黃連標準湯劑、配方顆粒與鹽酸小檗堿對大腸埃希菌的抑菌作用機制研究

馬聰 余志晴 田佩靈 楊俊莉 雷燕莉 唐焓嫣 徐玉玲

摘要：目的 探究黃連標準湯劑、配方顆粒與鹽酸小檗堿對大腸埃希菌的抑菌作用機制，為黃連配方顆粒抑菌機制的研究提供參考。方法 利用二倍稀釋法測定黃連標準湯劑、配方顆粒及鹽酸小檗堿對大腸埃希菌（EC）的最小抑菌濃度（MIC）、最小殺菌濃度（MBC），并根據測定的結果進行EC抑菌曲線的繪制、胞外可溶性蛋白相對含量、電導率的研究。結果 黃連標準湯劑、配方顆粒與鹽酸小檗堿對EC的MIC分別為3.14、5.06和0.80 mg/mL；MBC的結果分別為3.14、10.13和3.19mg/mL；EC在黃連標準湯劑、配方顆粒與鹽酸小檗堿質量濃度為1×MIC和1/2MIC的情況下生長受到明顯抑制，空白組EC生長良好；在供試品質量濃度為1×MIC和2×MIC情況下，隨著時間增加，EC胞外可溶性蛋白相對含量、電導率都有不同程度的上升。結論 在黃連標準湯劑、配方顆粒與鹽酸小檗堿的作用下，EC細胞膜通透性增加，使細胞內容物泄露，從而達到抑菌作用。

關鍵詞：大腸埃希菌；黃連標準湯劑；配方顆粒；鹽酸小檗堿；抑菌作用機制

中圖分類號：R978.1 ?文獻標志碼：A

Study on the antibacterial mechanism of Huanglian standard decoction， formula granules， and berberine hydrochloride on Escherichia coli

Ma Cong1， Yu Zhiqing2， Tian Peiling2， Yang Junli2， Lei Yanli2， Tang Hanyan2， and Xu Yuling3，4

（1 College of Food and Bioengineering， Chengdu University， Chengdu 610106; 2 Chengdu University Pharmaceutical College， Chengdu 610106; 3 Sichuan Institute of Antibiotic Industry， Chengdu University， Chengdu，610106; 4 Sichuan Provincial Engineering Research Center for Antiviral Chinese Medicine Industrialization， Chengdu 610106）

Abstract Objective To explore the antibacterial mechanism of Huanglian standard decoction， formula granules， and berberine hydrochloride on Escherichia coli， and to provide a reference for the study of antibacterial mechanism of Huanglian formula granules. Methods The minimum inhibitory concentration （MIC） and the minimum bactericidal concentration （MBC） of Coptis standard decoction， formula granules， and berberine hydrochloride on Escherichia coli （EC） were determined by the principle of the double dilution method. According to the results of the determination， the antibacterial curve of EC， the relative content of extracellular soluble proteins， and the conductivity were studied. Results The MICs of Huanglian standard decoction， formula granules， and berberine hydrochloride against E. coli were 3.14， 5.06 and 0.80 mg/mL， respectively. MBC results were 3.14， 10.13 and 3.19 mg/mL， respectively; the growth of EC was significantly inhibited when the mass concentrations of Huanglian standard decoction， formula granules， and berberine hydrochloride were 1×MIC and 1/2MIC， and the blank group grew well. Under the conditions of 1×MIC and 2×MIC， the relative content and conductivity of EC extracellular soluble proteins increased to varying degrees with the increase of time. Conclusion Under the action of Huanglian standard decoction， formula granules， and berberine hydrochloride， the permeability of EC cell membrane increases， and the cell content leaked， so as to achieve antibacterial effects.

Key words ?Escherichia coli; Huanglian standard decoction; Formula granules; Berberine hydrochloride; ?Antibacterial mechanism

黃連為毛茛科植物黃連Coptis chinensis Franch. 三角葉黃連Coptis deltoidea C. Y. Cheng et Hsiao或云連Coptis teeta Wall.的干燥根莖，具有清熱燥濕、清熱解毒的功效，傳統中醫用其治療濕熱痞滿、嘔吐吞酸、瀉痢、癰疽瘡毒、心火亢盛等[1]；現代藥理學研究表明，黃連具有抗病原微生物、抗炎、抗腫瘤、止瀉、抑制血小板凝集、抑制胃液分泌等作用[2]，并且由于其顯著的抑菌活性，素有“中藥抗生素”的美稱[3]。其中主要成分小檗堿在抑菌活性中起著重要作用，作為廣譜抗菌藥，具有很強的抗菌功效，對革蘭陽性和革蘭陰性菌（如大腸埃希菌）的附著均具有抑制作用[4]，臨床上多用于消化道疾病的治療。大腸埃希菌是條件致病菌，在一定條件下可以引起人和多種動物發生胃腸道感染或尿道等多種局部組織器官感染。

《中國藥典》2020版一部黃連項下將表小檗堿、黃連堿、巴馬汀及小檗堿作為黃連的指標性成分，其中小檗堿根據已有研究可確定為黃連的質量標志物（Q-maker）之一[5-8]。中藥Q-marker與中藥功能屬性密切相關，是可以定性定量的特有化學成分，作為反映中藥安全性和有效性的標示性物質進行質量控制[9]。中藥配方顆粒是中藥材或飲片經水提、分離、濃縮、干燥、制粒而成，用來對其進行質量控制的主要參照物就是標準湯劑。標準湯劑來源于《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求》，其可作為中藥飲片和中藥配方顆粒間的“橋梁”，從而探索配方顆粒是否能夠承載飲片的安全性和有效性。為了研究黃連配方顆粒、標準湯劑以及黃連質量標志物小檗堿三者之間的抑菌作用及機制異同，本文以大腸埃希菌為代表，對黃連配方顆粒、標準湯劑及鹽酸小檗堿對大腸埃希菌抑菌作用及其機制進行了研究。

1 實驗材料與儀器

1.1 實驗材料與試劑

購自重慶、四川等道地產區的黃連，經成都大學食品與生物工程學院劉濤教授鑒定為毛茛科植物Coptis chinensis Franch.黃連的干燥根莖；大腸埃希菌菌株（成都大學附屬醫院提供）；鹽酸小檗堿對照品（四川省維克奇生物科技有限公司；批號wkq19042611；HPLC≥97.8%）；考馬斯亮藍G250（成都市科隆化學品有限公司；批號2020050601）；其他實驗材料包括蛋白胨、瓊脂粉、氯化鈉、酵母浸出粉等。

1.2 實驗儀器

TU-1810型紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；DDS-307A電導率儀（上海儀店科學儀器股份有限公司）；DH3006A型電熱恒溫培養箱（西安禾普生物科技有限公司）；JJ-CJ-2FD潔凈工作臺（蘇州市金凈凈化設備科技有限公司）；ZQTY-70E振蕩培養箱（上海知楚儀器有限公司）； XFS-280手提式壓力蒸汽滅菌器（浙江新豐醫療器械有限公司）；TG20G離心機（天津廣豐科技科技有限公司）；FD-1A-50冷凍干燥機（北京博醫康實驗有限公司）；旋轉蒸發儀（成都康宇科技有限公司）；恒溫水浴鍋（成都康宇科技有限公司）。

2 方法

2.1 樣品的制備

2.1.1 黃連標準湯劑的制備

根據《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求》，稱取適量黃連原藥材，加9倍藥材質量的水浸泡30 min，加熱，煮沸30 min，濾過；藥渣再加入7倍量水，加熱，煮沸30 min，濾過；合并濾液，于旋轉蒸發儀上65 ℃減壓濃縮至相對密度為1.2～1.5

（65 ℃），將濃縮的浸膏冷凍干燥成粉末。

2.1.2 黃連配方顆粒的制備

按照中藥配方顆粒國家藥品標準（第一批），稱取適量黃連原藥材，加入9倍藥材質量的水，浸泡30 min，煎煮3次，每次90 min；合并每次的濾液于旋轉蒸發儀上減壓濃縮得浸膏（相對密度1.2～1.5，80 ℃），冷凍干燥得黃連配方顆粒中間體；按照中間體：輔料玉米淀粉=1：0.8的比例加入黃連配方顆粒中間體和輔料，混合均勻后滴加適量95%乙醇，制粒，整粒，即得。

2.1.3 黃連標準湯劑供試品的制備

稱取約125 mg黃連標準湯劑，精密稱定，置于離心管，精密加入10 mL純化水溶解，搖勻，于10000 r/min離心15 min，取上清液，制成的質量濃度約為12.5 mg/mL，高壓蒸汽滅菌，備用。

2.1.4 黃連配方顆粒供試品的制備

稱取約0.2 g黃連配方顆粒，精密稱定，置于離心管，精密加入10 mL純化水溶解，搖勻，于10000 r/min離心15 min，取上清液，制成的質量濃度約為20 mg/mL，高壓蒸汽滅菌，備用。

2.1.5 鹽酸小檗堿供試品的制備

稱取約6 mg鹽酸小檗堿對照品，精密稱定，置于2 mL量瓶中，加入適量純化水使其溶解，用純化水定容，制成的質量濃度約為3 mg/mL，紫外燈下滅菌，備用。

2.2 菌株的活化

液體培養基：稱取5 g蛋白胨，2.5 g酵母浸出粉，5 g氯化鈉，加蒸餾水定容至500 mL；固體培養基：稱取5 g蛋白胨，2.5 g酵母浸出粉，5 g氯化鈉，7.5 g瓊脂粉，加熱使瓊脂溶解，用蒸餾水定容至500 mL。將菌種接種于液體培養基中，于37 ℃，120 r/min振蕩培養箱中連續培養24 h，得菌懸液，備用。

2.3 體外抑菌活性測定方法建立

2.3.1 菌懸液的稀釋

吸取一定量活化菌懸液，用液體培養基進行稀釋，調整濁度至0.75×108 ?CFU/mL [11]。

2.3.2 最小抑菌濃度的測定（minimum inhibitory concentration， MIC）

取無菌96孔一次性細胞培養板，在1、2號孔加入100 ?L“2.1.3”項下溶液，在2～7號孔預先加入100 ?L液體培養基溶液，2號孔中的溶液混勻后吸取100 ?L于3號孔，依次倍比稀釋至6號孔，每個梯度重復兩次；1～7號孔均加入10 ?L稀釋菌液，7號孔為陽性對照；8號孔加入100 ?L空白液體培養基溶液為陰性對照，點好的板放入培養箱中培養24 h后觀察結果。黃連配方顆粒、鹽酸小檗堿同法測定MIC。

2.3.3 最小殺菌濃度的測定（minimum bactericidal concentration， MBC）

將上述培養24 h后的澄清的溶液，用接種環接種于固體培養基表面，于培養箱中37 ℃培養24 h，以無菌生長視為100%被殺滅，此最低藥物濃度為其MBC值。黃連配方顆粒、鹽酸小檗堿同法測定MBC。

2.3.4 抑菌曲線的繪制

吸取一定量大腸埃希菌活化菌液于液體培養基中，調整濁度為0.75×108 ?CFU/mL，調整此時溶液中黃連標準湯劑質量濃度為1×MIC和1/2MIC，在37 ℃，

120 r/min振蕩培養箱中連續培養，每隔1 h定時取樣測定A600，以不含黃連標準湯劑的液體培養基為對照，繪制大腸埃希菌的生長曲線，每個濃度設置2個重復。黃連配方顆粒、鹽酸小檗堿同法繪制細菌生長曲線。

2.4 抑菌作用機制的研究

2.4.1 胞外可溶性蛋白的測定

吸取一定量大腸埃希菌活化菌液于液體培養基中，調整濁度為0.75×108 CFU/mL，調整此時溶液中黃連標準湯劑質量濃度為1×MIC和2×MIC，在

37 ℃，120 r/min振蕩培養箱中連續培養，每隔30 min定時取樣，4000 r/min離心5 min，取上清液加入考馬斯亮藍試劑靜置5 min，測定A595，以A595表示胞外可溶性蛋白相對量，以不含黃連標準湯劑的液體培養基為對照，每個濃度設置2個重復。黃連配方顆粒、鹽酸小檗堿同法測定細菌胞外可溶性蛋白相對量。

2.4.2 電導率的測定

用PBS溶液（pH7.3）調整黃連標準湯劑質量濃度為MIC，加入一定量用注射用生理鹽水稀釋的大腸埃希菌活化菌液，在搖床中恒溫培養，于0、10、20、30、40、50、60、80和120 min時間點用電導率儀測定其電導率值的變化，以不含黃連標準湯劑的PBS為對照，每個濃度設置2個重復。黃連配方顆粒、鹽酸小檗堿同法測定電導率的變化。

3 結果

3.1 最小抑菌濃度、最小殺菌濃度

利用二倍稀釋的原理測定黃連標準湯劑、配方顆粒及鹽酸小檗堿對EC的MIC，陰性對照孔內溶液澄清，無菌生長，沒有菌的污染；隨著供試品質量濃度逐漸降低，孔內溶液開始出現渾濁。由表1可知，按照CLSI標準測MIC用到的細菌終濃度為5×105 CFU/mL。鹽酸小檗堿對EC的MIC值最小，為0.80 mg/mL＜7.81 mg/mL，表現為高敏[12]；黃連標準湯劑對EC的MIC值為 3.14 mg/mL，同樣表現為高敏；配方顆粒質量濃度≥5.06 mg/mL時，孔內的溶液均澄清，說明此時孔內EC生長受到抑制；將上述孔內澄清地溶液接種于固體培養基表面，培養24 h后，以固體培養基上無菌生長視為EC被100%殺滅，結果由表1可知，鹽酸小檗堿對EC的殺菌作用最強，其MBC值為3.19 mg/mL。黃連標準湯劑的殺菌效果強于配方顆粒，MBC值分別為6.28和10.13 mg/mL。

3.2 黃連標準湯劑、配方顆粒、鹽酸小檗堿對EC生長的影響

由圖1可知，在空白對照組中，大腸埃希菌在4～9h后開始大量繁殖，吸光度增長劇烈，培養液不斷變渾濁；而在黃連標準湯劑、配方顆粒及鹽酸小檗堿的作用下，在測定的時間范圍內，濃度為1/2MIC和MIC的吸光度值變化緩慢且變化趨勢很小，并且EC組與1/2MIC-EC、MIC-EC組比較具有顯著性差異（*P＜0.05），表明3種供試品對大腸埃希菌的生長具有明顯的抑制效果，其繁殖速率大大降低。

3.3 黃連標準湯劑、配方顆粒、鹽酸小檗堿對EC胞外可溶性蛋白的影響

由圖2可知，在0～30 min之內，EC胞外可溶性蛋白相對量呈快速增長趨勢，且MIC-EC組和2MIC-EC組溶出蛋白質的量明顯高于EC組（*P＜0.05），說明在黃連標準湯劑、配方顆粒與鹽酸小檗堿作用下EC細胞膜可能受到損傷，使細胞內容物大量向外溶出。

3.4 黃連標準湯劑、配方顆粒、鹽酸小檗堿對電導率（電極常數=1）變化量的影響

在細胞膜未受到損傷的情況下，細胞內離子或其他帶電化合物不能自由通過細胞膜[2]，結果由圖3可知，EC組電導率變化量基本趨于0且保持穩定，說明此時溶液中電導率基本不變化，大腸埃希菌的細胞膜阻止了胞內離子或其他帶電化合物的溶出；而在黃連標準湯劑、配方顆粒與鹽酸小檗堿的作用下，電導率變化量均有不同程度地上升；（a）、（b）、（c）MIC-EC組與EC組具有極顯著差異（**P＜0.01）。其中鹽酸小檗堿使胞內離子或其他帶電化合物溶出的速度最快，短時間內電導率變化量快速增大。溶液中電導率的升高說明了細胞膜受到了損傷，與胞外可溶性蛋白相對量的增加結果顯示一致，進一步揭示了3種供試品抑菌機制：可能使細胞破裂，細胞內容物溶出，抑制了細菌的生長繁殖，從而達到抑菌作用。

4 討論

在抑菌曲線測定過程中，加入大腸埃希菌的空白對照組于4～6 h后開始快速繁殖，數量急劇上升，生長趨勢良好；在黃連標準湯劑、配方顆粒以及鹽酸小檗堿質量濃度為1/2MIC和1×MIC情況下，隨著時間增加，吸光度變化很小，表明大腸埃希菌生長受到明顯的抑制，揭示了黃連標準湯劑、配方顆粒以及鹽酸小檗堿具有顯著的抑菌作用效果。在黃連標準湯劑、配方顆粒、鹽酸小檗堿質量濃度為1×MIC和2×MIC情況下，隨著時間的推移，EC胞外可溶性蛋白相對量、電導率均有不同程度的上升，揭示了3種樣品的抑菌機制可能是EC細胞膜受到損傷，胞外可溶性蛋白的溶出逐漸增多，溶出的離子或其他帶電化合物也逐漸增多，電導率增大，而加入EC的空白對照組溶出蛋白質的量較少或電導率基本不發生變化。

《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求》中規定，配方顆粒的所有藥學研究（包括工藝參數確定、質控方法和指標選擇、限度制定等）均須與標準湯劑進行對比，以保證與標準湯劑質量一致性，以此來支撐中藥配方顆粒用藥的安全性和有效性[13]，而本文抑菌機制的研究，證明了黃連標準湯劑和黃連配方顆粒在抑菌作用方面的一致性。從本文的探討結果可知，黃連原藥材的抗病原微生物、抑菌的藥理作用可傳遞至黃連標準湯劑，又可從黃連標準湯劑傳遞至黃連配方顆粒；而黃連標準湯劑與黃連配方顆粒的抑菌作用機制又可能與黃連發揮抑菌活性的關鍵成分小檗堿的抑菌機制基本相同，三者相互印證，表明了黃連配方顆粒的質量與標準湯劑的質量一致性，可保證黃連配方顆粒用藥的有效性。

黃連配方顆粒、標準湯劑主成分均為小檗堿，本文研究結果表明，三者抑菌效果存在一定差異。可能還通過其他機制發揮抑菌作用，有研究表明，在鹽酸小檗堿質量濃度為MIC的情況下，大腸埃希菌細胞膜表面產生較大程度的皺縮，菌體變形，此時細胞膜上出現明顯的破裂從而導致細胞質外泄，菌體死亡[14]。另外小檗堿能使菌體表面菌毛數量減少，從而降低菌體黏附；降低DNA拓撲異構酶Ⅰ和DNA拓撲異構酶Ⅱ的活性，從而影響細菌DNA的合成[1]。小檗堿的其他抑菌作用機制如其可抑制細菌的Na+/K+-ATP酶活力；能夠與細菌體內的輔酶磷酸吡哆醛競爭酪氨酸脫羧酶、色氨酸酶上的酶蛋白，產生不可逆抑菌作用；能夠抑制細菌內糖代謝過程中的丙酮酸氧化，使細菌對維生素B6和煙酰胺等的利用受到限制[15]等還需要進一步研究。

參 考 文 獻

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