一種高產琥珀酸耐鹽酵母菌的篩選及應用研究

◎ 滑歡歡，梁 亮，扈圓舒，潘麗娟，黃敏斯，尹何南，吳嘉怡

（廣東美味鮮調味食品有限公司，廣東 中山 528400）

醬油是以大豆和小麥為主要原料，經多種微生物共同作用而形成的具有特殊色、香、味、體的調味品。風味是醬油的一個關鍵指標，為了滿足消費需要和行業競爭力，提高醬油風味是當下亟待解決的問題。

在醬油發酵過程中，因微生物作用產生的醇、醛、酸、酯類物質，是醬油風味形成的主要物質或前體，一般分為揮發性物質和非揮發性物質2 大類。其中，有機酸占非揮發性物質中的主要部分，而用于醬油釀造中的酵母菌是產有機酸的主要微生物。

與醬油風味直接相關的耐鹽酵母菌主要有魯氏接合酵母菌、異變球擬酵母菌等，是醬油發酵過程中經常被利用的微生物。其主要進行酒精發酵，也會參與醬油發酵過程中風味物質酯類、呋喃類、酮類以及琥珀酸的生成，是醬油發酵過程中的主發酵酵母菌。有研究表明，高鹽稀態發酵醬油樣品中的揮發物，發酵主要揮發物質是酸類和醇類，分別占總含量的47%和14%。由此可見，高鹽稀態發酵醬油樣品中酸類物質的含量與其風味息息相關[1]。

醬油中的有機酸以乳酸、乙酸為主，醬油的香氣主要來自有機酸含量的高低，而且有機酸可以調節高鹽稀態工藝發酵醬油中高鹽分帶來的不適口感，在所有風味物質中，構成醬油風味的骨架體系為醇類、酯類和酚類，其中，酯類物質所占比重最大，而有機酸是酯類的前體物質。

醬油的有機酸中，風味好的醬油一般乳酸含量較高；草酸會給醬油帶來澀感；甲酸和乙酸有刺激性氣味，會給醬油帶來不好的味道，在醬油中含量不宜太高；琥珀酸或其鹽類，具有貝類特殊滋味，是唯一一種可以提高醬油鮮味的有機酸。琥鉑酸鈉熱穩定性好，溶解性也較好，可以提高醬油風味[2]。其可以單獨使用，也可以和谷氨酸鈉一起使用，能起醬油增鮮的作用。目前，在醬油發酵過程中，能產生琥珀酸的微生物只是酵母菌，同時，酵母菌也會產生對醬油風味不好的有機酸，如草酸、甲酸和乙酸。

因此，本文經過誘變選育得到一株能夠高產琥珀酸，且不產乙酸和甲酸的耐鹽酵母菌M03，在醬油發酵階段添加此酵母菌，能夠顯著提高醬油中琥珀酸的含量，從而提高醬油的鮮味和風味品質[3]。

1 試驗材料和方法

1.1 試驗主要材料

黃豆、小麥、食鹽、麥芽汁培養基、碳酸鈣、瓊脂粉、葡萄糖等，購于市場；滬釀3.042 米曲霉菌種（廣東美味鮮調味食品有限公司）。

1.2 主要設備

ARTP 誘變系統、超凈工作臺、培養箱、耐鹽菌擴培系統、種曲機、發酵罐等。

1.3 試驗方法

1.3.1 分離培養基及分離方法

選出風味柔和、無刺激酸味且氨基酸態氮含量達到1.1 g/100 mL 的發酵罐，送檢總酸、琥珀酸等指標，確定目標醬醪。

耐鹽酵母菌的分離：麥芽汁培養基（1 L）、食鹽100 g、瓊脂粉20 g、0.3%碳酸鈣，采用平板涂布法進行分離。

1.3.2 出發菌株的分離與篩選

選用一罐發酵90 d 的生醬油，鮮味十足，風味柔和，無刺激酸味，且氨基酸態氮含量達到1.1 g/100 mL；采用添加0.3%碳酸鈣的高鹽麥芽汁培養基進行涂布分離，挑取透明圈比較小的10 株酵母菌，命名為SY01、SY02、SY03、SY04、SY05、SY06、SY07、SY08、SY09、SY10；取成熟大曲2 kg，分成10 份，分別與600 g、濃度為20 波美的鹽水混合，制成醬醪，將初篩得到的10 株酵母菌，按照6‰比例添加至醬醪初期（制醪時添加），30 ℃恒溫發酵120 d，過濾得到生醬油。送檢生醬油琥珀酸、乙酸和甲酸、氨基酸態氮等理化指標，挑選表現最好的菌株作為基礎菌株進行誘變選育[4]。

1.3.3 出發菌株的誘變及篩選

以醬醪中分離得到的高產琥珀酸的酵母菌為基礎菌株，采用ARTP 技術對初發菌株進行誘變，并以致死率等為指標，誘變時間為變量確定誘變參數，獲得突變菌株；使用添加0.3%碳酸鈣的高鹽麥芽汁平板培養基進行篩選。在添加0.3%碳酸鈣的高鹽麥芽汁平板培養基中，挑取與初發菌株M02 相比具有透明圈小的菌落，進行初篩得到10 株正突變株，命名為SY11、SY12、SY13、SY14、SY15、SY16、SY17、SY18、SY19、SY20，再進行醬醪發酵復篩。

初篩方法：將含有酵母菌的樣品采用添加3‰的高鹽（10%）麥芽汁培養基平板進行涂布分離，觀察平板上單菌落的透明圈大小，透明圈越小，說明產總酸越低。復篩方法：挑取透明圈小的單菌落，于液體高鹽（10%）麥芽汁培養基中，得到培養菌液；將培養菌液按照6‰的比例添加至初期醬醪中，進行30 ℃恒溫發酵120 d，得到原油，按照常規方法檢測生醬油中琥珀酸、乙酸和甲酸、氨基酸態氮等理化指標。

1.3.4 誘變菌株M03 遺傳穩定性的研究

將誘變獲得的酵母菌在液體高鹽（10%）麥芽汁培養基進行連續傳代10 次，將第1 代、第5 代和第10 代菌株的培養液，添加至初期醬醪中，30 ℃恒溫發酵90 d，過濾得到原油，檢測原油中琥珀酸、乙酸和甲酸、氨基酸態氮等理化指標在各代之間穩定[5]。

1.3.5 誘變得到的酵母菌M03 在釀造醬油中的應用

誘變獲得的目標酵母菌按照生產工藝進行擴大培養，得到培養液，按照6‰的比例添加至初期醬醪中，發酵180 d，得到原油，對比發酵原油中琥珀酸、甲酸、乙酸、總酸等含量，并感官鑒評原油風味[6]。

2 試驗結果分析

2.1 出發菌株的分離與篩選

由表1 結果可知，經分離得到的酵母菌菌株，添加至醬醪初期，得到的原油添加酵母菌SY7 后，原油中琥珀酸含量最高，揮發性酸甲酸和乙酸明顯降低，總酸也大大降低。從理化指標可以看出，菌株SY7 效果最優，命名為酵母菌M02，并將此菌株作為出發菌株，進行ARTP 誘變選育。

表1 添加不同酵母菌菌株發酵原油的理化結果分析表（檢測結果單位：g/100 mL）

2.2 出發菌株的誘變及篩選

由圖1、表2 可知，本文以基礎菌種M02 為出發菌株進行ARTP 誘變，初篩得到10 株突變菌株，添加至醬醪初期經發酵得到的原油，添加突變菌株SY16后，原油中琥珀酸含量與出發菌株相比提高45%，未檢出甲酸和乙酸，總酸也大大降低，與出發菌株相比下降11.7%。從理化指標可以看出，菌株SY16 效果最優，命名為M03[7-8]。

圖1 誘變后涂布分離平板正反面透明圈的大小圖

表2 添加不同突變菌株發酵原油的理化結果分析表（檢測結果單位：g/100 mL）

2.3 誘變菌株M03 遺傳穩定性的研究

如表3 所示，從發酵原油的理化及培養液的理化結果來看，酵母菌M03 遺傳穩定性良好。

表3 酵母菌株傳代穩定性檢測結果表（檢測結果單位：g/100 mL）

2.4 誘變得到的酵母菌M03 在釀造醬油中的應用

由表4 結果顯示，采用酵母菌株M03 發酵得到的原油，氨基酸態氮含量略高于出發菌株，琥珀酸含量遠遠高于出發菌株，乙酸和甲酸產率特別低。由此可見，將酵母菌株M03 應用于醬油釀造，可明顯改善醬油的風味，提高醬油品質，降低醬油釀造成本。

表4 出發菌株M02 和誘變菌株M03 發酵原油的理化結果對比表（檢測結果單位：g/100 mL）

此外，本文還召集20 名有豐富經驗的鑒評人員進行感官鑒評，感官鑒評的評價指標包括鮮味、酸味、香氣、刺激性，分值為0～5 分，評價分數越高，該項指標越好。綜合評價指的是樣品的綜合感官、整體給評價員的感官，鑒評結果見表5。

表5 添加酵母菌發酵原油感官鑒評打分結果表

由表5 感官結果可知，酸味和刺激性是相反的，分值越高，原油風味越差，酸味突出，有一股刺激性的味道彌散開來。結果顯示，添加誘變酵母菌M03 后，發酵原油的觀感鑒評綜合結果最優。

綜上所述，添加酵母菌M03 發酵醬油，可以顯著改善醬油口感和風味，全面提升醬油質量，應用前景廣闊。

3 結論

本文經過誘變選育得到一株高產琥珀酸的耐鹽酵母菌M03，且該酵母菌不產乙酸和甲酸等揮發性有機酸；采用酵母菌株M03 發酵得到的原油，氨基酸態氮含量略高于出發菌株，琥珀酸含量遠遠高于出發菌株，乙酸和甲酸產率特別低。可見，將酵母菌株M03 應用于醬油釀造，可明顯改善醬油的風味，提高醬油品質，降低醬油釀造成本。