生肌愈瘍膏外用干預壓力性潰瘍作用機制網絡藥理學研究

【摘要】 目的：本課題旨在通過網絡藥理學手段，對“生肌愈瘡膏”外敷治療壓力性潰瘍的機制進行探討。方法：采用現代中醫藥理論與技術，以中藥為研究對象，采用DisGeNET、GeneCards、Human孟德爾基因編輯技術等技術，對其進行深入研究，尋找其可能的藥效物質基礎與作用靶標。采用Cytoscape 3.9.1軟件，建立“藥效-成分-靶點-病變”的藥效關系，利用STRING數據庫，建立“靶蛋白-效應關系”的效應關系，并利用DAVID數據，對“藥效關系”的信號途徑進行富集分析。結果：經網絡拓撲分析，木犀草素（MOL000006）、毒扁豆次堿（MOL013287）、山奈酚（MOL000422）、槲皮素（MOL000098）、黃芩素（MOL002714）、漢黃芩素（MOL000173）是生肌愈瘍膏干預壓力性潰瘍的主要有效成分。生肌愈瘍膏外用可能通過調控PTGS1、PTGS2、SCN5A、AR等基因，介導糖尿病并發癥AGE-RAGE信號通路、動脈粥樣硬化通路和癌癥通路等通路干預壓力性潰瘍。結論：生肌愈瘍膏可通過調控多靶點、多通路發揮抗炎、抗氧化、促進血管新生等方面促進壓力性潰瘍創面的愈合。

【關鍵詞】 網絡藥理學 生肌愈瘍膏 壓力性潰瘍 信號通路 作用靶點

A Network Pharmacological Study on the Mechanism of Topical Intervention of Pressure Ulcers with Shengji Yuyang Ointment/XUE Tianyin， SHAO Yufang， SUN Qing. //Medical Innovation of China， 2023， 20（26）： -174

[Abstract] Objective： The aim of this project was to investigate the mechanism of the Shengji Yuyang Ointment topical treatment of pressure ulcers by means of network pharmacology. Method： Using modern Chinese medicine theories and techniques， DisGeNET， GeneCards， and Human Mendelian gene editing techniques were used to investigate the possible pharmacological bases and targets of the Chinese medicine. Cytoscape 3.9.1 software was used to establish the pharmacodynamic relationship of \"pharmacodynam-ic-component-target-lesion\"， STRING database was used to establish the effect relationship of \"target protein-effect relationship\"， and DAVID data was used to enrich the signal pathways of \"pharmacodynamic relationship\". Result： By network topology analysis， Lignan （MOL000006）， Poisonous Lentil Hypocretin （MOL013287）， Kaempferol （MOL000422）， Quercetin （MOL000098）， and Baicalein （MOL002714）， Wogonin （MOL000173） were the main active ingredients of the Shengji Yuyang Ointment to intervene in pressure ulcers. The topical application of Shengji Yuyang Ointment may interfere with pressure ulcers by regulating PTGS1， PTGS2， SCN5A， AR and other genes and mediating AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications， atherosclerotic pathway and cancer pathway. Conclusion： Shengji Yuyang Ointment can promote the healing of pressure ulcer wounds by modulating multiple targets and pathways， such as an-ti-inflammation， antioxidation and promotion of vascular renewal.

[Key words] Network pharmacology Shengji Yuyang Ointment Pressure ulcer Signaling pathway Target of action

First-author's address： The First Clinical School of Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan 250014， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2023.26.040

臥床患者由于身體長期處于平臥位且長時間無法活動，導致局部皮膚和/或皮下組織因受壓而持續性缺血缺氧形成的局部損傷，即壓力性潰瘍（pressure ulcer，PU）[1]。不同程度的壓力性潰瘍有不同的特點，壓力性潰瘍部位及周圍組織易出現缺血再灌注損傷、細菌感染，治療難度極大[2]。

壓力性潰瘍在醫院中高發。壓力性潰瘍會給患者帶來痛苦，并降低生活質量，甚至出現感染從而危及生命。壓力性潰瘍采用外治為主，配合內治，積極治療全身疾病的治則治法對不同壓力性潰瘍的證型進行治療，均取得了明顯效果，說明中醫藥在壓力性潰瘍的治療上有著悠久的歷史和獨特的優勢[3-4]。

生肌愈瘍膏是濟南市中醫醫院自制外用劑[5-8]，由紫草、大黃、當歸、地榆、側柏葉、黃芩、虎杖組成，壓力性潰瘍治療的效果已經確定，但其作用機制尚未完全明了，本研究目的是通過網絡藥理學方法預測生肌愈瘍膏干預壓力性潰瘍的有效活性成分及關鍵靶點，并分析其潛在作用機制，為中醫藥治療壓力性潰瘍的領域提供新方向。

1 資料與方法

1.1 生肌愈瘍膏活性藥物成分篩選

運用TCMSP數據庫，對紫草、大黃、當歸、地榆、側柏葉、黃芩、虎杖的所有成分數據進行挖掘。以口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18為篩選條件，對收集到的成分進行藥動力信息檢索。

1.2 生肌愈瘍膏活性化學成分靶點與壓力性潰瘍潛在靶點的獲取及收集

登陸UniProt Knowledgebase（UniProt KB），將初步得到的蛋白質靶點轉化為標準的基因名稱。在OMIM數據庫、DisGeNET數據庫、GeneCards數據庫中查找數據，搜集壓力性潰瘍的潛在靶點。使用Venny 2.1.0繪制生肌愈瘍膏和壓力性潰瘍的交集靶點。

1.3 生肌愈瘍膏-壓力性潰瘍靶點核心網絡的篩選

使用Cytoscape 3.9.1軟件構建“藥物-成分-靶點-疾病”關系網絡。以網絡節點度值（degree）和中介中心度（betweenness centrality）為篩選條件，獲得生肌愈瘍膏干預壓力性潰瘍的關鍵成分和關鍵靶點。

1.4 生肌愈瘍膏-壓力性潰瘍蛋白互作網絡分析

將1.3獲得的關鍵靶點導入STRING數據庫，設定“物種”為人類（homo sapiens），評分分值gt;0.9進行篩選，構建PPI網絡。

1.5 GO功能及KEGG通路富集分析

將1.3獲得的關鍵靶點導入DAVID數據庫進行信號通路富集分析，并進行可視化分析。

2 結果

2.1 生肌愈瘍膏活性成分分析

根據OB≥30%且DL≥0.18為條件對復方成分進行篩選，最終確定生肌愈瘍膏中所含藥物的活性有效成分67個，結果見表1。

2.2 生肌愈瘍膏干預壓力性潰瘍的潛在作用靶點預測

通過檢索TCMSP數據庫、UniProt數據庫及靶點模型預測，匯總并去重后，共得到226個得到核心藥物的作用靶點。從GeneCards數據庫獲得PU靶點5 894個，利用中位數進行篩選，結合OMIM數據庫和DisGeNET數據庫檢索獲得的相關靶點，匯總去重最終得到2 954個壓力性潰瘍相關靶點。將生肌愈瘍膏有效成分相關的靶點和壓力性潰瘍疾病靶點取交集，獲得交集基因153個（圖1）。

2.3 藥物-成分-靶點-疾病網絡構建

利用Cytoscape 3.9.1軟件對生肌愈瘍膏干預壓力性潰瘍的作用靶點進行分析，得到網絡關系圖，見圖2。

2.4 藥物-疾病靶點PPI

把交集靶點上傳STRING數據庫，得到PPI網絡，見圖3。導入Cytoscape軟件并運用cyto Hubba插件，以網絡節點度值為基準，獲得度值排名前10的核心靶點，并構建網絡圖，見圖4，篩選后木犀草素（MOL000006）、槲皮素（MOL000098）、山奈酚（MOL000422）、毒扁豆次堿（MOL013287）、漢黃芩素（MOL000173）、黃芩素（MOL002714）、前列腺素G/H合成酶1（PTGS1）、前列腺素G/H合成酶2（PTGS2）、雄激素受體（AR）、心臟鈉通道基因（SCN5A）等靶點度值較高。

2.5 GO功能及KEGG通路富集分析

將獲得的交集靶點導入DAVID數據庫進行GO功能富集分析。GO注釋結果的前5個生物學功能主要為氧含量反應、氮化合物反應、外來事物刺激反應、有機刺激反應、脂多糖反應（圖5）。KEGG通路富集結果癌癥通路、脂質和動脈粥樣硬化通路與糖尿病并發癥AGE-RAGE信號通路等通路是主要信號通路，見圖6。

3 討論

3.1 生肌愈瘍膏治療壓力性潰瘍的主要有效成分

經網絡拓撲分析表明，生肌愈瘍膏干預壓力性潰瘍的主要有效成分可能是木犀草素（MOL000006）、槲皮素（MOL000098）、山奈酚（MOL000422）等成分。槲皮素（Quercetin）是一種具有多種生物學活性，且藥理學作用廣泛的黃酮類化合物，它不僅能夠抗氧化及清除自由基，且在抗炎、抗病毒、抗腫瘤、降糖及免疫調節等方面起重要作用[9]。研究顯示，槲皮素可抑制LPS誘導小鼠細胞分泌炎癥因子，從而保護內皮細胞，促進血管的修復[10]。另有研究表明，槲皮素通過清除氧自由基、鰲合金屬離子、抑制ox-LDL引起的氧化損傷及提高抗氧化酶活性來維持氧化平衡表達，改善細胞膜的過氧化損傷，維持胞內氧化平衡，促進細胞的存活[11]。體內過氧化物的聚集會加快細胞凋亡，損傷機體微血管發，加重創面[12]。因此槲皮素抗氧化作用可以為肉芽組織生長和創面恢復提供良好的環境。山奈酚（Kaempferol）是一種黃酮類化合物，抗炎、抗氧化作用顯著[13]。研究發現，核因子E2相關因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2）能夠保護細胞免受氧化損傷，而山奈酚能使Nrf2的表達上調，進而減輕細胞氧化應激損傷，提高對氧化損傷的保護作用[14]。活性氧可以影響相關功能蛋白的合成從而加速細胞凋亡。有學者發現，山奈酚可以降低活性氧水平，對抗活性氧介導的細胞凋亡作用，降低細胞凋亡率，恢復內皮細胞的活力，有助于血管的生成[15]。木犀草素（Luteolin）是一種黃酮類化合物，具有抗氧化、神經保護等多種藥理作用[16]。木犀草素能夠對轉錄激活因子3、核轉錄因子-κB和激活蛋白-1等轉錄因子的調節發揮抗炎作用，并改變炎癥中涉及的各種信號通路[17]，并且木犀草素可通過調節炎癥因子的活性，從而降低炎癥介質的產生發揮抗炎作用[18]，壓力性潰瘍的創面經久不愈，可能是產生的炎癥介質會破壞組織完整性相關的酶，使創面細胞基質和纖維連接蛋白降解[19]，證實木犀草素能夠降低炎性因子，促進創面肉芽組織新生而加速創面組織修復。

3.2 生肌愈瘍膏治療壓力性潰瘍的主要作用靶點

經網絡拓撲分析，PTGS1、PTGS2、SCN5A等可能生肌愈瘍膏有效成分作用于壓力性潰瘍的核心靶點。前列腺素內過氧化物合酶（PTGS），又稱環氧合酶（COX）。COX存在兩種同工酶，即結構型（COX-1）和誘導型（COX-2）[20]。COX-1為結構型同工酶，主要表達于大多數組織和器官，如血小板、內皮細胞，能夠調節血管張力、維持血小板正常生理功能；COX-2為可誘導同工酶，高表達于炎癥組織，特別是單核細胞、血管內皮細胞、血管平滑肌細胞、巨噬細胞等一些與炎癥有密切關系的細胞上[21]。COX-1和COX-2的聯合表達在血小板活性增強、抗血小板過程中具有關鍵作用[22]。創面愈合與血小板的激活和生長因子的釋放具有密切的聯系，血小板能持續釋放大量創面需要的多種因子，可以有效刺激創面修復細胞生長增殖，促進創面愈合，并可以釋放一定量抗炎因子，發揮更明顯抗感染作用[23]。蔡信濤[24]通過研究發現，心臟鈉通道基因（SCN5A）在垂體瘤細胞（GH3）中與和血管內皮生長因子A（vascularendothelial growth factor A，VEGFA）的表達呈現正相關。VEGFA參與血管生成的整個過程，在血管生成過程中，VEGFA能加速血管新生，從而為創面肉芽組織、細胞提供營養與氧氣，加快創面修復進程[25]。

3.3 生肌愈瘍膏治療壓力性潰瘍的主要信號通路

KEGG通路富集結果表明，糖尿病并發癥AGE-RAGE信號通路為主要通路。研究發現，Wnt/β-catenin通路與創面愈合過程中關鍵的炎癥反應、干細胞、新血管生成、毛囊再生、成纖維細胞增殖有關，糖基化終末產物（AGEs）與其受體（RAGE）結合表達能抑制Wnt/β-catenin通路，成纖維細胞和新生血管少，炎性細胞多，從而影響創面愈合進程[26]。另有臨床研究證實，降低創面組織中AGEs及RAGE的表達水平后，創面組織中血管內皮生長因子增多，中性粒細胞數目減少，創面愈合速度加快[27]。

本研究以生肌愈瘍膏為研究對象，通過網絡藥理學方法，對生肌愈瘍膏干預壓力性潰瘍的潛在作用靶點及作用機制進行分析，推測生肌愈瘍膏通過木犀草素、槲皮素、山奈酚等成分發揮作用，通過前列腺素G/H合成酶1、前列腺素G/H合成酶2、心臟鈉通道基因等靶點影響糖尿病并發癥AGE-RAGE等信號通路進而抗炎、抗氧化、促進新生以促進壓力性潰瘍的創面愈合。上述結果可為中醫藥治療壓力性潰瘍提供新思路，但本研究結果尚有局限，治療機制有待進一步驗證。

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