基于氟硼二吡咯（BODIPY）類染料的生物硫醇熒光探針的研究進展

摘""""" 要： 由于生物硫醇的熒光探針能夠更好地理解與生物硫醇種類有關的各種生理和病理過程，因此引起了人們越來越多的興趣。氟硼二吡咯（BODIPY）熒光團顯示出出色的光學性能，可以通過在BODIPY核心的各個位置引入各種功能單元來輕松定制這些熒光團。系統地總結了基于BODIPY的熒光探針用于生物硫醇檢測的開發，重點是優先檢測單個生物硫醇。

關 "鍵" 詞：氟硼二吡咯；生物硫醇；熒光探針

中圖分類號：O657.3"" """"文獻標識碼： A"""" "文章編號： 1004-0935（2023）08-1197-04

生物硫醇包括半胱氨酸（Cys）、同型半胱氨酸（Hcy）、還原性谷胱甘肽（GSH）和硫化氫（H₂S），在生物系統中起著至關重要的作用^[1]。硫化氫作為最簡單的生物硫醇，是通過酶過程和非酶過程內源性產生的^[2]。硫化氫水平異常可能導致各種問題，如亨廷頓氏病、帕金森氏病和阿爾茨海默氏病^[3]。異常水平的Cys對肝損傷、皮膚損傷、毛發脫色、生長緩慢、癌癥等均有影響^[4]。Hcy一直被認為是心血管疾病和阿爾茨海默病的危險因素^[5]。GSH是細胞內最豐富的生物硫醇（1～10 mmol·L^-1），由于其獨特的氧化還原特性和親核性，在人類健康和疾病中發揮著關鍵作用^[6]。因此，檢測和監測生物硫醇的水平對于理解生物硫醇在生理和病理過程和診斷中的功能非常重要。

熒光成像是監測生物環境中的目標和生物過程的強大技術，特別是由于其高靈敏度、優秀的時空分辨率和活細胞中分析物的傳感和相當簡單的技術實現^[7-8]。確保對復雜的細胞內感興趣的分析物的高度選擇性和敏感的反應，發生不同類型反應的介質是熒光探針設計的關鍵要求。在過去幾年里，基于反應的探針（被稱為“化學劑量計”）已經被廣泛應用于生物成像研究中，具有代表性的化學劑量計由熒光團組成，與官能團連接，官能團作為分析物的特定反應位點。在基于反應的生物正交反應中，分析物特異性生物正交反應的可見光信號大多是不可逆的^[9-12]。

氟硼二吡咯（BODIPY）染料（圖1）具有許多獨特且令人滿意的性質，如高摩爾吸收系數、良好的熒光量子產率、優秀的化學和光穩定性、低溶劑的敏感性以及pH不敏感，此外它們的熒光性能可以很容易地通過對其結構的輕微修飾來調節^[13-17]。

1" 基于BODIPY的生物硫醇探針

1.1" 硫化氫的選擇性探針

基于熒光分子探針的熒光成像因其良好的選擇性、高靈敏度、小生物樣品損傷和實時原位檢"""" 測^[18-19]，為檢測硫化氫等小生物分子提供了一種有吸引力的方法。有機小分子探針的反應模式與硫化氫主要來自以下方面：硝基、羥胺或疊氮化物的還原^[20]；親核加成反應^[21]；金屬硫化物的沉淀反應^[22]；間-二硝基苯醚的硫解反應^[23]；二硝基苯磺酰基基團的裂解^[24]。

以硝基和二硝基苯醚為反應基團的光子誘導電子轉移（PET）探針由于其設計、合成和實際應用簡單，表現出優異的性能。ZHU^[25]等設計合成了兩種不同的探針，包括以硝基為活性基團的DMONPB和以m-二硝基苯醚為活性基團的DMOEPB。DMONPB和DMOEPB分別獲得了51 nm和49 nm的斯托克斯位移。DMONPB可以與H₂S反應形成衍生物（圖2），其熒光量子產率為0.13。在H₂S濃度為0～800 μmol·L^-1的范圍內觀察到極好的線性關系，檢出限為1.3μmol·L^-1。此外，它可以成功地應用于細胞和組織中H₂S的成像。對于DMOEPB，由于m-二硝基苯醚沒有與BODIPY熒光團相連，且硝基熒光團的吸電子效應不能有效地影響BODIPY熒光團的熒光強度，因此DMOEPB不能應用于硫化氫的生物成像。當兩個苯環在8位分開且不與熒光團共軛時，硝基的強吸電子性能明顯" 減弱。

保羅^[26]等報道了一種用于選擇性檢測硫化氫的探針，該探針通過疊氮化物轉化為胺的化學反應檢測硫化氫。探針1的檢測限為0.17 μmol·L^-1。當在pH值為7.4時加入NaSH時，探針的熒光強度降低了9倍。當探針在檢測外源性硫化氫時，對裝載探針1的正常人口腔成纖維細胞靈敏度高、特異性高、毒性最小。該探針可用于硅板條上，以檢測生銹水管中的硫化氫或存在其他分析物的廢水中的硫化氫，也可檢測NHOF細胞中的外源性硫化氫。

GONG^[27]等報道了一種基于苯基硒取代基的BODIPY熒光關閉傳感器BOD-PhSe，其目的是基于在3位的苯基硒化物基團與H₂S的取代反應，以實現出色的H₂S檢測選擇性和靈敏度。過量添加硫化氫促進了探針5位上苯硒化物基團的進一步取代，并伴隨著熒光發射強度的進一步降低。傳感器表現出非凡的性能，在更長的激發波長下，紅色熒光強度降低了49倍，檢測限比較低，為""""""""" 0.002 5 μmol·L^-1，并且對H₂S的特異性熒光響應在中性介質中超過陰離子、生物硫醇和其他氨基酸。它無明顯的細胞毒性，有良好的膜通透性，已被廣泛用于細胞內H₂S檢測和熒光顯微鏡成像。

1.2" 半胱氨酸的選擇性探針

熒光探針因其簡單性、靈敏度、實時性、無損成像特性而引起了人們的極大關注，用醛或丙烯酸酯環化、天然化學結扎（NCL）和芳香族取代-重排檢測Cys。GAO^[28]等設計并開發了1，7-二甲基，3，"" 5-二芳基取代的BODIPY及其構象限制性物種，其中含有中芳基巰基部分（DM-BDP-SAr）和（DM-BDP-R-SAr）作為Cys的選擇性熒光探針。此外，還開發了基于DM-BDP-SAr的溶酶體靶標探針Lyso-S和Lyso-D，分別攜帶1個或2個嗎啉乙氧基部分。他們能夠在體外選擇性地檢測Cys，且檢測限較低。Lyso-S和Lyso-D都能很好地定位于活的HeLa細胞的溶酶體中，并顯示出Cys的紅色熒光。此外，該課題組通過密度泛函理論（DFT）的計算，提出了一種新穎的熒光猝滅機理。探針可以通過系統間的交叉（從單線態激發態到三線態激發態）來導致熒光猝滅。

LI^[29]等設計了一種名為NIR-BODIPY-Ac的NIR熒光探針。在探針中，將引入BODIPY核心形成NIR BODIPY熒光團，以丙烯酸酯基團作為識別位點（圖3）。探針的發射波長為708 nm，屬于NIR區域，適用于體內生物成像。此外，該探針在添加Cys后表現出高熒光量子產率（Φ = 0.51），并對Cys具有高靈敏度，熒光增強81倍。Cys探針的線性范圍為0.2～30 μmol·L^-1，檢測限為0.05 μmol·L^-1。此外，由于探針與Cys之間的反應速度比Hcy更快，因此探針對Cys顯示出高選擇性。尤其是將近紅外熒光探針應用于細胞、組織、小鼠等生物樣品中外源性和內源性Cys的檢測，取得了令人滿意的結果。

1.3" 谷胱甘肽的選擇性探針

GSH響應熒光傳感器主要基于親核芳香取" 代-重排反應，具有不穩定取代基的探針與生物硫醇通過親核芳香取代物反應形成硫醚。HUANG^[30]等設計并合成了一種用于谷胱甘肽特異性檢測的近紅外開啟雙光子熒光探針ST-BODIPY，通過Knoevenagel縮合將三苯胺連接到BODIPY骨架上，延長NIR區域的最大發射波長。2，4-二硝基苯磺酰基（DNBS）作為熒光猝滅劑和硫醇識別部分，在BODIPY的8位進行修飾。在GSH存在的情況下，探針提供了“開關”信號響應，在719 nm中心的NIR熒光增強，量子產率增加到0.44，這歸因于谷胱甘肽誘導的芳香族親核取代反應（芳香取代）反應。此外，ST-BODIPY探針已成功用于監測MCF-7細胞中外源性和內源性的GSH。

WANG^[31]等報道了一種新型的近紅外（NIR）熒光探針BODIPY-ONs，可用于靈敏和選擇性地檢測谷胱甘肽（GSH）。以2，4-二硝基苯磺酰基團（DNBS）為猝滅基團的探針無熒光活性。加入谷胱甘肽后，在656 nm為中心的NIR熒光恢復明顯，量子產率增加到0.48，而其他缺乏硫醇的氨基酸沒有產生任何變化。與Cys和Hcy相比，BODIPY-ONs對GSH的反應最高。通過滴定實驗計算出GSH的檢測限（LOD）為131 nmol·L^-1。提出了GSH誘導的含膦酸鹽的裂解方法，并得到了質譜分析和HPLC分析的支持。進一步的理論計算表明，BODIPY-ONs能夠從Cys和Hcy中區分GSH的原因是一個分子間氫鍵輔助的硫解過程。此外，探針BODIPY-ONs也可用于活細胞中內源性和外源性GSH的檢測。

1.4" 同型半胱氨酸的選擇性探針

HAN^[32]等開發了一個BODIPY熒光探針DCB，其中β位的吸電醛基作為活化基，α和α′位置的""" 2個氯原子分別作為反應位點。DCB探針容易通過芳香族親核取代反應機制被一側的氯原子或兩個巰基取代，這也能夠進行氨基重排反應，這取決于""" 3種生物硫醇的不同反應性和反應結構。利用這種雙位點結合特征和獨特的反應動力學和序列，該探針能夠通過比值熒光響應模式有效地區分Hcy、Cys和GSH。特別值得一提的是，Hcy的高選擇性和定量檢測可以在50 s內實現，這是迄今為止報道的Hcy探針中反應最快的。此外，由于其細胞毒性低，細胞通透性好，抗干擾后，探針能夠實時成像和定量分析活神經元的細胞內Hcy。

2" 結 論

BODIPY熒光團具有優異的光學特性，可以通過在BODIPY核心的不同位置引入不同的功能單元來很容易的定制。本文系統綜述了基于BODIPY的檢測生物硫醇的熒光探針的研究進展。BIDOPY部分的平面結構可能通過在極性環境中的π-π堆積引起聚集，并導致聚集引起的猝滅（ACQ）。為了提高BODIPY探針的溶解度，經常使用有機溶劑，這些有機溶劑會干擾生物樣品和亞細胞微環境。因此，開發具有更好溶解度和避免ACQ的BODIPY探針是未來非常需要的。事實上，在復雜的生物系統中，設計針對生物硫醇的分化的探針仍然存在挑戰，特別是對于Hcy。探針檢測實際生物樣本中的生物硫醇可能會受到不同類型細胞中不同水平表達的單個生物硫醇的干擾。需要探索新的識別機制和具有更高特異性和敏感性的新探針。

參考文獻：

［1］YANG Y， ZHANG L， ZHANG X， et al.A cysteine-selective fluorescent probe for monitoring the stress response cysteine fluctuations[J]. Chemical Communications， 2021， 57（47）：5810-5813.

［2］XIE P， ZHU Y， WANG Y， et al. A fluorescent probe for discrimination of cysteine/homocysteine， glutathione and hydrogen polysulfides[J]. Research on Chemical Intermediates， 2020， 47：1-16.

［3］JIA X， LI W， GUO Z， et al. An NBD-based mitochondrial targeting ratiometric fluorescent probe for hydrogen sulfide detection[J]. ChemistrySelect， 2019， 4（29）：8671-8675.

［4］CHEN Y， WANG Y， WU X H， et al. Discriminative detection of cysteine/homocysteine and glutathione in HeLa cells by dual-channel fluorescent probe[J]. Dyes and Pigments， 2020， 186：109015.

［5］NEHRA N， KAUSHIK R， GHULE V D， et al. Simpler molecular structure as selective amp; sensitive ESIPT-based fluorescent probe for cysteine and Homocysteine detection with DFT studies- ScienceDirect[J]. Journal of Molecular Structure， 2020， 1207：127839.

［6］TIAN M， LIU X Y， HE H， et al. Real-Time Imaging of Intracellular Glutathione Levels Based on a Ratiometric Fluorescent Probe with Extremely Fast Response[J]. Analytical Chemistry， 2020， 92（14）：10068-10075.

［7］WEI Y N， LIN B， SHU Y， et al. Mitochondria-targeted ratiometric fluorescent imaging of cysteine[J]. The Analyst， 2021， 146（14）：4642-4648.

［8］WANG S， LI B， ZHANG F. Molecular fluorophores for deep-tissue bioimaging[J]. ACS Central Science， 2020， 6（8）：1302-1316.

［9］胡敏，張瓊瑤，羅倫，等. 新型稀土銪熒光探針的合成及其性質研究[J].當代化工，2022，51（2）：327-331.

［10］周宇航，丁莎，夏勇，等. 熒光探針在半胱氨酸檢測的應用[J].化學進展，2022，34（8）：1831-1862.

［11］CAO D， LIU Z， VERWILST P， et al. Correction to coumarin-based small-molecule fluorescent chemosensors[J]. Chemical Reviews， 2019， 119（18）， 9b00640.

［12］LEE D， KIM G， YIN J， et al. An aryl-thioether substituted nitrobenzothiadiazole probe for the selective detection of cysteine and homocysteine[J]. Chemical Communications， 2015， 51（30）：6518-6520.

［13］XIE H R， GU Y Q， LIU L， et al. A H-aggregating fluorescent probe for recognizing both mercury and copper ions based on a dicarboxyl-pyridyl bifunctionalized difluoroboron dipyrromethene[J]. New Journal of Chemistry， 2020， 44：19713-19722.

［14］CHEN XIAO FEI， MA Q， WANG Z， et al. A boron dipyrromethene- based fluorescence 'off-on' probe for sensitive and selective detection of palladium（II） ions and its application in live cell imaging[J]. Chemistry - An Asian Journal， 2020， 15（23）：4104-4112.

［15］SHI W J，" WEI Y F，" LI C F， et al. A novel near-infrared-emitting aza-boron-dipyrromethene-based remarkable fluorescent probe for Hg²⁺ in living cells[J]. Spectrochimica Acta Part A Molecular Spectroscopy， 2021，248：119207.

［16］王凌鋒，錢鷹. 近紅外I區喹啉-氟硼二吡咯熒光染料的合成及其在溶酶體內的熒光成像[J].有機化學，2020，40（5）：1246-1250.

［17］HE R， ZHANG Y， MADHU S， et al. BODIPY based realtime， reversible and targeted fluorescent probes for biothiol imaging in living cells[J]. Chemical Communications， 2020， 56：14717-14720

［18］JI Y， XIA L J， CHEN L， et al. A novel BODIPY-based fluorescent probe for selective detection of hydrogen sulfide in living cells and tissues[J]. Talanta， 2018， 181：104.

［19］LI H，" HAO Y H，" FENG W， et al. Rapid and sensitive detection of nitric oxide by a BODIPY-based fluorescent probe in live cells： glutathione effects[J]. Journal of Materials Chemistry B， 2020， 8：9785-9793.

［20］QI Z， YIN C， JIN K， et al. A viscosity sensitive azide-pyridine BODIPY-based fluorescent dye for imaging of hydrogen sulfide in living cells[J]. Dyes and Pigments， 2018;159：166-72.

［21］QIAN Y， YANG B， SHEN Y， et al. A BODIPY-coumarin-based selective fluorescent probe for rapidly detecting hydrogen sulfide in blood plasma and living cells[J]. Sensors and actuators B， 2013;182：498-503

［22］HAO F， HUANG P C， WU F Y. A novel jointly colorimetric and fluorescent sensor for Cu²⁺ recognition and its complex for sensing S^2- by a Cu²⁺ displacement approach in aqueous media[J]. Spectrochimica Acta Part A Molecular amp; Biomolecular Spectroscopy， 2018， 204：568-575.

［23］CHEN S， HOU P， WANG J， et al. A rapid and selective fluorescent probe with a large Stokes shift for the detection of hydrogen sulfide[J]. Spectrochimica Acta Part A Molecular and Biomolecular Spectroscopy， 2018;203：258-262.

［24］ZHENG F， MIN W， FANG Z， et al. A water-soluble， low-cytotoxic and sensitive fluorescent probe based on poly（ethylene glycol） for detecting sulfide anion in aqueous media and imaging inside live cells[J]. Polymer， 2013， 54（21）：5691-5697.

［25］ZHU X Y， WU H， GUO X F， et al. Novel BODIPY-based fluorescent probes with large Stokes shift for imaging hydrogen sulfide[J]. Dyes and Pigments， 2019， 165：400-407.

［26］PAUL N， SARKAR R， SARKAR R， et al. Detection of hydrogen sulfide using BODIPY based colorimetric and fluorescent on-off chemosensor[J]. Journal of Chemical Sciences， 2020， 132（1）： 917244.

［27］GONG D， ZHU X， TIAN Y， et al. A phenylselenium-substituted BODIPY fluorescent turn-off probe for fluorescence imaging of hydrogen sulfide in living cells[J]. Analytical Chemistry， 2017， 89（3）：1801-1807.

［28］GAO J， TAO Y， ZHANG J， et al. Development of lysosome-targeted fluorescent probes for Cys by regulating the boron-dipyrromethene （BODIPY） molecular structure[J]. Chemistry （Weinheim an der Bergstrasse， Germany）， 2019， 25（48）：11246-11256.

［29］SONG J， LI Y J， et al. A near-infrared fluorescent probe based on BODIPY derivative with high quantum yield for selective detection of exogenous and endogenous cysteine in biological samples[J]. Analytica chimica acta， 2017， 994（22）：73-81.

［30］HUANG C， QIAN Y. A highly sensitive two-photon fluorescent probe for glutathione with near-infrared emission at 719 nm and intracellular glutathione imaging[J]. Spectrochimica Acta Part A Molecular and Biomolecular Spectroscopy， 2019， 217：68-76.

［31］WANG C， XIA X， LUO J， et al. A novel near-infrared styryl-BODIPY fluorescent probe for discrimination of GSH and its application in living cells[J]. Dyes and Pigments， 2018， 152：85-92.

［32］HAN Y J， LI X H， et al. Selective rapid， and ratiometric fluorescence sensing of homocysteine in live neurons via a reaction-kinetics/sequence differentiation strategy based on a small molecular probe[J]. ACS Sens，2022， 7（4）：1036-1044.

Research Progress of Thiol Fluorescent Probes based on BODIPY Dyes

LEI Yuan

（Yunnan Normal University， Kunming Yunnan 650500， China）

Abstract： Because fluorescent probes of biological thiols can better understand various physiological and pathological processes related to biological thiols， they have attracted more and more interest. Fluoroboron dipyrrole （BODIPY） fluorophores show excellent optical properties. These fluorophores can be easily customized by introducing various functional units at various positions of BODIPY core. In this paper， the development of BODIPY based fluorescent probes for the detection of biological thiols was systematically summarized， with emphasis on the priority detection of individual biological thiols.

Key words： Bipyrrometheneborn difluoride （BODIPY）; Biological thiol; Fluorescent probe