矩鐮莢苜蓿與近緣種花苜蓿的DNA條形碼篩選

摘要：為了篩選適于鑒定易混淆種矩鐮莢苜蓿（Medicago archiducis-nicolai）和花苜蓿（M. ruthenica）的DNA條形碼，本研究采集了兩近緣種的113個樣本，對6個候選條形碼序列（通用序列rbcL，psbA-trnH，trnL-trnF，trnK-matK，ITS2和新序列GA3ox1）進行PCR擴增、測序和序列比對，經過barcoding gap分析、wilcoxn檢驗以及構建NJ系統發育樹評價各序列的鑒定能力。結果顯示：6條候選序列的擴增和測序成功率在85%以上；rbcL序列在兩近緣種間不存在變異位點，其余5條候選序列各有不同的種內變異和種間變異；5條候選序列的種間最小遺傳距離均大于種內最大遺傳距離，GA3ox1，ITS2和psbA-trnH序列在種內種間存在明顯的“Barcoding Gap”區域；在候選序列構建的NJ系統進化樹中，利用GA3ox1和psbA-trnH，矩鐮莢苜蓿和花苜蓿均能各自形成單系，但trnL-trnF，trnK-matK和ITS2不能將兩個近緣種區分開。通過分析，我們推薦使用核編碼基因GA3ox1作為鑒定矩鐮莢苜蓿和花苜蓿的首選序列，葉綠體基因psbA-trnH作為輔助條形碼。

關鍵詞：矩鐮莢苜蓿；物種界定；psbA-trnH；GA3ox1；DNA條形碼

中圖分類號：S326 文獻標識碼：A 文章編號：1007-0435（2023）08-2323-11

Screening of DNA Barcodes for Medicago archiducis-nicolai and

Its Relative Medicago ruthenica

WANG Xia， LIU Yan， JIA Xiu-xiu， LI Yong-qiang， FANG Qiang-en*

（College of Pratacultural Sciences， Gansu Agricultural University， Key Laboratory of Pratacultural Ecosystem， Ministry of Education，

Sino-US Research Center for Sustainable Development of Grassland Animal Husbandry， Lanzhou， Gansu Province 730070，

China）

Abstract：In order to screen DNA barcodes suitable for identification of closely related speciesMedicago archiducis-nicolai and M. ruthenica，in this study，PCR amplification，sequencing and sequence alignment were performed out for six candidate barcode sequences （commonly used sequences rbcL，psbA-trnH，trnL-trnF，trnK-matK，ITS2 and a novel sequence GA3ox1） in 113 samples of both species. The identification ability of different sequences was evaluated by barcoding gap analysis，wilcoxn test and NJ phylogenetic tree. The results showed that the amplification rate of six candidate sequences and the success rate of sequencing were more than 85%. There was no variation site in rbcL sequence between the two related species，but the other five candidate sequences had different intraspecific variation and interspecific variation. The minimum interspecific genetic distance of the five candidate sequences was greater than the maximum interspecific genetic distance for both species. There was a significant “Barcoding Gap” between the intraspecific and interspecific for GA3ox1，ITS2and psbA-trnH sequences. In the NJ phylogenetic tree constructed with candidate sequences，both M. archiducis-nicolai and M. ruthenica could form individual monophyletic groups respectively by using GA3ox1 and psbA-trnH，but trnL-trnF，trnK-matK and ITS2 could not distinguish the two related species from each other. In this analysis，we recommend the nuclear coding gene GA3ox1 as a preferred sequence for identification between M. archiducis-nicolai and M. ruthenica，and the chloroplast gene psbA-trnH as the auxiliary barcode.

Key words：Medicago archiducis-nicolai;Species identification;psbA-trnH;GA3ox1;DNA barcoding

矩鐮莢苜蓿（Medicago archiducis-nicolai）及其近緣種花苜蓿（Medicago ruthenica）在我國西北高原地區廣泛分幣，營養豐富，抗逆性強，極具馴化利用價值［1-2］，在青藏高原地區，二者均為常用藏藥，其中矩鐮莢苜蓿（藏名莫桑河）主要功效為健胃消食、強心利尿，花苜蓿（藏名布斯夯）主要用于肺熱咳嗽和退燒止血［3］。二者功效不同，但形態上（花、葉、種子）十分相似，生境及生育期有部分重疊，僅僅通過經典分類學或野外觀察非常容易混淆。常出現“同名異物”現象，導致誤用、混用，給藥材使用造成很大隱患［4-5］。為合理有效利用矩鐮莢苜蓿等藏藥資源，有必要對矩鐮莢苜蓿及其近緣種進行準確分類及鑒定。傳統物種鑒定方法在易混淆近緣種鑒別方面存在很多局限性［6］。DNA條形碼鑒定技術不受植株形態和植株完整性的限制，能直接從分子水平提供鑒別依據，提高鑒別準確性，成為目前物種鑒定和系統發育樹構建的重要手段［7］。

盡管各國植物分類學家都致力于尋找一條能夠對植物進行準確界定的標準DNA條形碼［8］，但由于植物容易發生雜交和網狀進化，同一基因在不同類群中的進化速率可能不同，導致植物條形碼的研究比動物復雜得多［9］。每一條序列在不同科、屬、種中具有不同的鑒別能力，它能否對具體的某一類物種進行鑒定，需要進行針對性的研究［10］。迄今為止，還未發現能夠對所有植物進行準確鑒別的標準條形碼序列［11］。在2009年召開的第三屆和2011年召開的第四屆生命條形碼國際會議上，三個質體區（rbcL，matK和psbA-trnH）加上核糖體DNA內部轉錄間隔區ITS/ITS2，被推薦用作植物的標準條形碼［12-14］。然而，之后的研究發現，對于復雜和密切相關的類群，這些區域往往缺乏足夠的變異，導致物種識別率低［15］。有研究認為，葉綠體非編碼區基因trnL-trnF，沒有選擇壓力，片段長度適中，可用于易混淆種質的鑒定［1］。最新研究發現，赤霉素合成相關基因GA3ox1在解決豆科苜蓿屬（Medicago）植物種間關系時體現出了很高的界定能力［16-18］。采用更多序列作為標準植物條形碼的補充，可以提供更豐富的信息特征，有助于提高分類鑒定的準確性。目前國內外關于矩鐮莢苜蓿及花苜蓿的研究集中于它們的形態、習性、抗性、分布區預測等基礎研究［5，19-20］和分子系統學方面［1-2，17-18，21］，而對于兩近緣種的分子鑒定未見報道。

基于以上背景，本研究選取近年來在分子鑒定中應用最廣的序列rbcL，psbA-trnH，trnL-trnF，trnK-matK，ITS2和新序列GA3ox1，經過擴增、測序、差異分析、barcoding gap分析、wilcoxn檢驗以及NJ系統發育樹評價，探討6個片段對矩鐮莢苜蓿及其近緣種花苜蓿的鑒別能力，以期篩選出最佳的分子鑒定DNA條形碼，為矩鐮莢苜蓿和花苜蓿的快速、準確鑒定及用藥安全提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

在甘肅、青海、四川、寧夏4個省區選取有代表性的矩鐮莢苜蓿和花苜蓿居群進行取樣（表1）。共得到14個居群113個個體，其中矩鐮莢苜蓿10個居群89個樣本，花苜蓿4個居群24個樣本。所有材料經甘肅農業大學方強恩副教授鑒定，收藏于甘肅農業大學植物標本室。

1.2 試驗方法

利用生工提供的試劑盒，按要求步驟提取植物總DNA，于-20℃保存備用。通過文獻查閱及實驗室前期工作中在DNA條形碼通用引物中初步篩選了6對引物，由上海生物工程科技有限公司合成，包含4條葉綠體基因條形碼序列（rbcL，psbA-trnH，trnL-trnF，trnK-matK）與兩條核基因條形碼序列（GA3ox1和ITS2）。其中，trnK-matK 序列長度近2 500 bp，因此加入中間引物進行擴增反應（表2）。

PCR擴增體系：選取總體積25 μL體系，其中加入PCR Master Mix12.5 μL、上下游引物各1 μL、DNA模板2 μL、ddH2O8.5 μL。

擴增程序：95℃預變性 4 min，94℃變性 30 s，退火 1 min，72℃延伸 1 min，35個循環，72℃延伸 10 min（退火溫度見表2）。

電泳及測序：1.5% 瓊脂糖凝膠電泳對擴增產物進行檢測，電泳結束后，取出凝膠放置于成像系統，在紫外光照射下拍照，獲得凝膠電泳圖。將經電泳能顯示單一明亮條帶的PCR擴增產物送至上海生物工程技術服務有限公司進行雙向測序。分別統計擴增成功率和測序成功率。

1.3 數據處理

對所有獲得的DNA序列，首先采用Bioedit［22］軟件讀取序列，并進行剪切和編輯，將峰圖雜亂無序、峰很低的區段刪除，得到拼接后的序列；然后用MEGA 6.0 軟件［23］對所得序列進行比對，最后進行手動校正，獲得標準序列。其中，針對 ITS2序列，需要對序列基于隱馬爾科夫模型（HMMs）進行注釋，去除 5.8 S和 28 S區段，獲得ITS2 間隔區序列［24］。全部序列上傳至GenBank，并獲得對應的登錄號。

將整理好的標準序列利用MEGA 6.0軟件統計片段長度、GC含量、變異位點，然后采用K-2P（Kimura 2-parameter） 距離模型計算其種間、種內遺傳距離；將得到的種間和種內遺傳距離的矩陣導出放入Excel中，用于構建評價種間、種內遺傳距離分布頻度的“Barcoding gap”圖［24］，并利用SPSS19.0軟件［23］，用Wilcoxn signed rank tests進行檢驗比較分析不同序列種內、種間的差異；最后利用MEGA6.0軟件中的近鄰拼接法（NJ）構建系統聚類樹來評價鑒定成功率，bootstrap（1000次重復）檢驗各分支的置信度，Gaps和Missing data采用配對狀態刪除（pairwise deletion）。外類群選擇與矩鐮莢苜蓿近緣屬的草木犀（Melilotus officinalis）（GenBank登錄號：AB546812，MW242013，MW241821，MW242174和Z97687）。

2 結果與分析

2.1 擴增、測序結果及候選序列特征

本試驗113個樣本中，從擴增成功率上來看（表3），ITS2的PCR擴增成功率最高（98.23%），依次是 rbcL序列（97.35%），trnL-trnF序列（96.46%），psbA-trnH序列（95.58%），trnK-matK（93.81%）與GA3ox1序列（93.81%）；測序成功率中，trnL-trnF序列測序成功率最高（99.12%），psbA-trnH和ITS2序列次之（98.23%），rbcL和trnK-matK序列分別為97.35%和95.58%，GA3ox1序列測序成功率最低（85.84%）。PCR擴增成功率和測序成功率都在85%以上，滿足后續試驗要求。

序列的片段長度方面（表3），ITS2序列最短，為220 bp；psbA-trnH序列次之，為378 bp；trnL-trnF序列為583 bp；rbcL序列為566 bp；GA3ox1序列為933 bp；trnK-matK序列最長，達到2 411 bp。

比較不同片段中GC含量，結果顯示psbA-trnH 中GC含量最低，僅為 25.5%；trnK-matK序列中為31%；trnL-trnF序列中為35.6%；GA3ox1中為37.2%；ITS2序列中GC含量最高，為47.1%（表3）。

從變異位點上來看，在rbcL序列上，矩鐮莢苜蓿與花苜蓿所有樣本的序列一致，種內、種間不存在變異位點，不能滿足鑒別要求，將其舍去，不再用于后續分析。

兩物種在trnL-trnF序列上存在10個變異位點（占比1.72%），在psbA-trnH序列上存在3個變異位點（占比0.79%），在trnK-matK上存在16個變異位點（占比0.66%），在GA3ox1序列上存在21個變異位點（占比2.25%），在ITS2序列中只有1個變異位點（占比0.46%），各序列的變異位點數占比由大到小依次為GA3ox1，psbA-trnH，trnL-trnF，trnK-matK，ITS2（表3）。

2.2 候選序列種間和種內遺傳距離

候選序列在矩鐮莢苜蓿及花苜蓿中的種間和種內遺傳距離的最小值、最大值以及平均值進行分析可知（表4），各序列的種內最小遺傳距離的最小值均為0，種內最大遺傳距離中，GA3ox1序列的種內遺傳距離最大（0.003 896），ITS2序列最小（0）；種內平均遺傳距離中，trnL-trnF序列（0.000 981）最大，ITS2序列最小（0）。

分析種間遺傳距離得到，五條候選序列中trnK-matK序列遺傳距離的重要指標（最小值、最大值、平均值）最小，分別為0.001 247，0.001 344，0.001 344，GA3ox1序列最大，依次為：0.012 987，0.017 115，0.015 040。比較結果顯示，各序列的最大種內遺傳距離都小于最小種間遺傳距離（表4）。

2.3 候選序列在種內、種間變異的barcoding gap分析

分析5條候選序列在種間、種內的barcoding gap圖可以得出，GA3ox1，ITS2和psbA-trnH序列在種內和種間的變異分布均呈兩邊分開的狀態，沒有出現重疊區；trnL-trnF序列之間沒有重疊，但也不存在barcoding gap區域；trnK-matK序列在種內種間變異分布重疊區域最多，不存在barcoding gap（圖1）。

2.4 候選序列種內、種間變異的wilcoxn檢驗

對各序列種內種間差異wilcoxn檢驗可以得出，種內變異方面，從大到小排序：trnL-trnFgt;psbA-trnHgt;GA3ox1gt;trnK-matKgt;ITS2；其中，psbA-trnH序列與GA3ox1序列之間差異不具有顯著性，其余各序列間均具有極顯著差異（Plt;0.001）。種間變異方面，從大到小排序：GA3ox1gt;psbA-trnHgt;ITS2gt;trnL-trnFgt;trnK-matK。這5條序列間均差異極顯著（Plt;0.001）（表5，表6），trnL-trnF序列種內變異最大，ITS2序列最小；在種間變異中，GA3ox1序列的變異最大，trnK-matK序列變異最小。

2.5 NJ樹分析

由5條序列分別構建的NJ系統發育樹（Neighbour-joining tree）可以看出（圖2），在trnL-trnF，trnK-matK和ITS2序列構建的NJ樹中，矩鐮莢苜蓿聚成一支，而花苜蓿呈現梳子狀拓撲結構，沒有聚成單獨的一支。psbA-trnH序列和GA3ox1序列中矩鐮莢苜蓿與花苜蓿各自聚成一支，呈現單系性（monophyly），并且分支支持率在psbA-trnH序列中達到99%，在GA3ox1序列中分支支持率為52%（圖2）。

3 討論

DNA條形碼技術是利用標準的基因片段對物種進行快速鑒定的技術［23］，目前已廣泛應用于物種分類和鑒定、系統發育研究和生物多樣性評估等領域［6］。陳士林等［9-11］通過該技術對大量樣本中藥材進行條形碼序列篩選，提出了適合植物鑒定的DNA條形碼技術體系，規范了篩選植物DNA條形碼的技術流程［10-11］。該技術體系已成為目前國內中藥材分子鑒定的主要參考依據［25-26］。本研究也依據這套體系對5個通用條形碼和1條新序列進行篩選，以期找出準確鑒定矩鐮莢苜蓿及其近緣種花苜蓿的最佳序列。由于不同的序列在不同物種中鑒定能力不同，在植物中，尚未發現一條可以對所有物種都具有高鑒別能力的通用條形碼序列。本研究結果顯示，在通用性方面，ITS2擴增率最高（98.23%），GA3ox1和trnK-matK最低（93.81%）。由于序列長度會影響到通用性［23］，本研究中trnK-matK和GA3ox1序列明顯長于其他4條（表3），故擴增率和測序成功率均較低，但仍在85%以上。分析遺傳距離后發現，各序列的種間最小遺傳距離均大于種內最大遺傳距離（表4），其中GA3ox1，ITS2和psbA-trnH序列種內種間存在明顯的Barcoding gap。wilcoxn秩和檢驗結果顯示，GA3ox1序列的種間變異最大，trnL-trnF序列種內變異最大（表5，表6）。經過NJ樹系統發育關系分析，發現GA3ox1和psbA-trnH序列可以區分出矩鐮莢苜蓿與花苜蓿，每個種單獨聚為一支，鑒別率達到100%；但是trnL-trnF，trnK-matK和ITS2未能鑒別出兩個近緣種（圖2）。

ITS2在種間甚至種下分類水平上均具有豐富的系統發育信息，且序列片段短小，易于擴增測序，通用性好，鑒定能力強，在多個科屬植物種間的鑒別能力已得到大量驗證，被推薦為核心條形碼［10-11］。但是在本研究中，ITS2序列并沒有表現出很強的鑒定能力，無法將兩個近緣物種準確鑒定，相反，psbA-trnH序列的鑒定能力很高，達到了100%。這與前人對忍冬（Lonicera japonica）［27］、蓼科（Polygonaceae）植物［28］、廣東省珍稀保護藥用植物［29］等的研究結果一致。psbA-trnH是目前應用最廣泛的質體條形碼，因具有較多變異位點以及高的轉換/顛換比率而適用于近緣物種的鑒別［10］。但其通常具有復雜的分子進化，在某些植物譜系中經常發生逆轉，這樣可能會導致對遺傳分化的高估和系統發育的錯誤分配［7］，因此，不適于用作核心條形碼，常作為輔助條形碼或者與兩個或三個條形碼組合起來使用，以提高物種鑒定率［7］。

本研究發現，新引用的核序列GA3ox1表現出比通用條形碼trnK-matK，trnL-trnF，rbcL以及核心條形碼ITS2更高的鑒別能力，這與Steele［16］、Hu［17］、Chen［18］等人的研究結果一致。很多研究結果均表明，在不同植物類群中通用條形碼的物種鑒定能力是不同的，目前許多核心條形碼仍然存在局限性，這在同屬近緣種鑒定中表現得尤為突出［9］。另外，前人研究表明，矩鐮莢苜蓿與花苜蓿在苜蓿屬闊莢苜蓿組中的親緣關系是最近的［2，17-18］。吳小培等［1］和Chen［18］分別在花苜蓿、矩鐮莢苜蓿種間遺傳結構和我國苜蓿屬系統發育研究中認為，矩鐮莢苜蓿與花苜蓿可能存在不完全的譜系分化或存在雜交漸滲，二者存在十分復雜的種間關系。LIU［30］研究認為，對于兩個近緣種而言，與物種形成相關的基因才是區分它們最好的遺傳標記，因為這類基因分化時間最早，分化更為明顯。因此，當核心條形碼顯示出較低的物種界定能力時，引用一些新的基因片段可能更為有用，例如本研究中的 GA3ox1基因。GA3ox1是一個調控植物高度的單拷貝基因，編碼赤霉素（gibberallin，GA）-3β-羥化酶，通過調控赤霉素生物合成［31-32］，進而影響植物莖、葉的伸長生長等發育性狀［33］。Steele等研究發現［16］，GA3ox1在豆科物種之間存在豐富的變異。他們利用該序列，重新構建了苜蓿屬植物系統發育樹，首次證明GA3ox1是一種能用于分析植物系統發育的核編碼遺傳標記，可用以解決豆科屬間以及屬種間系統發育關系。本研究結果也再次支持了這一觀點。在本研究中，GA3ox1序列的擴展率與通用條形碼trnK-matK相同，達到93.81%，種間變異高于核心條形碼ITS2，物種鑒定率更是優于trnK-matK，trnL-trnF，rbcL和ITS2，達到了100%。

4 結論

矩鐮莢苜蓿和花苜蓿親緣關系很近，形態相似，生境有部分重疊，僅憑形態鑒定在野外難以準確識別。本研究通過對兩近緣物種進行條形碼篩選得到，trnK-matK，trnL-trnF，rbcL和ITS2序列的鑒定能力較弱，psbA-trnH序列和新序列GA3ox1表現出很高的鑒定能力。我們推薦使用核編碼基因GA3ox1作為鑒定矩鐮莢苜蓿和花苜蓿的首選序列，葉綠體基因psbA-trnH作為輔助條形碼，兩者結合能提供更多遺傳信息，從而保證鑒定的準確率。

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（責任編輯 劉婷婷）

收稿日期：2023-02-20；修回日期：2023-04-07

基金項目：國家自然科學基金項目“花苜蓿越冬芽適應青藏高原寒冷脅迫的分子機制” （31760703），甘肅省高校教師創新基金項目“野生特異種質矩鐮莢苜蓿根莖芽抗寒基因篩選與功能分析”（2023A-49）、草業生態系統教育部重點實驗室開放課題“青藏高原特有種矩鐮莢苜蓿的遺傳多樣性與分子譜系地理研究”（KLGE202212）資助

作者簡介：王霞（1999-），女，漢族，甘肅會寧人，碩士研究生，主要從事草地生物多樣性研究，E-mail：18394151945@163.com；*通信作者Author for correspondence，E-mail：fangqen@163.com