蒙農雜種冰草AcdMYB1基因克隆及表達分析

摘要：‘蒙農雜種’冰草（Agropyron cristatum×A. desertorum ‘Hycrest-Mengnong’）具有干草產量高，適口性好，抗逆性強的特點，是中國北方干旱地區建立人工草地的適宜草種。本研究利用同源克隆方法從‘蒙農雜種’冰草中克隆得到的1個MYB類轉錄因子基因（命名為AcdMYB1），對其進行了生物信息學分析和表達分析。結果表明：該基因cDNA序列長度為1 161 bp，包含完整開放閱讀框（ORF）為969 bp，編碼322個氨基酸，具有MYB轉錄因子的保守結構域。AcdMYB1與小麥族的山羊草、普通小麥、野生二粒小麥的同類基因親緣關系最近，序列一致性均在90%以上。組織表達中AcdMYB1基因在穗中的表達量最高，其次為葉、根，莖中表達量最低；在模擬自然干旱脅迫下，能夠顯著降低AcdMYB1的表達水平。煙草亞細胞定位顯示，該蛋白定位于細胞核。本研究為進一步探索‘蒙農雜種’冰草AcdMYB1基因及MYB轉錄因子家族提供了科學依據。

關鍵詞：蒙農雜種冰草；基因克隆；表達分析；MYB轉錄因子

中圖分類號：Q785;Q786 文獻標識碼：A 文章編號：1007-0435（2023）08-2334-09

Cloning and Expression Analysis of the AcdMYB1 Gene from

Agropyron critatum ×A.desertorum ‘Hycrest-Mengnong’

HUANG Xin-tian1， HAN Hui-jie1， LI Yu-chen1， LIU Ya-ling2， ZHANG Ya-rong2， ZHAO Yan1*

（1. College of Grassland， Resources and Environmental Science， Inner Mongolia Agricultural University/ Key Laboratory of Forage

Cultivation， Processing and High Efficient Utilization of Ministry of Agriculture/Key Laboratory of Grassland Resources， Ministry of

Education， Hohhot， Inner Mongolia 010018， China; 2. MenCao Ecology and Environment （Group） Co.，Ltd， Hohhot， Inner Mongolia

010030， China）

Abstract：Agropyron cristatum×A. desertorum ‘Hycrest-Mengnong’ is a pasture variety cultivated by Inner Mongolia Agricultural University and it a tetraploid grass （2n=28） with high hay yield，good palatability and strong resistance to stress. It is a suitable grass species for establishing artificial grassland in arid areas of north China. A MYB transcription factor gene was cloned from A. cristatum×A.desertorum ‘Hycrest-Mengnong’ by homology-based cloning，named as AcdMYB1，the bioinformatics analysis and expression analysis were carried out on. The results showed that a cDNA sequence with a length of 1 161 bp and a maximum open reading frame of 969 bp encoding 322 amino acids，the AcdMYB1 sequence had a conserved domain of MYB transcription factor. AcdMYB1 had a genetic relationship with Aegilops tauschii，Triticum aestivum and Triticum dicoccoides by more than 90% sequence homology. The expression analysis results showed that the expression of AcdMYB1 gene was the highest in the spike，followed by leaves，roots and stems. Under a drought stress，the expression level of AcdMYB1 was significantly reduced. The protein was localized in the nucleus. The study provided a scientific basis for further research on the AcdMYB1 gene and the MYB transcription factor family in A. cristatum×A.desertorum ‘Hycrest-Mengnong’.

Key words：Agropyron critatum×A.desertorum ‘Hycrest-Mengnong’;Gene cloning;Expression analysis;MYB transcription factor

‘蒙農雜種’冰草（Agropyron cristatum×A. desertorum ‘Hycrest-Mengnong’）為全國牧草品種審定委員會審定通過的育成品種（登記號200）［1］，是禾本科小麥族冰草屬多年生疏叢型優良牧草，植株高大整齊，平均株高90～100 cm，分蘗多，葉量大，干草產量6 000～7 500 kg·hm-2，種子產量可達500～700 kg·hm-2。該品種的種子成熟時莖葉仍保持青綠；開花期莖葉粗蛋白含量約12%，家畜適口性好；抗寒、耐旱、抗病性強；是中國北方干旱地區建立人工草地的適宜草種［2-3］。同時，‘蒙農雜種’冰草根系發達，地面蓋度好，是改良沙化退化草地及城鄉綠化、防止水土流失、公路和鐵路護坡的適宜草種，在我國北方干旱地區具有廣泛的應用前景。

MYB轉錄家族具有多種生物學功能，參與調控植物各器官組織的生長發育、生物與非生物脅迫、初生和次生代謝過程及激素應答等［4-5］。很多植物都已鑒定出多個調控干旱脅迫響應的MYB轉錄因子，如白羊草中的BiMYB52、水稻中的OsMYB91和OsMYB6，以及玉米中的Zm2RMYB2和Zm2RMYB8［6-8］。目前，冰草屬中已成功克隆得到了一些抗逆性基因，其中，扁穗冰草（A. cristatum L. Gaertn.）中克隆得到了SNF1/AMPK蛋白激酶超家族耐寒的AcSnRK2.11基因［9］，磷脂酶D（PLD）的AcPLD基因［10］，MYB轉錄因子家族耐旱的ACmyb基因［11］。在蒙古冰草（A. mongolicum Keng）中克隆得到與抗旱相關的基因有半胱氨酸蛋白酶家族的MwCP、MwLhbc1、LEA-4超基因家族中的MwLEA、WRKY轉錄因子家族的AmWRKY1-like，以及MYB轉錄因子家族中耐寒耐旱的MwMYB4基因［12-15］，在長穗偃麥草（A. elongatum）中克隆得到Na+/H+逆向轉運蛋白耐鹽基因AeNHX1［16］。

MYB1基因在植物抗旱中發揮著重要作用，本研究以‘蒙農雜種’冰草為研究材料，從‘蒙農雜種’冰草中克隆得到1個MYB類轉錄因子基因，并對其進行了生物信息學分析，組織特異性分析和干旱脅迫條件下的表達分析，豐富了冰草屬的抗性基因，為‘蒙農雜種’冰草優異基因的挖掘和利用提供有力依據。

1 材料和方法

1.1 植物材料

本試驗選取的植物材料均為‘蒙農雜種’冰草，選取顆粒飽滿的‘蒙農雜種’冰草種子，去除內外稃，放在培養皿里培育至發芽，將發芽的種子播種于無菌培養土中并放置在內蒙古農業大學草原與資源環境學院智能溫室進行單株培養，栽培時間為長日照條件（16 h光照/8 h黑暗），晝夜溫度為28℃/18℃，定期澆水。將植株培養至6-8周時，待所有植株均進入抽穗期后，進行控水干旱脅迫處理，停止給植株澆水，控水時間分別為0（CK），10，15和20 d，于干旱脅迫處理結束后，同時取各處理單株葉片提取總RNA。在植株抽穗期進行組織表達特征分析材料取樣。分別于-80℃冷凍保存，生物學重復3次。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取及反轉錄合成cDNA 將保存的樣品各取100 mg，利用球磨儀器磨樣，使用Trizol（北京全式金生物技術有限公司，ET101-01-V2）提取‘蒙農雜種’冰草葉片總RNA，利用NanoDrop檢測RNA質量，取2 μgRNA反轉錄（北京全式金生物技術有限公司，AW311-02）得到‘蒙農雜種’冰草的cDNA。

1.2.2 目的基因克隆 小麥TaPIMP基因是小麥中發現的MYB家族基因，與AcdMYB1預測序列相似度高，因此根據小麥TaPIMP基因設計引物AcdMYB1-F （ATGGACATGGACAAGGAGTA CTA C）和AcdMYB1-R （GCAGTAAATGTCCTCTAGGCT），送至睿博興科（廣州）合成引物。以‘蒙農雜種’冰草的cDNA為模板進行PCR擴增，PCR反應體系為20 μL，包含cDNA模板1 μL （ng·μL-1），高保真酶PrimeSTAR預混液（TAKARA）（上海金畔生物科技有限公司，R045A）10 μL，上下游引物各1 μL（10 ng·μL-1），ddH2O 7 μL補齊體系。擴增程序為98℃預變性30 s；98℃變性10 s，55℃退火30 s，72℃延伸80 s，30個循環；72℃延伸2 min 16℃保存。膠回收產物利用T載體連接，采用熱激法轉化大腸桿菌感受態DH5α，挑取陽性單菌落，經過菌落以及菌液PCR檢測后送至公司（廣州睿博生物技術有限公司）進行測序。

1.2.3 生物學信息分析 利用NCBI Blast（https：//bL.ast.ncbi.nL.m.nih.gov/BL.ast.cgi）工具對序列進行序列比對，并用MEGA11軟件進行系統進化樹制作，方法采用鄰接法，校驗參數設置為1000；SMART（http：//smart.embL.-heideL.berg.de/）在線工具分析保守結構域；利用ExpasyProtParam tool（https：//web.expasy.org/protparam/）工具分析蛋白質理化性質；利用SOPMA secondary structure prediction method（http：//smart.embl.de/help/smart_about.shtml）在線軟件預測蛋白二級結構；利用SWISS-MODEL（https：//swissmodeL.expasy.org/interactive）在線軟件預測蛋白三級結構［17］。

1.2.4 qRT-PCR分析 利用Primer3.0在線軟件設計qRT-PCR引物Acdactin-F （GATACTCCCTCACAACAACCG），Acdactin-R（GCCACCAATCCAGACACTGT）［18］，AcdMYB1-F （ATAGGCGGCGATCATTA CG），AcdMYB1-R（AATTTCCTTTCATGCACCCTC），送至睿博生科合成。不同組織根、莖、葉、穗的cDNA為模板取0.5 μL，上下引物各0.4 μL，SYBR qPCR Master Mix10 μL（南京諾唯贊生物科技有限公司，Q712-02/03），ddH2O 9.7 μL。反應程序（BIO-RAD CFX connect）：95℃ 30 s；95℃ 5 s；60℃ 30 s；95℃ 15 s；40個循環。使用Excel按照2–ΔΔCT方法計算相對表達量。

1.2.5 亞細胞位置的預測與定位 利用WolF PSORT protein subcellular localization prediction在線工具對AcdMYB1蛋白進行亞細胞定位預測。再構建以1 300為骨架的pCAMBIA1300-AcdMYB1-GFP瞬時表達載體，以空載體GFP作為對照，將構建好的載體pCAMBIA1300-AcdMYB1-GFP及核定位信號（nucle-us localization signal，NLS）RFP融合紅色熒光蛋白的載體共同轉化煙草，48 h左右在共聚焦顯微鏡下觀察熒光信號，最終確定AcdMYB1蛋白的定位情況。

2 結果與分析

2.1 AcdMYB1基因克隆

以‘蒙農雜種’冰草總RNA反轉錄的cDNA為模板，AcdMYB1-F/R為引物擴增得到約為1 000 bp的單一條帶。測序結果顯示，獲得1條長1 161 bp的cDNA序列（圖1），該基因序列最大開放閱讀框（ORF）為969 bp，編碼322個氨基酸，分子量為35 421.63 Da，等電點為5.58（圖2）。該基因編碼的氨基酸序列中丙氨酸和絲氨酸的含量最高，其次是異亮氨酸、天冬氨酸、精氨酸和甘氨酸。脂肪指數為70.53，平均親水性為-0.402，不穩定指數為59.32，AcdMYB1蛋白為親水性不穩定蛋白。經NCBI-Blast軟件比對分析，該序列與R2R3MYB轉錄因子序列一致性較高，并且發現100～143位氨基酸之間具有MYB-DNA-binding結構域（圖3），因此確定克隆得到的基因為R2R3MYB轉錄家族的基因，命名為AcdMYB1。之后利用SOPMA secondary structure prediction method在線軟件預測蛋白二級結構，其中α-螺旋占47.37%，無規則卷曲41.18%，β-折疊4.02%，延伸鏈7.43%，α-螺旋和無規則卷曲占二級結構的主要成分（圖4A）。利用SWISS-MODEL對編碼蛋白的三級結構進行分析，結構與二級結構預測結果相符（圖4B）。利用SMART分析AcdMYB1蛋白的保守結構域，有2個SANT保守結構（分別位于46～96 bp和99～147 bp）和3個低復雜性結構域（Low-complexity domain，LCD），均具有與MYB家族結構相似的結構（圖4C）。

2.2 ‘蒙農雜種’冰草AcdMYB1的系統進化分析

使用MEGA7.0軟件與ITOL軟件對38個MYB基因構建系統進化樹（圖9）。根據進化樹分支，將38個MYB基因劃分為Group1，2，3三類，Group1主要以水稻、小麥、野生二粒小麥的MYB家族基因為主，Group2主要以小麥、中間偃麥草、野生二粒小麥的MYB基因家族為主，Group3主要以小麥的MYB基因家族為主。其中‘蒙農雜種’冰草AcdMYB1基因與大麥HvMYB1、山羊草AtMYB2、野生二粒小麥TdMYB1、水稻OsMYB1等MYB基因聚集在Group2中，但不能與其中任何1個基因聚為同一個分支。與‘蒙農雜種’冰草AcdMYB1同源的物種大多為禾本科小麥族植物。

2.3 AcdMYB1的組織表達特征分析

利用實時熒光定量PCR技術，對AcdMYB1基因于抽穗期在根、莖、葉、穗4個組織中的表達情況進行分析，發現AcdMYB1基因在不同組織中均有表達，但在葉和穗中的表達量相當，分別為根的6.344倍和6.403倍，顯著高于在根（1.102）和莖中的表達，其中在莖中的表達量最低，為根的1.004倍。AcdMYB1基因在不同組織器官中表達量由高到低依次為穗gt;葉gt;根gt;莖（圖7），表明該基因在冰草抽穗期主要調控穗部和葉部的生長發育。

2.4 干旱脅迫下‘蒙農雜種’冰草AcdMYB1的表達特征分析

以不同天數干旱脅迫后的‘蒙農雜種’冰草的cDNA為模板，以Awactin-F/R基因作為內參基因，檢測‘蒙農雜種’冰草在不同干旱脅迫條件下AcdMYB1基因的表達情況。實時熒光定量PCR結果顯示，AcdMYB1基因在0，10，15和20 d干旱脅迫下的相對表達量依次為1.040，0.089，0.139和0.781。在干旱脅迫處理10 d時，AcdMYB1基因相對表達量最低；隨著干旱脅迫時間的增加，在脅迫處理20 d時，其相對表達量與10和15 d表達量相比顯著升高（圖8）。AcdMYB1基因在干旱脅迫20 d內的表達量變化趨勢為先降低再升高，但仍低于對照水平。表達分析結果表明，干旱脅迫對AcdMYB1的表達有明顯的抑制作用。

2.5 ‘蒙農雜種’冰草AcdMYB1蛋白的亞細胞定位

通過煙草瞬時轉染技術對AcdMYB1蛋白進行了亞細胞定位分析，利用激光共聚焦顯微鏡觀察顯示，空載體的GFP熒光呈現彌散的狀態在細胞質和細胞核上都可以觀察到，而在轉入AcdMY1-GFP融合蛋白后，熒光均在細胞核中。亞細胞定位結果表明‘蒙農雜種’冰草AcdMYB1蛋白定位在細胞核中（圖10）。

3 討論

MYB轉錄因子是轉錄家族中最龐大的家族之一，在植物中廣泛存在，主要參與植物次級代謝過程、調節細胞的形態建成、植物激素反應，以及對生物和非生物脅迫的響應等方面發揮重要作用［19］。其中，R2R3-MYB亞家族是植物中發現的最豐富的MYB家族［20］。

本研究從‘蒙農雜種’冰草中克隆得到1個R2R3-MYB類轉錄因子，編碼322個氨基酸，N端含有2個保守SANT結構域，具有螺旋-轉角-螺旋的結構，是典型的R2R3-MYB轉錄因子結構，命名為AcdMYB1。將‘蒙農雜種’冰草AcdMYB1基因與不同物種的序列進行同源比對時，我們發現在系統進化上，該基因與大麥HvMYB1、山羊草AtMYB2親緣關系較近，并且與處于進化樹同一分枝的其他植物的同源蛋白具有相同的保守結構域，由此推測AcdMYB1在功能上可能與大麥HvMYB1、山羊草AtMYB2等具有高度保守性。亞細胞定位結果分析表明，AcdMYB1蛋白定位在細胞核。

蒙古冰草的AmWRKY1-like基因與小麥TaWRKY16基因、蒙古冰草的MwLEA基因與小麥LEA的基因WRAB和Wrab19、蒙古冰草的MwLhcb基因與小麥Lhcb基因的蛋白序列一致性最高，蒙古冰草的MwDREB3基因和山羊草DREB的基因蛋白序列一致性最高［21］。系統進化分析中‘蒙農雜種’冰草的AcdMYB1基因與山羊草的親緣關系最近，這與蒙古冰草同類基因的研究不同，推測其原因可能是‘蒙農雜種’冰草和蒙古冰草為冰草屬中的不同種有關。冰草屬的種存在有二倍體（diploid，2n=2x=14，PP）、四倍體（tetraploid2n=2x=28，PPPP）和六倍體（hexaploid，2n=2x=42，PPPPPP）三種倍性類型。其中以四倍體最為普遍，六倍體罕見。而‘蒙農雜種’冰草染色體組來源于沙生冰草和扁穗冰草，為四倍體物種（2n=2x=28，PPPP），而蒙古冰草染色體組為二倍體物種（2n=2x=14，PP）。所以無論是從形態水平、還是從生化和分子水平來看，雜種冰草和蒙古冰草為冰草屬的兩個遺傳分化較遠的物種［22］。

MYB基因可以參與調節植物各個器官和組織的生長發育過程［23］，相關研究表明，在小麥中，TaMYB31基因在各組織均有較高的表達量［24］。白羊草BiMYB142、BiMYB143基因受干旱脅迫后在根中表達量最高，這兩個基因均通過調控根系發育來抵御干旱脅迫［25］。小麥在干旱脅迫下，TaMYB59基因在根中的表達量高于葉片［26］。水稻耐旱基因OsMYB105主要通過減少葉片失水和提高滲透調節物質含量來提高水稻的抗旱能力［27］，玉米ZmMYB308在玉米不同組織中均有表達，在玉米莖稈中表達量最高，其次是根、雌蕊、雄蕊、葉片，且各組織間的相對表達量有顯著差異［28］。在對‘蒙農雜種’冰草AcdMYB1基因的組織表達分析時，我們發現AcdMYB1基因在各組織中均有所表達，在穗和葉中的表達量明顯高于在根和莖中的表達量，這與上述研究結果一致，AcdMYB1基因主要在生殖器官（花、穗）和葉片中表達。

蛋白質作為基因功能的主要執行者，需要在正確的亞細胞區隔中定位方可正常發揮功能，以維持生物體內多種復雜的生化過程有序高效進行，保證生物體正常生命活動［29-31］。因此，蛋白質亞細胞定位是研究其功能重要的環節之一［32-34］。本研究中亞細胞定位結果表明AcdMYB1蛋白定位于細胞核中，與小麥中的TaMYB59［35］、水稻的OsMYB340［36］以及黃花苜蓿的MfMYB30［37］相類似，因此認為AcdMYB1是一個核蛋白，進入細胞核發揮一定功能。本研究為今后禾本科牧草抗旱性研究以及冰草種質創新提供了理論基礎。

4 結論

本研究成功克隆了‘蒙農雜種’冰草AcdMYB1基因，并對其進行生物信息學分析顯示，AcdMYB1的開放閱讀框969 bp，編碼了322個氨基酸。AcdMYB1序列中具有一個典型的MYB保守結構域。亞細胞定位顯示該蛋白定位于細胞核。表達分析表明‘蒙農雜種’冰草AcdMYB1在穗和葉中表達最高，說明其在穗和葉中發揮作用。在干旱脅迫條件下，AcdMYB1基因表達量先降低后升高，但仍低于對照水平，因此表明干旱脅迫可以抑制AcdMYB1基因的表達。因此，本文為深入研究AcdMYB1基因的功能和開發利用奠定基礎。

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（責任編輯 彭露茜）

收稿日期：2023-02-02；修回日期：：2023-04-26

基金項目：國家自然科學基金（32160326）；內蒙古自治區種業科技創新重大示范工程“揭榜掛帥”項目（2022JBGS0014）;內蒙古自治區直屬高校基本科研業務費種業振興專項（BR22-11-10）資助

作者簡介：黃馨田（1998-），男，漢族，內蒙古烏海人，碩士研究生，主要從事牧草種質創新與遺傳育種研究，E-mail：huangxintian1998@126.com。*通信作者Author for correspondence， E-mail： zhaoyannmg@imau.edu.cn