褐藻多酚提取物對(duì)奶牛瘤胃發(fā)酵性能及主要瘤胃細(xì)菌含量的影響

摘要：本文旨在探究添加褐藻多酚提取物對(duì)奶牛瘤胃體外發(fā)酵和主要瘤胃細(xì)菌含量的影響。以水稻（Oryza sativa L.）秸稈∶豆（Glycine max）粕=6∶4為發(fā)酵底物，試驗(yàn)共分9組，前4組在底物的基礎(chǔ)上分別添加0，125，250，500 μg·mL-1褐藻多酚（Phlorotannin，PT）；后4組在前4組的基礎(chǔ)上添加30 mg聚乙二醇（PEG）。結(jié)果表明：褐藻多酚提取物的添加能夠顯著降低瘤胃pH值和氨態(tài)氮濃度（P＜0.05），促進(jìn)瘤胃發(fā)酵類型的轉(zhuǎn)變，顯著提高了普雷沃氏菌和牛鏈球菌含量，降低瘤胃甲烷短桿菌的含量（P＜0.05）；對(duì)瘤胃發(fā)酵各項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行綜合評(píng)定，無論是否添加PEG，125 μg·mL-1組的多項(xiàng)組合效應(yīng)值（MFAEI）均最高。綜上所述，日糧中添加褐藻多酚提取物為瘤胃發(fā)酵提供了一個(gè)更具酸性的環(huán)境，減少了瘤胃內(nèi)蛋白質(zhì)的分解，具有降低甲烷排放的潛能，且在本試驗(yàn)中褐藻多酚的最佳添加量為125 μg·mL-1。

關(guān)鍵詞：褐藻多酚；瘤胃發(fā)酵；干物質(zhì)降解率；瘤胃細(xì)菌

中圖分類號(hào)：S816.79 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1007-0435（2023）08-2343-09

Effects of Phlorotannins extract on Rumen Fermentation Performance

and Major Rumen Bacteria of Dairy Cow

CHEN Yu-hua， WEI Yuan-hao， JI Hui-min， HUANG Qian-qian*

（Yangzhou University， Yangzhou， Jiangsu Province 225000， China）

Abstract：This study aimed to investigate the effects of Phlorotannins extract on in vitro rumen fermentation and main rumen bacteria in dairy cows. The experiment used rice straw：soybean meal （6∶4） as a fermentation substrate apportioned into eight treatment groups，namely 0，125，250，and 500 μg·mL-1 phlorotannin （PT） supplements and 30 mg polyethylene glycol （PEG） supplementation to the all individual phlorotannin （PT） supplements. The results showed that： The addition of phlorotannins extract significantly decreased pH value and ammonia nitrogen concentration （Plt;0.05） in rumen substances，promoted the transformation of rumen fermentation type，increased Prevotella ruminicola and Streptococcus bovis，and decreased Methanobrevibacter ruminantium （Plt;0.05）. The MFAEI of 125 μg·mL-1 supplement was the highest in all rumen fermentation parameters，regardless of PEG addition or not. In conclusion，dietary supplement of phlorotannins extract provided a more acidic environment for rumen fermentation，consequently to reduce the protein decomposition，and potentially decrease methane emissions. In this experiment，the optimal dosage of phlorotannins supplement was 125 μg·mL-1.

Key words：Phlorotannins;Rumen fermentation;Dry matter degradation rate;Rumen bacteria

近年來，一些化學(xué)添加劑，如抗生素、甲烷抑制劑以及除蟲劑等都被運(yùn)用到反芻動(dòng)物生產(chǎn)中，以達(dá)到提高生產(chǎn)力的目的。生產(chǎn)力的提高卻伴隨著藥物殘留、細(xì)菌耐藥性等問題。因此尋求一種天然、無害、綠色健康的替代品成為當(dāng)下熱點(diǎn)。目前，一些含有精油、單寧、皂苷以及黃酮類的植物次生代謝產(chǎn)物或植物提取物已被證明可以改善瘤胃代謝，減少甲烷產(chǎn)生和蛋白降解，增加瘤胃微生物特定群體的微生物蛋白含量［1-3］。單寧是植物體內(nèi)一類復(fù)雜的次生代謝產(chǎn)物。根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)的不同通常分為水解單寧、縮合單寧和間苯酚單寧三大類。其中水解單寧和縮合單寧存在于陸地植物中，間苯酚單寧存在于海洋植物褐藻中。單寧長(zhǎng)期以來一直被認(rèn)為是飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)日糧中含有適量的單寧不僅可以提高反芻動(dòng)物蛋白利用率和生產(chǎn)性能［4］，還能夠減少甲烷排放［5］，Lazzari等［6］在日糧中添加單寧提取物能顯著降低氨態(tài)氮濃度，因此單寧具有作為綠色、安全的抗生素替代物的潛能。

間苯酚單寧又名褐藻多酚（Phlorotannin，PT），是褐藻門海藻體內(nèi)的次生代謝產(chǎn)物。其基本結(jié)構(gòu)單元是間苯三酚［7］。羥基是決定單寧化學(xué)性質(zhì)和生物學(xué)活性最主要的官能團(tuán)。研究表明單寧對(duì)蛋白的結(jié)合和抑菌能力隨著羥基數(shù)量的增加而增加［8］。何裊裊等［9］發(fā)現(xiàn)褐藻多酚能夠很好地抑制細(xì)菌、真菌以及病毒。王黎等［10］也發(fā)現(xiàn)，褐藻多酚對(duì)沙門氏菌、大腸桿菌、以及枯草桿菌均有顯著的抑制作用。將褐藻等海洋植物作為新型飼料資源進(jìn)行開發(fā)利用，可以有效緩解我國(guó)常規(guī)飼料資源短缺，解決我國(guó)飼料資源有效供應(yīng)的長(zhǎng)期任務(wù)，對(duì)我國(guó)發(fā)展安全高效的節(jié)糧型畜牧業(yè)具有重要意義。目前已有褐藻或其提取物在單胃動(dòng)物上的應(yīng)用，已有研究表明適當(dāng)?shù)暮Ｔ澹?%～5%）能夠增加斷奶仔豬、生長(zhǎng)育肥豬、肉雞、蛋雞的生長(zhǎng)性能［11-12］，但在反芻動(dòng)物的瘤胃發(fā)酵以及微生物方面還鮮有報(bào)道。馬尾藻（Sargassum pallidum）為沿海常見的褐藻類型，包含多種礦物質(zhì)、維生素、氨基酸等，具有豐富的飼用價(jià)值。因此，本文選用馬尾藻提取褐藻多酚，旨在通過體外發(fā)酵的方法探究不同水平的褐藻多酚對(duì)瘤胃發(fā)酵性能以及主要微生物的影響，并篩選出一個(gè)最適添加劑量，為褐藻多酚在動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

新鮮馬尾藻于65℃烘干至恒重后粉碎過篩備用。

主要試劑：福林酚（Folin-ciocalteu）試劑、間苯三酚（GAE）標(biāo)準(zhǔn)品、石油醚（分析純）、氯化銨（NH4Cl）。

主要儀器：賽多利斯BSA124S電子天平、RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠，上海）、多功能臺(tái)式冷凍離心機(jī)（艾本德股份公司Eppendorf，德國(guó)）、1510-02207全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（賽默飛世爾科技公司Thermo Fisher Scientific，美國(guó)）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 褐藻多酚的提取 選取風(fēng)干粉碎后的馬尾藻，石油醚浸泡脫脂，去除石油醚后用80%甲醇提取1.5小時(shí)，期間不斷攪拌，過濾，收集濾液，重復(fù)上述步驟，共計(jì)3次，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮濾液，于-80℃冷凍后凍干，得褐藻多酚粗提物。

1.2.2 多酚的含量測(cè)定 采用Folin-Ciocalteu試劑法測(cè)定樣品中多酚含量，以間苯三酚作為標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)得粗提物中多酚含量為27.82 mg·g-1。

1.2.3 體外發(fā)酵 試驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)管理：選取3頭體重相近、裝有永久性瘤胃瘺管的健康荷斯坦奶牛作為體外發(fā)酵瘤胃液供體，其日糧成分及營(yíng)養(yǎng)水平如表1所示。試驗(yàn)動(dòng)物于揚(yáng)大高郵牧場(chǎng)每日飼喂3次（8：00，14：00和20：00），自由飲水。

（1）每千克預(yù)混料含有：VA 3000000 IU，VD3 85000 IU，VE 1450 IU，煙酸nicotinic acid 550 mg，Cu 780 mg，Mn 930 mg，F(xiàn)e 1200 mg，Zn 3600 mg，Se 21 mg，I 50 mg，Co 12 mg。

（2）產(chǎn)奶凈能為計(jì)算值，其余均為實(shí)測(cè)值。

試驗(yàn)設(shè)計(jì)：以水稻秸稈∶豆粕=6∶4為底物，總質(zhì)量約0.22 g，其營(yíng)養(yǎng)成分見表2。試驗(yàn)共分9組，每組均添加30 mL人工瘤胃培養(yǎng)液，前4組添加：底物+0，125，250，500 μg PT·mL-1，即底物的0%，1.70%，3.41%，6.82%；后4組，在前4組的基礎(chǔ)上再添加30 mg聚乙二醇（PEG）用以消除單寧活性—有研究表明PEG添加量為1.0 mg·mL-1發(fā)酵液［13］；校正組不添加底物和褐藻多酚粗提物。

體外發(fā)酵流程：試驗(yàn)當(dāng)天晨飼前，用導(dǎo)管經(jīng)瘤胃瘺管真空抽取3頭牛的瘤胃內(nèi)容物至預(yù)熱至39℃的容器中，混合均勻后經(jīng)四層紗布過濾，參照Menke［14］的方法配制人工瘤胃營(yíng)養(yǎng)液，用瘤胃液與人工瘤胃營(yíng)養(yǎng)液混勻制成人工瘤胃培養(yǎng)液后進(jìn)行分裝，同時(shí)通入CO2。在培養(yǎng)至0，2，4，6，8，10，12，24，36，48，60小時(shí)各時(shí)間點(diǎn)時(shí)，用氣壓計(jì)插入瓶中，讀取氣壓。

發(fā)酵參數(shù)測(cè)定：試驗(yàn)結(jié)束后，采用pH計(jì)測(cè)定發(fā)酵后的pH值；使用氣相色譜儀測(cè)定乙酸、丙酸、丁酸和總揮發(fā)性脂肪酸（TVFA）含量；氨態(tài)氮（NH3-N）的測(cè)定參考Bouchareb等［15］的苯酚—次氯酸鈉比色法；通過105℃烘干測(cè)定干物質(zhì)降解率（DMD），降解率計(jì)算方法為：

干物質(zhì)降解率（DMD，%）=［（酵前底物重-發(fā)酵后殘?jiān)兀?發(fā)酵前底物重］×100

主要瘤胃微生物數(shù)量測(cè)定：瘤胃微生物總DNA利用天根糞便基因組DNA提取試劑盒（DP328，天根生化科技有限公司TIANGEN，北京）進(jìn)行提取，后用超微量分光光度計(jì)（NanoDrop-1000，賽默飛世爾科技公司Thermo Fisher Scientific，美國(guó)）測(cè)定DNA濃度，將DNA樣品放入-40℃冰箱待測(cè)。

本試驗(yàn)采用熒光定量PCR法對(duì)瘤胃中8種瘤胃細(xì)菌進(jìn)行測(cè)定，分別為瘤胃甲烷短桿菌（Methanobrevibacter ruminantium）、白色瘤胃球菌（Ruminococcus albus）、黃色瘤胃球菌（Ruminococcus flavefaciens）、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌（Fibrobacter succinogenes）、溶纖維丁酸弧菌（Butyrivibrio fibrisolvens）、反芻月形單細(xì)胞菌（Selenomonas ruminantium）、牛鏈球菌（Streptococcus bovis）、普雷沃氏菌（Prevotella ruminicola）。參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)待測(cè)瘤胃細(xì)菌引物，由金唯智公司合成，具體引物序列見表3。

PCR反應(yīng)液與DNA模板混合后使用羅氏lightcyclerRR96和序列檢測(cè)軟件進(jìn)行熒光定量PCR分析，建立20 μL的擴(kuò)增體系，每個(gè)樣品三個(gè)重復(fù)（具體見表4）。熒光定量PCR分析條件：95℃預(yù)變性900 s，95℃變性10 s，60℃退火/延伸20～32 s，72℃延伸10 s，共40個(gè)循環(huán)［23］。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)先用Excel進(jìn)行整理，用2-ΔΔCt進(jìn)行計(jì)算目的菌的相對(duì)含量（ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因），以瘤胃液總菌（Genera Bacteria）為內(nèi)參基因，對(duì)試驗(yàn)組基因進(jìn)行矯正。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel進(jìn)行整理后，采用SPSS20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行雙因素方差分析，并用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，并應(yīng)用多項(xiàng)指標(biāo)綜合指數(shù)（MFAEI）進(jìn)行評(píng)定，Plt;0.01差異極顯著，0.01＜P＜0.05為差異顯著，P＞0.05為差異不顯著。

單項(xiàng)指標(biāo)綜合指數(shù)（SFAEI）=∑ξn=1（A2-A1）/5A3

式中：A1是對(duì)照組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)各指標(biāo)數(shù)值；A2各組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)各指標(biāo)數(shù)值；A3是在A2各個(gè)時(shí)間點(diǎn)總和的平均值。多項(xiàng)指標(biāo)綜合指數(shù)（MFAEI）是每組指標(biāo)的加和值。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加不同水平褐藻多酚提取物對(duì)體外瘤胃干物質(zhì)降解率及產(chǎn)氣量的影響

由表5可知，在未添加PEG的處理中，250 μg·mL-1組的產(chǎn)氣量顯著高于500 μg·mL-1組（P＜0.05）；在添加PEG的處理中，250 μg·mL-1組的產(chǎn)氣量顯著高于0 μg·mL-1組（P＜0.05），與125，500 μg·mL-1組沒有顯著差異。PEG處理對(duì)所有PT添加水平的發(fā)酵液的產(chǎn)氣量無顯著差異。PEG處理和各PT添加組之間發(fā)酵底物的DMD沒有顯著差異。

2.2 添加不同水平褐藻多酚提取物對(duì)體外瘤胃發(fā)酵性能的影響

由表6可知，在添加PEG和未添加PEG兩種處理下，各水平PT的添加組間瘤胃發(fā)酵液pH值均有極顯著差異（P＜0.01），且隨著添加量的增加，pH值逐漸降低；在125和250 μg·mL-1組，添加PEG后瘤胃發(fā)酵液pH值顯著升高（P＜0.05），且兩因素（不同添加水平與不同PEG處理）之間存在極顯著的交互作用（P＜0.01）。在未添加PEG處理下，125，250和500 μg·mL-1組的瘤胃NH3-N濃度均顯著低于0 μg·mL-1組（P＜0.01），且500 μg·mL-1組顯著低于125和250 μg·mL-1組（P＜0.01）。在添加PEG處理下，250和500 μg·mL-1組的瘤胃NH3-N濃度顯著低于0和125 μg·mL-1組（P＜0.01），且500 μg·mL-1組顯著低于250 μg·mL-1組（P＜0.01）。無論是PEG的處理還是PT的添加對(duì)發(fā)酵液TVFA、乙酸、丁酸以及戊酸的濃度均沒有顯著影響。在未添加PEG處理下，500 μg·mL-1組發(fā)酵液的丙酸濃度顯著高于其他三組（P＜0.01），添加了PEG后，各組之間丙酸濃度均無顯著差異。在500 μg·mL-1添加水平下，添加PEG組的發(fā)酵液丙酸濃度顯著下降（P＜0.05）。在添加PEG處理下，500 μg·mL-1組發(fā)酵液的異丁酸濃度顯著低于其他三組（P＜0.01），未添加PEG處理下，500 μgPT·mL-1組發(fā)酵液的異丁酸濃度顯著低于0和125 μg·mL-1組（P＜0.01）。在未添加PEG處理下，500 μg·mL-1組發(fā)酵液的異戊酸濃度顯著低于其他三組（P＜0.01）。在添加PEG后，500 μg·mL-1組發(fā)酵液的異戊酸濃度顯著低于0和125 μg·mL-1組（P＜0.01），與250 μg·mL-1組沒有明顯差異。PEG處理對(duì)各水平PT添加組的異丁酸和異戊酸濃度均沒有顯著影響。

2.3 添加不同水平褐藻多酚提取物對(duì)瘤胃主要細(xì)菌的影響

由表7可知，在未添加PEG處理下，125，250和500 μg·mL-1組發(fā)酵液的M. ruminantium含量較0 μg·mL-1組均顯著降低（P＜0.05），且三個(gè)添加水平之間沒有顯著差異。在添加PEG處理下，125和500 μg·mL-1組發(fā)酵液的M. ruminantium含量顯著高于未添加PEG處理（P＜0.05），且兩因素之間存在極顯著的交互作用（P＜0.01）。未添加PEG處理下，125 和250 μg·mL-1組發(fā)酵液的R. albus含量顯著低于0 μg·mL-1組（P＜0.05），500 μg·mL-1組發(fā)酵液的R. albus含量極顯著低與對(duì)照組（P＜0.01）；添加了PEG后，各水平下R. albus含量無顯著差異，但PT添加水平和PEG處理兩因素之間存在極顯著的交互作用（P＜0.01）。在添加PEG后，500 μg·mL-1組發(fā)酵液的R. albus含量較未添加PEG組顯著升高（P＜0.01），且PT添加水平和PEG處理兩因素之間存在極顯著的交互作用（P＜0.01）。在未添加PEG處理下，R. flavefaciens的含量在500 μg·mL-1時(shí)最高（P＜0.01），添加了PEG后，500 μg·mL-1組發(fā)酵液的R. flavefaciens含量較0和125 μg·mL-1組有顯著提高（P＜0.05），與250 μg·mL-1組沒有顯著差異。未添加PEG處理下，250 μg·mL-1組發(fā)酵液的F. succinogenes含量顯著低于0 μg·mL-1組（P＜0.05），但是125和500 μg·mL-1組與0 μg·mL-1組無顯著差異。添加了PEG后，500 μg·mL-1組發(fā)酵液的F. succinogenes含量顯著高于0、125 μg·mL-1組（P＜0.05）。在0 μg·mL-1水平下，添加PEG組F. succinogenes含量顯著高于未添加組（P＜0.01），且兩因素存在顯著的交互作用（P＜0.05）。未添加PEG處理下，PT的添加對(duì)發(fā)酵液中S. ruminantium以及S. bovis的含量無顯著影響，在添加了PEG后，500 μg·mL-1組發(fā)酵液的兩種菌含量較對(duì)照組顯著提高（P＜0.05）。未添加PEG處理下，250和500 μg·mL-1組發(fā)酵液的P. ruminicola含量較0和125 μg·mL-1組顯著升高（P＜0.01），且500 μg·mL-1組最高；添加了PEG后，500 μg·mL-1組發(fā)酵液的P. ruminicola含量較0和125 μg·mL-1組顯著升高（P＜0.01）。在500 μg·mL-1水平下，添加PEG組的P. ruminicola含量較未添加組顯著降低（P＜0.05），且兩因素之間存在顯著交互作用（P＜0.01）。PEG處理對(duì)不同PT添加水平的發(fā)酵液中R. flavefaciens，F(xiàn). succinogenes，S. ruminantium以及S. bovis均沒有顯著影響。無論是PEG的處理還是PT的添加對(duì)發(fā)酵液B. fibrisolvens含量均無顯著影響。

2.4 添加不同水平褐藻多酚提取物對(duì)瘤胃發(fā)酵參數(shù)影響的綜合評(píng)定

通過對(duì)各項(xiàng)發(fā)酵參數(shù)的綜合評(píng)定發(fā)現(xiàn)，無論是否添加PEG，MFAEI在PT添加水平為125 μg·mL-1時(shí)最高。

3 討論

3.1 添加不同水平褐藻多酚提取物對(duì)體外瘤胃干物質(zhì)降解率及產(chǎn)氣量的影響

干物質(zhì)降解率是衡量動(dòng)物對(duì)飼料的消化能力的一項(xiàng)重要指標(biāo)，本試驗(yàn)在基礎(chǔ)日糧中添加不同梯度的褐藻多酚提取物對(duì)干物質(zhì)降解率沒有影響，說明0～500 μg·mL-1褐藻多酚不會(huì)對(duì)飼料的干物質(zhì)降解率產(chǎn)生負(fù)面作用，Hatami等［24］在羔羊飼養(yǎng)試驗(yàn)中飼喂含3.6 g·kg-1縮合單寧的石榴籽，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)羔羊干物質(zhì)降解率并無影響，這與本研究結(jié)果相一致。

產(chǎn)氣量能夠評(píng)價(jià)飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與可發(fā)酵程度，可發(fā)酵的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)越多，微生物活性越強(qiáng)，產(chǎn)氣量越高，因此在一定程度上，產(chǎn)氣量還能反映瘤胃微生物活躍的大體趨勢(shì)［25］。本試驗(yàn)中在未添加PEG的處理下，添加褐藻多酚提取物的處理組與未添加組差異不顯著，而在添加PEG處理下，250 μg·mL-1組的產(chǎn)氣量顯著高于未添加組。同時(shí)，添加水平為500 μg·mL-1時(shí)，添加PEG組的產(chǎn)氣量顯著高于未添加PEG組，這些結(jié)果表明褐藻多酚提取物一定程度上抑制了發(fā)酵產(chǎn)氣。這也與他人的研究結(jié)果相互印證，Wang等［13］研究發(fā)現(xiàn)在體外添加濃度為0，125，250，500 μg·mL-1的褐藻多酚降低了體外產(chǎn)氣量。Chuzaemi等［26］在底物基礎(chǔ)上添加不同水平的縮合單寧進(jìn)行體外發(fā)酵，結(jié)果發(fā)現(xiàn)縮合單寧的添加對(duì)總產(chǎn)氣量有明顯的抑制作用。

3.2 添加不同水平褐藻多酚提取物對(duì)體外瘤胃發(fā)酵性能的影響

瘤胃發(fā)酵內(nèi)環(huán)境受諸多因素影響，通常包括pH值、氨態(tài)氮、揮發(fā)性脂肪酸（VFA）以及產(chǎn)氣量等。反芻動(dòng)物采食后，飼糧經(jīng)過瘤胃微生物的作用會(huì)轉(zhuǎn)化為大量的有機(jī)酸（揮發(fā)性脂肪酸），導(dǎo)致瘤胃內(nèi)pH值的波動(dòng)。一般來說pH值在5.5～7.0之間，表明瘤胃內(nèi)的環(huán)境趨于穩(wěn)定［27］。在本試驗(yàn)中，瘤胃內(nèi)容物pH值在6.12～6.56之間波動(dòng)，符合前人研究規(guī)律。隨著褐藻多酚提取物添加量的增加，瘤胃內(nèi)容物pH值逐漸降低，且在125和250 μg·mL-1組中，添加PEG后瘤胃發(fā)酵液pH值顯著升高，這表明褐藻多酚是導(dǎo)致褐藻多酚提取物降低pH值的主要原因。王敬堯［28］發(fā)現(xiàn)在添加了單寧后的綿羊的瘤胃pH值沒有顯著變化，并沒有破壞瘤胃環(huán)境的穩(wěn)定性。沈思聰?shù)龋?9］研究結(jié)果表明百脈根縮合單寧對(duì)瘤胃pH值沒有影響。盡管褐藻多酚與陸地單寧有一些相同的特性，但在化學(xué)結(jié)構(gòu)上差異很大［30］，化學(xué)結(jié)構(gòu)的不同會(huì)導(dǎo)致活性的差異，或許這是導(dǎo)致兩者對(duì)瘤胃發(fā)酵pH影響不同的主要因素。

氨態(tài)氮（NH3-N）濃度一定程度上反應(yīng)了瘤胃微生物對(duì)底物氮素的利用程度，是瘤胃微生物利用氮的主要來源［31］。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隨著褐藻多酚提取物添加量的增加，瘤胃NH3-N濃度不斷降低，但PEG處理對(duì)瘤胃NH3-N濃度影響不大，這表明褐藻多酚可能只是導(dǎo)致瘤胃NH3-N濃度降低的原因之一。而有研究發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵底物中加入板栗單寧降低了瘤胃NH3-N濃度［32］。王敬堯等［33］在體外試驗(yàn)中加入1%，2%以及3%的單寧酸，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著發(fā)酵時(shí)間的變化NH3-N濃度均顯著降低。這些試驗(yàn)結(jié)果的差異可能是由于褐藻多酚和陸地單寧的活性不同，因此影響瘤胃NH3-N的吸收的機(jī)制也不同。

反芻動(dòng)物主要以VFA的形式利用碳水化合物，VFA是瘤胃發(fā)酵的重要中間產(chǎn)物，其組成比例及揮發(fā)酸濃度可以直接反映瘤胃代謝水平。乙酸、丁酸主要由粗飼料中的纖維發(fā)酵生成，丙酸是通過糖異生作用合成機(jī)體所需葡萄糖，為機(jī)體提供能量［34］。本試驗(yàn)在添加了500 μg·mL-1后，對(duì)瘤胃乙酸、丁酸含量影響不大，但明顯提高了丙酸含量，且未添加PEG的處理組丙酸水平高于添加PEG組，表明褐藻多酚提取物能在一定程度上提高丙酸含量，促使瘤胃發(fā)酵類型向丙酸發(fā)酵轉(zhuǎn)變。曹雪等［35］在體外發(fā)酵中加入0.1%～0.9%的縮合單寧，結(jié)果發(fā)現(xiàn)降低了乙酸、丁酸含量，并改變了瘤胃發(fā)酵類型，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。異位酸包括異丁酸、異戊酸和2-甲基丁酸，是蛋白質(zhì)降解后的氨基酸（纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸）經(jīng)氧化脫氨基和脫羧基后的產(chǎn)物［36］。在本試驗(yàn)中500 μg·mL-1的褐藻多酚提取物降低了瘤胃中異丁酸和異戊酸的含量，表明褐藻多酚提取物減少了氨基酸的分解，與許多陸地單寧的研究結(jié)果一致。魏歡等［37］在體外發(fā)酵中添加0.05%的鞣花酸降低了異丁酸的含量，張振東等［38］在綿羊飼養(yǎng)試驗(yàn)中飼喂含2%單寧酸的日糧，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著發(fā)酵時(shí)間的增加（0～7 h）與異丁酸和異戊酸的含量顯著降低。

3.3 添加不同水平褐藻多酚提取物對(duì)奶牛瘤胃主要細(xì)菌的影響

反芻動(dòng)物的瘤胃是一個(gè)較為復(fù)雜的厭氧環(huán)境，動(dòng)物攝入的飼糧進(jìn)入瘤胃后，經(jīng)細(xì)菌、原生動(dòng)物、真菌、病毒等組成的瘤胃微生物群落的轉(zhuǎn)化，可以為反芻動(dòng)物提供能量，因此一個(gè)較好的瘤胃微生物群落對(duì)宿主的免疫、維持以及生產(chǎn)至關(guān)重要。R. albus、R. flavefaciens以及F. succinogenes都是纖維降解菌，其中R. albus和R. flavefaciens能產(chǎn)生大量的纖維素酶和半纖維素酶，將纖維分解。F. succinogenes為嚴(yán)格厭氧革蘭氏陰性菌，對(duì)堅(jiān)韌纖維素有強(qiáng)降解能力，能降解R. flavefaciens無法降解的纖維素［39］。Patra等［40］在飼料中添加不同劑量的單寧，發(fā)現(xiàn)對(duì)R. flavefaciens和R. albus無顯著影響，對(duì)F. succinogenes有抑制作用。Bae等［41］研究發(fā)現(xiàn)單寧對(duì)纖維降解菌的生長(zhǎng)有抑制作用。這與本試驗(yàn)結(jié)果不盡相同，在本試驗(yàn)中添加500 μg·mL-1褐藻多酚提取物抑制了R. albus的數(shù)量，促進(jìn)了R. flavefaciens和F. succinogenes的生長(zhǎng)。造成差異的原因可能是與單寧類型有關(guān)。由于R. albus幾乎不產(chǎn)酸［42］，R. flavefaciens和F. succinogenes在參與代謝中可產(chǎn)生大量的琥珀酸，大量的琥珀酸繼而轉(zhuǎn)化為丙酸，這可能是本試驗(yàn)中添加500 μg·mL-1褐藻多酚提取物提高瘤胃丙酸濃度的原因。B. fibrisolvens以及P. ruminicola是瘤胃中主要的蛋白分解菌。本試驗(yàn)中，添加的褐藻多酚提取物對(duì)瘤胃B. fibrisolven并無明顯的抑制或促進(jìn)作用，但隨著添加水平的增加P. ruminicola的數(shù)量逐漸增加，且PEG處理結(jié)果表明這主要是由褐藻多酚引起的。雖然同為蛋白降解菌，但可能是前者對(duì)褐藻多酚提取物的敏感性較差，而P. ruminicola對(duì)褐藻多酚較為敏感，從而引起了細(xì)胞應(yīng)激性生長(zhǎng)，促進(jìn)了菌群含量的提高。這與Yang等［43］的研究結(jié)果一致，這表明褐藻多酚提取物的添加能夠提高P. ruminicola的含量，對(duì)飼糧中的蛋白降解菌有促進(jìn)作用。S. ruminantium和S. bovis為瘤胃內(nèi)主要的乳酸型發(fā)酵菌，能發(fā)酵淀粉、乳酸，產(chǎn)生乙酸、丙酸，為糖異生提供前體［44］。Wang等［45］研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)多酚的添加能夠刺激S. ruminantium、S. bovis的生長(zhǎng)。這與本試驗(yàn)研究結(jié)果大體一致，在添加不同水平的褐藻多酚提取物后，S. ruminantium并未受影響，S. bovis含量較未添加PEG組有提高的趨勢(shì)，與前文中丙酸增加的結(jié)果相呼應(yīng)。M. ruminantium能夠?qū)暳现械挠袡C(jī)或無機(jī)質(zhì)轉(zhuǎn)化為甲烷和二氧化碳，降低飼料利用率［46］。黃祥源等［47］發(fā)現(xiàn)在瘤胃發(fā)酵底物中加入3%，5%，7%和9%的單寧分別降低了45%，26%，44%和29%的M. ruminantium。這與本試驗(yàn)結(jié)果相一致，本試驗(yàn)中添加褐藻多酚組瘤胃M. ruminantium含量明顯低于對(duì)照組，且相同添加水平下，未添加PEG組的M. ruminantium含量顯著高于添加組，這可以表明褐藻多酚對(duì)M. ruminantium有明顯的抑制作用，具有降低甲烷排放的潛能。

4 結(jié)論

日糧中添加120，250以及500 μg·mL-1的褐藻多酚提取物能夠降低瘤胃pH值和NH3-N濃度，為瘤胃發(fā)酵提供了一個(gè)更具酸性的環(huán)境，并抑制了瘤胃內(nèi)蛋白質(zhì)的降解；同時(shí)褐藻多酚提取物提高了瘤胃內(nèi)P. ruminicola和S. bovis的數(shù)量；500 μg·mL-1的添加水平下增加了瘤胃內(nèi)R. flavefaciens和F. succinogenes的數(shù)量，提高了丙酸含量，促進(jìn)瘤胃發(fā)酵類型的轉(zhuǎn)變，降低了異丁酸、異戊酸的含量，減少了氨基酸的分解。褐藻多酚顯著降低了瘤胃內(nèi)M. ruminantium的數(shù)量，表明其有降低甲烷排放的潛能。本試驗(yàn)中體外發(fā)酵中褐藻多酚的最適添加量為125 μg·mL-1。

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（責(zé)任編輯 劉婷婷）

收稿日期：2023-02-06；修回日期：2023-03-17

基金項(xiàng)目：財(cái)政部和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部：國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS36）；國(guó)家自然科學(xué)基金（31902191）共同資助

作者簡(jiǎn)介：陳譽(yù)華（1996-），女，漢族，江蘇南通人，碩士研究生，從事植物提取物的開發(fā)與利用研究，E-mail：Ovaltine0930@163.com；*通信作者Author for correspondence，E-mail：huangq0315@126.com