引發毒害的植物組織培養。在對草坪草的相關研究中，趙俊俠等［59］通過研究結縷草的再生體系發現，在愈傷組織分化階段，MS培養基的效果要遠遠優于NB培養基。除此以外，在培養基中添加其他成分，如甘露醇、金屬離子等也會影響外植體的再生能力［87］。

2.4 植物生長調節劑的選擇

植物的體外再生依賴于外源激素的添加和在組織培養過程中對這些激素的反應［88］。植物生長調節劑（Plant growth regulators，PGRs），特別是生長素、細胞分裂素等，在植物體細胞胚胎發生和器官發生中起著重要作用［89］。2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-dichlorophenoxyacetic acid，2，4-D）是一種廣泛應用的植物生長調節劑，一般而言低濃度2，4-D能夠促進胚性愈傷組織形成，而高濃度則抑制胚性愈傷形成，對于大多數禾本科植物而言，2 mg·L-1的2，4-D是誘導胚性愈傷組織形成的最佳使用濃度［90-91］。細胞分裂素也是組織培養中常用的一種激素，它不僅能夠單獨誘導不定芽的分化，還可以與生長素協同促進細胞的增殖［92］。在草坪草的研究中，吳艷歌等［61］研究發現，適宜濃度的細胞分裂素不僅顯著促進溝葉結縷草愈傷組織的生長和分化，也明顯影響抗氧化酶活性，從而有助于提高胚性愈傷組織的再生能力。吲哚-3-乙酸（Indole-3-acetic acid，IAA）常用于生根培養階段，郭伶娜等［93］研究發現加入吲哚丁酸（Indole-3-butyric acid，IBA）或萘乙酸（1-naphthylacetic-acid，NAA）提高了高羊茅的生根率，其中IBA的促進效果好于NAA。除此以外，近年來對于在非生物脅迫下如何提高再生效率也有了相關報道：在5%～15% PEG-6000的水分脅迫下，添加0.05～0.20 mmol·L-1的褪黑素（Melatonin，MEL）或0.05～0.10 μmol·L-1表油菜素內酯（Epibrassinolide，EBL）對溝葉結縷草愈傷組織再生能力具有顯著的提升作用［94］。

2.5 不同的外植體處理方式

2.5.1 去除部分胚乳 植物外植體在進行組織培養時，可能由于沒有傷口或其他原因導致誘導產生愈傷的速度較慢，因此，可以通過人為的物理或化學手段使其加快愈傷的誘導。較為常用的方法就是切除種子的部分胚乳，這一方法有助于愈傷組織生長的原因可能是切除部分胚乳后，減弱了種子內源激素對外施2，4-D效果的影響，另外就是產生了傷口。Bai等［95］在以高羊茅成熟種子作為外植體時，認為對種子進行切割可以提高愈傷組織的誘導率和再生率。姜倩倩［19］在對多年生黑麥草種子橫切后放入培養基培養發現，愈傷組織的誘導率增加。

2.5.2 浸泡處理 陳智勇等［13］研究發現，將草地早熟禾種子浸泡于濃鹽酸中1～2分鐘，后消毒接種于MS培養基，發現較對照組相比，經濃鹽酸浸泡的種子出愈率由39.29% 提高到58.1%，出愈時間縮短了約15 d。其原因可能是濃鹽酸浸種提高了種子活力，同時使種皮變軟，從而使外植體更加容易被誘導形成愈傷組織。除用濃鹽酸浸種外，代小梅等［96］研究了無菌水浸種對多年生黑麥草愈傷組織誘導的影響，研究發現，浸泡48 h處理有利于種子愈傷組織誘導，但隨著浸泡時間延長，愈傷組織誘導率逐漸下降，且出愈時間推遲。

3 存在問題及解決方法

3.1 有效愈傷產量低

有效愈傷產量低的問題主要是由組織培養過程中褐化、玻璃化以及菌類污染所造成，其不僅降低了有效愈傷的產量，甚至還會導致外植體材料的死亡，進而直接決定了植物組織培養的成功與否，對植物的規模化生產和應用產生了很大影響。

3.1.1 褐化現象 褐化現象是指在植物組織培養過程中，由于外植體自身分泌出的酚類化合物導致外植體發生褐變褐化的現象［97］。研究表明褐化現象主要分為酶促褐化和非酶促褐化兩類，酶促褐化是指細胞膜結構發生變化或遭破壞時，氧化酶和底物結合后，在氧化作用下生成醌類物質，使培養基和外植體褐變，進而影響植物組織培養物生長和分化甚至死亡；非酶促褐化是由于細胞受脅迫條件或其他不利條件影響（如高溫等）所造成的細胞死亡或自然發生的細胞死亡而導致的褐變，未涉及到酚類物質的產生［98］。

對于解決褐化問題的方法，主要有以下幾點。

①選擇幼嫩部位（木質素含量低）作為外植體，取材應盡量在植物休眠期或生長緩慢的季節，如早春或深秋。

②由于光照會誘導植物組織內部酚類氧化酶活性，因此培養初期應在黑暗條件下進行，同時培養溫度不宜過高。

③可以適當增加培養基中瓊脂用量，降低無機鹽濃度。

④適當添加抗褐化劑。對于外源添加物緩解褐化的研究已有報道，如Akasaka-Kennedy等［99］通過在油菜（Brassica napus L.）葉片組織培養基中加入硝酸銀（Silver nitrate）發現，硝酸銀不僅能夠防止褐化的產生，還能夠通過抑制乙烯（Ethylene，ET）的合成從而促進葉芽的形成。在草坪草中也有相關報道，如代小梅等［96］研究表明，在愈傷組織的繼代培養中，對愈傷組織褐化抑制效果較好的檸檬酸（Citric acid，CA）濃度是2 mg· L-1，培養2周的褐化率為15%，而隨檸檬酸濃度升高，褐化率逐漸增加，而未添加檸檬酸的愈傷褐化率為50%。錢永強［100］研究發現，抗氧化劑聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinyl pyrrolidone，PVP）及抗壞血酸（Vitamin C，VC）濃度為200 mg·L-1時，可延遲野牛草愈傷組織褐化時間，并且縮短繼代周期至5 d從而有效防止愈傷組織褐化。除此之外，林輝鋒等［101］研究表明，在組織培養過程中，通過不同的培養方式或固態培養添加適量的活性炭（Active carbon，AC）也可以有效抑制褐化現象的產生。

⑤外植體預處理。Cai等［102］研究發現，將切除的外植體用氯化鈉（NaCl）溶液浸泡預處理，能夠有效抑制芍藥（Paeonia lactiflora Pall.）組織褐變。

3.1.2 玻璃化現象 玻璃化現象是指在植物組織培養過程中發生的一種形態和生理紊亂，由于水分攝入過多，導致葉片呈半透明、腫脹、卷曲、易碎的狀態，多數發生在植物莖尖培養和離體快繁中［103］。據統計，目前已有200多種植物在組織培養過程中出現了玻璃化現象，其中約150種玻璃化現象較為嚴重［104］。玻璃化現象產生的原因包括內在及外在因素，外因主要有外植體的選擇、光照、溫度及培養基的成分等，內因主要就是外植體自身相關酶的活性，如Tian等［105］通過對大蒜（Allium sativum L.）玻璃化研究發現，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶、過氧化物酶（Peroxidase，POD）和再生多胺氧化酶（Polyamine oxidase，PAO）均可誘導植物內源性活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的產生，因此NADPH氧化酶的激活可能在玻璃化過程中起到了關鍵作用。另一個重要因素就是玻璃化形成基因的表達調控，Bakir等［106］通過對桃（Amygdalus persica L.）的玻璃化葉片和正常狀態葉片分別進行RNA測序（RNA-Seq）發現，兩者之間有超過300個轉錄本的表達發生了改變。

解決玻璃化現象的措施主要有以下幾點。

①外植體盡量不要選擇分化程度過低的組織。

②適宜的光照及溫度。通常適宜的培養溫度為（25±3）℃。

③加強通風。由于組織培養需要無菌環境，因此常將其放置在空間有限的密閉培養皿等容器內進行培養，從而容易導致空氣流通性差及乙烯等有害物質的積累，進而導致玻璃化現象的產生［107］。

④改善培養基成分。研究表明，高濃度的細胞分裂素可以通過誘導乙烯的合成積累從而使組培苗出現玻璃化現象，因此應當適當降低培養基中細胞分裂素（Cytokinin，CTK）的濃度［108］。有研究發現［109］，在培養基中添加間苯三酚（Phloroglucinol），可以增強植物的木質化過程從而有效地控制玻璃化。

3.1.3 菌類污染 菌類污染是指在植物組織培養過程中，由于外植體本身以及外界或人為操作因素造成的細菌、真菌等微生物污染。菌類污染在一定程度上嚴重阻礙了植物組織培養的進程，不利于植物新品種的選育開發和應用，對農業發展造成了直接影響，其次菌類污染還導致人力物力等資源的浪費，因此，如何有效降低植物組織培養過程中的菌類污染率就顯得尤為重要。

降低菌類污染的主要措施有以下幾點。

①外植體取材。通常來說，植物生長環境越復雜其帶菌就越多，因此可以將植物在室內種植（如溫室或水培）并取材；若室外取材，取材時間應在晴朗的中午，同時避免在高溫多雨季節取材，外植體應選取幼嫩部位。另外，不同的外植體所需要的滅菌方式以及滅菌時間等存在差異，需具體分析。

②組培環境消毒。需要定期對組培間以及超凈工作臺進行消毒，同時在組織培養試驗前后都要進行紫外殺菌，同時試驗人員也應規范操作，避免人為因素造成的污染。

③抑菌劑。在培養基中加入一定的抗生素或化學藥物也能夠起到一定的抑菌作用，如白一葦等［110］研究發現按一定比例在培養基中加入頭孢霉素（Cephalosporin）、百菌清（Chlorothalonil）、代森錳鋅（Mancozeb）具有較為高效的抑菌效果；Li等［111］研究發現在MS培養基中加入10 μg·mL-1卡那霉素（Kanamycin）、5 μg· L-1氯霉素（Chloramphenicol）和0.015 625% 山梨酸鉀（Potassium sorbate）可有效防止微生物污染。

④利用植物不同部位提取物作為抑菌劑是一種較為新穎的方法，如Septiani等［112］研究表明，積雪草（Centella asiatica （L.） Urb）葉提取物能夠有效抑制馬鈴薯組織培養過程中菌類的產生。

3.2 再生體系不穩定

組培再生體系不穩定是當前草坪草組培再生體系研發過程中存在的另一個主要問題。組培再生過程需要比較完善的環境控制系統，涉及到的試劑較多，個別環節還需要一定的技術手法和操作人員的主觀判斷，因此整個組培再生過程存在一定的不確定性。產生該問題的主要原因包括但不限于以下幾個方面。

3.2.1 環境控制不嚴格，培養條件不穩定 光照、溫度乃至濕度的改變都會對再生體系造成影響，穩定的再生體系需要較為穩定的環境控制系統。另外，實驗試劑的批次、生產廠家不同，純度也不同，對再生體系也會產生影響。比如消毒試劑由于儲存時間較長，有效物質揮發，或生產廠家不同，導致濃度發生變化，消毒效果不一致，就會造成外植體生理狀態出現差異，進而影響整個再生過程。因此，可以從加強環境控制設施建設、嚴格控制試劑的選用等方面提高再生體系穩定性。

3.2.2 外植體的狀態不統一 外植體是再生過程的起始環節，外植體狀態的一致對再生體系的穩定具有決定性影響。在獲得理想數量再生植株的過程中，一般需要重復多次進行實驗，每次實驗所使用的外植體狀態不可能完全一致，組織細胞重編程的過程也不相同，這也是導致再生體系不穩定的因素之一。解決該問題需要在育苗過程、取樣時間、取樣部位等細節進行嚴格控制，以盡量確保初始材料的穩定一致。

3.2.3 實驗人員操作技術手法差異大 在試劑配制、外植體前處理、繼代轉移等過程中，人員操作和主觀判斷的差異也是影響組培再生體系的重要因素。比如在切割葉片等組織的過程中，操作人員的熟練度不同，葉片傷口切面的完整度就會不同，組織對傷口的響應差異就會影響組織再生過程，進而造成出愈率的差異。針對這一點可以加強實驗人員培訓以及雇用專門人員負責相關工作，從而盡量避免因操作差異、主觀判斷等不穩定因素所導致的問題。

4 結論與展望

2021年我國發布了若干種業振興相關政策，旨在解決我國種業發展過程中原創性種質資源缺乏的問題，這其中就包括牧草及草坪草種質資源。有調查顯示，目前我國草地草坪用種主要依賴進口，造成這一現狀的主要原因有傳統草坪草品種選育周期長，同時現代生物技術育種又普遍受到再生體系不成熟等瓶頸問題所限制。因此，提升草坪草再生效率和遺傳轉化率，建立一套完善且高效的草坪草種子生產體系，才能從真正意義上朝著種質資源國有化、自主化方向前進，從而解決草坪草種的“卡脖子”問題，推動草坪草產業更好的發展。綜合近年來多種草坪草等植物再生體系研究來看，制約草坪草愈傷再生的主要問題是褐化和玻璃化現象。愈傷組織褐化和玻璃化的根本原因是由于外部或內部的條件限制，使愈傷組織的生理狀態出現異常，無法正常分化。為了解決這兩個問題應分別從優化內部自身條件（如外植體的選擇、基因型的選擇、以及利用形態發生因子等）和外部環境條件（如培養基成分、生長調節物質、培養條件等）兩方面入手開展研究。

①外植體的選擇。不同外植體的再生能力不同，因此選擇合適的外植體是建立組織培養再生體系的重要步驟。綜合來看，對于能夠產生種子的草坪草而言，采用幼穗為外植體并成功再生的研究較多，但由于取材受季節時間的限制難以大規模進行。種子具有易于保存和操作不受時間限制的優勢，且種子產生的幼芽細胞分化能力強于葉片，研究人員將更傾向于選擇種子作為外植體來構建草坪草再生繁殖體系。

②基因型的選擇。現有研究表明，不同物種的遺傳再生體系普遍存在基因型依賴的現象，因此篩選再生能力強的基因型，對成功建立遺傳再生體系也很重要。建立再生體系的初期，選擇表型性狀差異較大的不同基因型同時進行組織培養，將有利于提升再生體系構建的效率。

③形態發生因子。最近已有一些文獻報道，利用形態發生因子突破外植體和基因型甚至是物種的限制，來構建遺傳再生體系［113］。這些形態發生因子包括WUSCHEL （WUS） 蛋白和BABY BOOM （BBM） 蛋白等。目前這些基因僅在玉米、小麥、大麥、楊樹等物種中成功應用［114-116］，在草坪草遺傳再生方面還未見報道，未來有望依賴此類形態發生因子提高頑拗型草坪草的再生轉化效率。

④培養基的成分。從文獻來看，MS培養基是應用十分廣泛的基礎培養基，一般能夠滿足大部分物種的營養需求。對于再生體系尚未建立的物種，可以同時采用2～3種常見的培養基進行組織培養，從中篩選出合適的基礎培養基。

⑤生長調節物質。通過綜合分析比較以往的研究，結果表明生長素和細胞分裂素以及二者之間的配比是決定細胞脫分化和再分化的重要基礎。因此，在構建再生體系時不僅要考慮激素的獨立用量，還應考慮不同激素之間的配比。同時，不同物種對激素種類也具有選擇依賴性，再生效果不理想時可考慮更換其他激素。

另外，對于外界環境條件，可從培養基質、容器、設施環境以及添加活性炭等方面加以優化。在今后應當逐步建立一套系統化的草坪草再生研究體系，推進組培苗的產業化，為今后草坪草優良品種的培育奠定基礎。

由于我國草坪草種質資源相對豐富，物種齊全，但用于草坪草育種的資金投入和從事草坪草育種的科研人員有限。因此，只能對部分草坪草種的再生體系進行優先建立，進而引領草坪草育種領域研究。首先，當前應用廣泛的傳統草坪草種應優先建立再生體系。傳統草坪草種種植面積大，應用廣泛，優先建立再生體系可進一步促進傳統草坪草種的育種進程，有利于創造更多經濟生態效益。其次，具有較大應用價值和潛力的新興草坪草種應優先建立再生體系。隨著學科發展和人類社會需求的轉變，一些具有優良性狀的草坪草種正在嶄露頭角。比如抗逆性強的野牛草、苔草等草坪草，具有非常強大的耐旱、耐鹽堿、耐貧瘠等特性，十分適合像我國這樣水資源匱乏的國家和地區進行利用。優先建立再生體系可加快其繁育進程，節約研發的時間成本，對于優先搶占市場，促進草坪草種國產化進程有重要意義。再次，瀕危、資源稀缺草種應優先建立再生體系。對于瀕危、稀缺草坪草種質資源，可利用再生體系促進資源的擴繁，避免滅絕，故應優先開展再生體系研究。

總之，只有將草坪產業重視起來，構建高效的草坪草再生及遺傳轉化體系，加快繁殖速度，培育優良性狀的草坪草品種，才能不斷推動草坪草產業自主化、一體化發展，從而更好更快的完善城鄉綠化建設，不斷滿足人們對環境和生活質量的要求。

參考文獻

［1］常亞輝. 葫蘆島地區草坪修剪施肥技術初探［J］. 種子科技，2019，37（4）：113，115

［2］馬萬里，韓烈保，羅菊春. 草坪植物的新資源——苔草屬植物［J］. 草業科學，2001，18（2）：43-45，56

［3］馬強. 草坪草種國產化，難在哪里？［N］. 中國花卉報，2022-09-29（W03）

［4］吳港圓，楊雅鈞，何石燕，等.植物組織培養技術研究進展［J］. 壯瑤藥研究，2022，（1）：74-79，238-239

［5］HABERLANDT G. Experiments on the culture of isolated plant cells［J］. Plant Cell and Tissue Cultures，1902，2：68-88

［6］郝玉華. 我國植物組織培養的發展現狀與前景展望［J］. 江蘇農業科學，2008，264（4）：20-23

［7］張騰，謝沖，何崇圣. 植物再生過程中的表觀修飾研究進展［J］. 植物生理學報，2020，56（8）：1711-1718

［8］HORN M E，SHILLITO R D，CONGER B V，et al. Transgenic plants of orchardgrass （Dactylis glomerata L.） from protoplasts［J］. Plant Cell Reports，1988，7（7）：469-472

［9］李懿鑫，果弘毅，儲歆彤，等. 園林植物再生與遺傳轉化體系研究進展［J］. 江蘇農業科學，2022，50（14）：12-21

［10］AHLOOWALIA B S. Regeneration of ryegrass plants in tissue culture［J］. Crop Science，1975，15（4）：449-452

［11］DALE P J. Embryoids from cultured immature embryos of Lolium multiflorum［J］. Zeitschrift fur Pflanzenphysiologie，1980，100（1）：73-77

［12］IKEUCHI M，OGAWA Y，IWASE A，et al. Plant regeneration：cellular origins and molecular mechanisms［J］. Development. 2016，143（9）：1442-1451

［13］陳智勇，易自力，蔣建雄，等. 草地早熟禾愈傷組織遺傳轉化受體系統的建立［J］. 中國草地學報，2007，29（2）：54-58

［14］俞玲. 抗旱草地早熟禾植株再生及原生質體培養體系的建立［D］. 蘭州：甘肅農業大學，2014：42-43

［15］朱根發，余毓君. 草地早熟禾的組織培養條件和分化能力研究［J］. 華中農業大學學報，1994，13（2）：199-203

［16］KE S，LEE C W. Plant regeneration in Kentucky bluegrass （Poa pratensis L.） via coleoptile tissue cultures［J］. Plant Cell Reports，1996，15（12）：882-887

［17］PIEPER M A，SMITH M A L. A whole plant microculture selection system for Kentucky bluegrass［J］. Crop Science，1988，28（4）

［18］曾慶飛，韋鑫，陳錫，等. 多花黑麥草特高和多年生黑麥草四季高頻組培再生體系的優化與建立［J］. 草業科學，2017，34（8）：1649-1660

［19］姜倩倩. 多年生黑麥草LpCKX1基因CRISPR/Cas9靶向編輯載體的構建及遺傳轉化體系的建立［D］. 煙臺：煙臺大學，2020：66

［20］GROGG D，ROHNER M，YATES S，et al. Callus induction from diverse explants and genotypes enables robust transformation of perennial ryegrass （Lolium perenne L.）［J］. Plants （Basel），2022，11（15）：2054

［21］ALTPETER F，POSSELT U K. Improved plant regeneration from cell suspensions of commercial cultivars，breeding-and inbred lines of perennial ryegrass （Lolium perenne L.）［J］. Journal of Plant Physiology，2000，156（5-6）：790-796

［22］ESMAEILI S，SALEHI H，KHOSH-KHUI M. Direct and indirect in vitro plant regeneration of two commercial cultivars of perennial ryegrass［J］. Advances in Horticultural Science，2018，32（2）：273-280

［23］劉珍，袁慶華，王瑜，等. 多年生黑麥草高頻叢生芽增殖培養體系的研究［J］. 草地學報，2010，18（4）：576-583

［24］WANG Z Y，GE Y X，MIAN R，et al. Development of highly tissue culture responsive lines of Lolium temulentum by anther culture［J］. Plant Science，2005，168（1）：203-211

［25］黃銳. 多年生黑麥草品種夜影再生體系的建立［J］. 甘肅農業科技，2016（6）：28-31

［26］HOSSEINI H R，SALEHI H，ALICHI M. Acquirement of CRY8DB transgenic tall fescue （Festuca arundinacea Schreb.） by agrobacterium tumefaciens to develop resistance against Pentodon idiota Herbest［J］. Molecular Biotechnology，2019，61（7）：528-540

［27］馬生健，劉金祥，曾富華，等. 高羊茅高效組織培養再生體系的建立［J］. 分子植物育種，2020，18（5）：1611-1616

［28］王茜，王志偉，王小利，等. 一種高羊茅組培快繁方法：中國，CN202110399455.5［P］. 2021-06-18

［29］TAKAMIZO T，SATO H. Protocol for Agrobacterium-mediated transformation of tall fescue and future perspective on the application of genome editing［J］. Plant Biotechnology，2020，37（2）：157-161

［30］趙智燕，潘俊松，何亞麗，等. 兩個高羊茅無性系的營養器官組織培養及再生體系的建立［J］. 草業學報，2009，18（5）：168-175

［31］凌飛，徐慶. 一種匍匐剪股穎的遺傳轉化方法：中國，CN202011163653.3［P］. 2021-01-05

［32］LEE L，LARAMORE C L，DAY P R，et al. Transformation and regeneration of creeping bentgrass （Agrostis palustris Huds.） protoplasts［J］. Crop Science，1996，36（2）：401-406

［33］ZHANG H，SHI Y，LIU X，et al. Transgenic creeping bentgrass plants expressing a Picea wilsonii dehydrin gene （PicW） demonstrate improved freezing tolerance［J］. Molecular Biology Reports，2018，45（6）：1627-1635

［34］黃帆，李俊，劉磊，等. 無芒雀麥組織培養再生體系的建立［J］. 植物生理學報，2018，54（5）：783-789

［35］NAKAMURA T，ISHIKAWA M. Transformation of suspension cultures of bromegrass （Bromus inermis） by Agrobacterium tumefaciens［J］. Plant Cell Tissue and Organ Culture，2006，84（3）：293-299

［36］WATTANASIRI C，WALTON P D. Effects of growth-regulators on callus cell growth，plant regeneration，and somaclonal variation of smooth bromegrass （Bromus-inermis leyss）［J］. Euphytica，1993，69（1-2）：77-82

［37］姜華，何承剛，畢玉芬，等. 白三葉的組織培養及快速繁殖方法：中國，CN106718886A［P］. 2017-05-31

［38］彭燕，賈彤，程碧真，等. 一種農桿菌介導白三葉愈傷組織遺傳轉化方法：中國，CN114921490A［P］. 2022-08-19

［39］韓陽，林景峰，孫淑華，等. 白三葉高頻組織培養再生體系的研究［J］. 遼寧大學學報（自然科學版），2015，42（3）：258-262

［40］梁慧敏，周興元，韓鵬，等. 一種通過沿階草種子組培快繁種苗的方法：中國，CN109362571A［P］. 2019-02-22

［41］梁慧敏，杜雪玲，夏陽，等. 沿階草體細胞胚誘導及快繁技術研究［J］. 安徽農業科學，2021，49（24）：136-140

［42］丁久玲，鄭凱. 矮生沿階草莖尖離體培養及其植株再生［J］. 江蘇農業科學，2017，45（20）：173-175

［43］位明君，王萌，范希峰，等. 青綠苔草（Care breviculmis）愈傷組織誘導與再生體系的建立［J］. 草地學報，2022，30（8）：2053-2057

［44］王華宇，何貴整，陳乃明，等. 金葉苔草標準化繁育技術研究［J］. 上海農業學報，2013，29（4）：64-67

［45］陳建華，黃建榮，沈勤. 一種金葉苔草的培育方法：中國，CN102293151B［P］. 2013-03-06

［46］葉曉青，佘建明，賈新平，等. 百喜草體細胞耐鹽突變體篩選技術研究［J］. 江蘇農業學報，2012，28（6）：1247-1252

［47］SALENG K，NIIMI M，AKASHI R，et al. Chemical composition and in vitro digestibility of bahiagrass （Paspalum notatum Flugge） regenerated from suspension culture［J］. Bulletin of the Faculty of Agriculture，Miyazaki University，2004，50（1/2）：25-30

［48］CHEN L，ANAMI E，GUAN L，et al. Somatic embryogenesis and plant regeneration from leaflets of \"Nanou\" Bahiagrass［J］. Plant Biotechnology，2017，18（2）：119-123

［49］付金民，徐筱. 一種飼用狗牙根遺傳轉化的方法：中國，CN202011412476.8［P］. 2022-06-10

［50］彭麒文. 狗牙根CdMYB59基因的功能分析［D］. 廣州：華南農業大學，2017：34

［51］ZHANG S，HANNA W，OZIAS-AKINS P. Comparison of callus induction and plant regeneration from different explants in triploid and tetraploid turf-type bermudagrasses［J］. Plant Cell Tissue and Organ Culture，2007，90（1）：71-78

［52］LU S，WANG Z，PENG X，et al. An efficient callus suspension culture system for triploid bermudagrass （Cynodon transvaalensis × C. dactylon） and somaclonal variations［J］. Plant Cell Tissue and Organ Culture，2006，87：77-84

［53］向佐湘，劉明稀. 假儉草胚性愈傷組織分化及再生植株的變異研究［J］. 中國草地學報，2012，34（1）：65-71

［54］舒必超，劉衛東，趙坤，等. 假儉草莖段愈傷組織的誘導及植株再生［J］. 中南林業科技大學學報，2011，31（3）：169-173，196

［55］馬生健，魯澤東，曾富華，等. 假儉草（Eremochloa ophiuroides（Munro.） Hack）的高效組織培養再生體系的建立［J］. 分子植物育種，2019，17（19）：6461-6468

［56］MA J J，WANG Y，ZONG J Q，et al. High-efficiency plant regeneration from immature inflorescence derived callus cultures of two phenotypically distinct accessions of Centipedegrass （Eremochloa ophiuroides）［J］. International Journal of Agriculture and Biology，2018，20（2）：375-381

［57］李建建，馬晶晶，劉建秀，等. 一種以幼穗為外植體建立假儉草高效再生體系的方法：中國，CN201610926203.2［P］.2020-08-14

［58］李麗菁，張娜，張智韋，等. 利用CRISPR/Cas9系統編輯日本結縷草ZjSGR基因技術研究［J］. 草業科學，2020，37（5）：864-871

［59］趙俊俠，陳耕，夏桂先，等. 結縷草高效再生體系的建立［J］. 山西農業科學，2019，47（6）：970-972，1033

［60］王凱，汪毅，曲愛愛，等. 溝葉結縷草遺傳轉化體系的建立［J］. 熱帶作物學報，2020，41（8）：1566-1573

［61］吳艷歌，畢波，柴明良. 細胞分裂素對溝葉結縷草愈傷組織生長及其抗氧化系統的影響［J］. 核農學報，2016，30（7）：1288-1295

［62］袁彬鴻. 野牛草組織培養和植株再生體系的建立［D］. 北京：中國農業大學，2005：27-29

［63］FEI S Z，RIORDAN T，READ P. Stepwise decrease of 2，4-D and addition of BA in subculture medium stimulated shoot regeneration and somatic embryogenesis in buffalograss［J］. Plant Cell Tissue and Organ Culture，2002，70（3）：275-279

［64］李瑞芬，孫振元，魏建華，等. 野牛草幼穗愈傷組織的誘導及植株再生［J］. 武漢植物學研究，2004，22（5）：449-454

［65］王猛，李曉旭，張箏，等. 馬蹄金（Dichondra repens Forst）組織培養和快速繁殖［J］. 分子植物育種，2020，18（10）：3331-3340

［66］李濤，何婧，李名揚. 馬蹄金組織培養與植株再生［J］. 中國園藝文摘，2010，26（2）：1-5

［67］陳智勇. 外源基因轉化冷季型草坪草培育抗除草劑、抗旱新種質的研究［D］. 長沙：湖南農業大學，2006：18

［68］AHN B J，HUANG F H，KING J W. Plant regeneration through somatic embryogenesis in common bermudagrass tissue culture［J］. Crop Science，1985，25（6）：1107-1109

［69］AHN B J，HUANG F H，KING J W. Regeneration of bermudagrass cultivars and evidence of somatic embryogenesis［J］. Crop Science，1987，27（3）：594-597

［70］李春秀莉，王英平，王琪，等. 植物原生質體再生機制研究進展［J］. 分子植物育種，2023，1-8

［71］寧曉春，高思丹，楊莉娜，等. 黑果枸杞原生質體培養及植株再生［J］. 西北植物學報，2021，41（11）：1825-1833

［72］VASIL V，VASIL I K. Isolation and culture of cereal protoplasts. Part 2：Embryogenesis and plantlet formation from protoplasts of Pennisetum americanum［J］. Theoretical and Applied Genetics，1980，56（3）：97-99

［73］NIELSEN K A，LARSEN E，KNUDSEN E. Regeneration of protoplast-derived green plants of Kentucky blue grass （Poa pratensis L.）［J］. Plant Cell Reports，1993，12（10）：537-540

［74］陳發棣，趙宏波，房偉民，等. 菊科植物原生質體研究進展［J］. 西北植物學報，2005，25（9）：1913-1920

［75］INOKUMA C，SUGIURA K，CHO C，et al. Plant regeneration from protoplasts of Japanese lawngrass［J］. Plant Cell Reports，1996，15（10）：737-741

［76］ZAGHMOUT O M，TORELLO W A. Isolation and culture of protoplasts from embryogenic suspension cultures of red fescue （Festuca rubra L.）［J］. Plant Cell Reports，1990，9（6）：340-343

［77］劉思妤，楊悅，王鷹，等. 北細辛懸浮培養體系的建立及優化［J］. 草業科學，2017，34（11）：2254-2260

［78］KASPERBAUER M J，EIZENGA G C. Tall fescue doubled haploids via tissue culture and plant regeneration［J］. Crop Science，1985，25（6）：1091-1095

［79］MINUTOLO M，CHIAIESE P，DI MATTEO A，et al. Accumulation of ascorbic acid in tomato cell culture：influence of the genotype，source explant and time of in vitro cultivation［J］. Antioxidants，2020，9（3）：222

［80］LEE MH，LEE J，JIE EY，et al. Temporal and spatial expression analysis of shoot-regeneration regulatory genes during the adventitious shoot formation in hypocotyl and cotyledon explants of tomato （CV. Micro-Tom）［J］. International Journal of Molecular Sciences，2020，21（15）：5309

［81］LONG Y，YANG Y，PAN G，et al. New insights into tissue culture plant-regeneration mechanisms［J］. Frontiers in Plant Science，2022，13：926752

［82］陳陽，孫華山，金一鋒，等. 不同激素對四種草地早熟禾種子愈傷組織的誘導［J］. 北方園藝，2018，（21）：66-71

［83］支大英，韓曉光，趙軍勝，等. 8種基因型的高羊茅的組織培養與植株再生［J］. 山東大學學報（理學版），2004，39（4）：109-114

［84］MAHMOOD I，RAZZAQ A. Responses of explant type of wheat （Triticum aestivum L.） genotypes to different tissue culture media［J］. Journal of the National Science Foundation of Sri Lanka，2017，45（3）：265-271

［85］FLINN B，DALE S，DISHAROON A，et al. Comparative analysis of in vitro responses and regeneration between diverse bioenergy Sorghum genotypes［J］. Plants （Basel），2020，9（2）：248

［86］MURASHIGE T，SKOOG F. A Revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures［J］. Physiologia Plantarum，1962，15（3）：473-497

［87］SIMONOVIC′ A D，M TRIFUNOVIC′-MOMC′ILOV M，FILIPOVIC′ B K，et al. Somatic embryogenesis in Centaurium erythraea Rafn-current status and perspectives：A review［J］. Plants （Basel），2020，10（1）：70

［88］SCHWARZ O J，BEATY R M. “Organogenesis”，in plant tissue culture concepts and laboratory exercises［M］. Oxford，UK：Routledge，2018：125-138

［89］DRA B，PTER B，KASZLER N，et al. Timely removal of exogenous cytokinin and the prevention of auxin transport from the shoot to the root affect the regeneration potential of Arabidopsis roots［J］. Plant Cell Tissue and Organ Culture，2019，140：327-339

［90］WANG W，ZHAO X，ZHUANG G，et al. Simple hormonal regulation of somatic embryogenesis and/or shoot organogenesis in caryopsis cultures of Pogonatherum paniceum （Poaceae）［J］. Plant Cell Tissue and Organ Culture，2008，95（1）：57-67

［91］B ABUK，M ZGEN. The effect of different 2，4-D doses on callus induction and chromosomal structure in maize （Zea Mays L.）［J］. Infection，2016，2：188-194

［92］CORTLEVEN A，LEUENDORF J E，FRANK M，et al. Cytokinin action in response to abiotic and biotic stresses in plants［J］. Plant Cell Environment，2019，42（3）：998-1018

［93］郭伶娜，劉建文，麻冬梅，等. 不同濃度激素配比對高羊茅再生體系建立的影響［J］. 草地學報，2015，23（3）：517-525

［94］周認，蔡宇，林恬逸，等. 模擬干旱脅迫下褪黑素和表油菜素內酯對溝葉結縷草長期繼代培養愈傷組織再生的影響［J］. 浙江大學學報（農業與生命科學版），2022，48（1）：36-44

［95］BAI Y，QU R. Factors influencing tissue culture responses of mature seeds and immature embryos in turf-type tall fescue［J］. Plant Breeding，2001，120（3）：239-242

［96］代小梅，孫振元，韓蕾，等. 多年生黑麥草愈傷組織誘導及檸檬酸對其褐化的抑制效應［J］. 核農學報，2015，29（10）：1893-1900

［97］張梅，楊燕，盛鵬，等. 植物組織培養中褐化現象控制方法分析［J］. 種子科技，2022，40（3）：91-93

［98］吳浩然，張從合，王慧，等. 水稻愈傷組織褐化的機理及影響因素研究進展［J］. 現代農業科技，2023，835（5）：21-25

［99］AKASAKA-KENNEDY Y，YOSHIDA H，TAKAHATA Y. Efficient plant regeneration from leaves of rapeseed （Brassica napus L.）：the influence of AgNO3 and genotype［J］. Plant Cell Reports，2005，24（11）：649-654

［100］錢永強. 野牛草成熟胚愈傷組織褐化誘因及其離體植株再生研究［D］. 北京：北京林業大學，2005：39

［101］林輝鋒，周輝明，周建金，等. 荸薺的組織培養和快速繁殖探討［J］. 浙江農業科學，2011（6）：1241-1243

［102］CAI X，WEI H，LIU C，et al. Synergistic effect of NaCl pretreatment and PVP on browning suppression and callus induction from petal Explants of Paeonia lactiflora Pall. 'Festival Maxima'［J］. Plants （Basel），2020，9（3）：346

［103］熱娜古麗·吐魯洪，惠浩亮，劉甜甜，等. 植物組織培養中褐變和玻璃化及污染的治理研究［J］. 黑龍江農業科學，2019（11）：154-157

［104］趙一鳴，隋寶鳳，張欣燕，等. 組織培養中玻璃化現象的研究進展［J］. 國土與自然資源研究，2019，（6）：68-74

［105］TIAN J，CHENG Y，KONG X，et al. Induction of reactive oxygen species and the potential role of NADPH oxidase in hyperhydricity of garlic plantlets in vitro［J］. Protoplasma，2017，254（1）：379-388

［106］BAKIR Y，ELDEM V，ZARARSIZ G，et al. Global transcriptome analysis reveals differences in gene expression patterns between nonhyperhydric and hyperhydric peach leaves［J］. Plant Genome，2016，9（2）：1-9

［107］IVANOVA M，VAN STADEN J. Natural ventilation effectively reduces hyperhydricity in shoot cultures of Aloe polyphylla Schonland ex Pillans［J］. Plant Growth Regulation，2010，60（2）：143-150

［108］ZD′ARSKA M，ZATLOUKALOVA P，BENITEZ M，et al. Proteome analysis in arabidopsis reveals shoot- and root-specific targets of cytokinin action and differential regulation of hormonal homeostasis［J］. Plant Physiology，2013，161（2）：918-930

［109］TEIXEIRA DA SILVA J A，DOBRNSZKI J，ROSS S. Phloroglucinol in plant tissue culture［J］. In Vitro Cellular and Developmental Biology-Plant，2013，49（1）：1-16

［110］白一葦，張世壯，王雁楠，等. 植物組織培養中抗污染培養基新配方的探索［J］. 中國農學通報，2021，37（6）：89-96

［111］LI W，CAO G，ZHU M，et al. Isolation，Identification and Pollution Prevention of Bacteria and Fungi during the Tissue Culture of Dwarf Hygro （Hygrophila polysperma） Explants［J］. Microorganisms，2022，10（12）：2476

［112］SEPTIANI A H I，KUSMIYATI F，KRISTANTO B A. The effectivity of leaf extract Centella asiatica L. as anti-contaminant in the growth of potato （Solanum tuberosum L.） variety Tedjo MZ tissue culture［J］. Agroteknika，2022，5（1）：60-74

［113］HAYTA S. Leaf transformation in grasses［J］. Nature Plants，2023，9（2）：197-198

［114］WANG N，RYAN L，SARDESAI N，et al. Leaf transformation for efficient random integration and targeted genome modification in maize and sorghum［J］. Nature Plants，2023，9（2）：255-270

［115］DEBERNARDI J M，TRICOLI D M，ERCOLI M F，et al. A GRF-GIF chimeric protein improves the regeneration efficiency of transgenic plants［J］. Nature Biotechnology，2020，38（11）：1274-1279

［116］WANG K，SHI L，LIANG X，et al. The gene TaWOX5 overcomes genotype dependency in wheat genetic transformation［J］. Nature Plants，2022，8（2）：110-117

（責任編輯 閔芝智）

收稿日期：2022-12-30；修回日期：2023-03-26

基金項目：國家自然科學基金（32271763）資助

作者簡介：馬承澤（1997-），男，漢族，山東濟南人，博士研究生，主要從事草坪科學與管理研究，E-mail：mczturf@163.com；*通信作者Author for correspondence，E-mail：liyue2020@cau.edu.cn;02008@cau.edu.cn