雞circMICAL2的鑒定、組織表達譜分析及其功能預測

doi：10.6048/j.issn.1001-4330.2024.05.027

摘" 要：【目的】驗證雞環狀RNA（circMICAL2）的真實性，研究circMICAL2在雞肌肉生長發育中的潛在功能及調控機制。

【方法】基于circMICAL2環狀序列設計特異性引物采用PCR擴增完成其真實性驗證，并測定RNase R和放線菌素D處理檢測circMICAL2的內源穩定性。采集16日齡三黃雞（雛雞）和180日齡三黃雞（成年雞）的心臟、肝臟、肺、腎臟、腸、皮膚、胸肌和腿肌等8個組織樣本，采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）分析circMICAL2在雞不同發育時期的組織表達圖譜；運用生物信息學對circMICAL2靶向miRNA和mRNA進行預測，并開展GO功能和KEGG通路富集分析。

【結果】雞circMICAL2真實存在，其環化穩定性強；circMICAL2在成年雞和雛雞各組織中廣泛表達，且circMICAL2均在成年雞和雛雞的胸肌和腿肌肌肉中表達量最高，circMICAL2在成年雞腿肌和胸肌中的表達量均顯著高于雛雞（Plt;0.05），circMICAL2與雞肌肉生長發育調控密切相關。circMICAL2可靶向gga-miR-103-3p和gga-miR-130b-3p，調控下游225個潛在靶基因。circMICAL2的靶基因主要富集于TGF-β信號通路、MAPK信號通路、細胞周期等相關信號通路。

【結論】雞circMICAL2真實存在，circMICAL2的表達對雞不同生長發育時期肌肉的生長具有重要調控作用。

關鍵詞：環狀RNA；肌肉；雞；組織表達；生長發育

中圖分類號：S831""" 文獻標志碼：A""" 文章編號：1001-4330（2024）05-1284-08

收稿日期（Received）：

2023-09-28

基金項目：

四川省科技計劃-重點研發項目（2022YFN0039）；樂山師范學院科技計劃項目（DGZZ202002，22HX00051）

作者簡介：

古麗帕日·艾克拜（1998-），女，新疆吐魯番人，碩士研究生，研究方向為動物遺傳育種與繁殖，（E-mail）1310784945@qq.com

通訊作者：

劉武軍（1966- ），女，河南鹿邑人，教授，博士，碩士生/博士生導師，研究方向為動物遺傳育種與繁殖，（E-mail）lwj_ws@163.com

王鋼（1979-），男，重慶綦江人，教授，研究方向為動物疫病監測與防控、養殖業廢棄物處理與利用，（E-mail）Lswanggang@163.com

0" 引 言

【研究意義】禽肉是我國第二大肉類消費品［1］。環狀RNA（circular RNA，circRNA）是廣泛存于生物體的一類內源性非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）。circRNA可分為四類：外顯子環狀RNA、內含子環狀RNA、外顯子-內含子環狀RNA及基因間區環狀RNA［2-3］。circRNA廣泛存在于人、動物以及植物體內［4-5］。已證實circRNA在畜禽組織發育［6］、細胞分化［7］等具有重要的調控作用。【前人研究進展】circRNA是動物肌肉生長發育過程中的關鍵調控因子，通過與miRNA結合調控肌細胞的增殖與凋亡［8］。circSVIL通過使miR-17-3pa海綿化促進牛成肌細胞增殖和分化，抑制成肌細胞的凋亡［9］。circFgfr2、circQrich1、circMettl9和circCamta1在小鼠骨骼肌發育和肌母細胞分化過程中差異表達，其中circFgfr2具有促進小鼠肌肉生長發育及肌肉再生的調控作用［10］。雞circRBFOX2.2-3和circRBFOX2.2-4可抑制miR-206活性，促進雞成肌細胞的增殖和分化，調控雞肌肉發育［11］。Zhao等［12］研究發現，雞circCCDC91可作為miRNA-3家族的海綿激活IGF15-PI1K/AKT信號通路，促進雞肌細胞增殖和分化。【本研究切入點】以前期在高通量測序中篩選獲得在雞胸肌中顯著上調的circMICAL2為雞肌肉生長發育調控候選環狀RNA，需驗證和分析雞circMICAL2組織表達譜和circMICAL2靶向miRNA和mRNA預測及功能。【擬解決的關鍵問題】采用PCR擴增完成雞circMICAL2真實性鑒定，并運用RNase R和放線菌素D處理檢測circMICAL2的內源穩定性。鑒定雞circMICAL2真實性，在雞不同發育時期分析circMICAL2組織表達譜，并運用生物信息學分析雞circMICAL2潛在靶向miRNA與mRNA預測及功能，研究circMICAL2在雞肌肉生長發育調控中的分子功能，為雞肌肉生長發育的分子調控機制闡釋提供理論基礎。

1" 材料與方法

1.1" 材 料

1.1.1" 雞 只

試驗分別選取3只16日齡三黃雞（雛雞）和180日齡三黃雞（成年雞）作為研究對象，統一飼養管理。戊巴比妥鈉麻醉后放血屠宰，分別采集心臟、肝臟、肺、腎臟、腸、皮膚、胸肌和腿肌8個組織，用錫紙包裹，液氮速凍后于-80℃保存備用。

1.1.2" 主要試劑

Trizol，美國試劑賽默飛世爾科技公司；反轉錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit（Takara），寶日醫生物技術（北京）有限公司；SuperReal PreMix Color（SYBR Green），天根生化科技（北京）有限公司；防線菌素D ，歐克生命科學；RNase R、RNA純化試劑盒，默克科技公司；瓊脂糖，北京全式金生物技術有限公司；DMEM/F12培養基、胎牛血清，阿勒山（廣州）生物科技有限公司等。

1.1.3" 主要儀器

SimpliAmpTM Thermal Cycler PCR儀、細胞CO2培養箱，賽默飛世爾科技公司；qTOWER3實時熒光定量PCR儀，德國耶拿公司；凝膠成像系統及掃描儀，廣州佰圖生物科技有限公司；高速冷凍離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司；Nano-100微量分光光度計，杭州奧盛儀器有限公司；水平電泳槽電泳儀，北京六一生物科技有限公司等。

1.2" 方 法

1.2.1" 試驗設計

雞原代成肌細胞分離、培養及分化：取11日齡雞胚進行原代肌細胞分離，在無菌條件下處死并采集腹部肌肉組織，用加入雙抗的PBS沖洗肌肉組織3次并剪碎。將肌肉組織碎片置于胰蛋白酶的離心管中，在37°C的搖床上消化90 min，用完全培養基（含有20%胎牛血清DMEM/F12培養基）終止消化。使用70 μm過濾網過濾，濾液1 000 r/min離心5 min，棄上清。底層細胞用完全培養基進行重懸，最后將細胞鋪到無菌細胞培養皿中，置于37 °C、5% CO2培養箱中培養。培養1 h后用無菌PBS清洗，移去未貼壁細胞。每12 h用顯微鏡觀察細胞形態，待細胞匯合度達到90%以上時傳代培養。

1.2.2" 總RNA提取與cDNA合成

取各組織樣品約100 mg，勻漿后用TRIzol法完成總RNA提取，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳和Nano-100微量分光光度計分別驗證總RNA的完整性、濃度及純度，質檢合格的RNA，-80℃保存備用。利用PrimeScriptTMRT reagent kit（Takara）反轉錄試劑盒進行RNA的反轉錄，獲得cDNA模板。

1.2.3" 引物設計、合成與DNA測序

基于高通量測序獲得circMICAL2序列信息，采用NCBI數據庫Primer-BLAST 引物設計工具（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast）完成雞circMICAL2驗證特異性擴增引物設計，包括正向引物和反向引物，線性MICAL2基因采用正向引物進行PCR擴增。PCR擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得PCR擴增目的片段送成都擎科生物科技有限公司測序。表1，圖1

1.2.4" circMICAL2的RNase R處理

根據RNase R說明書要求，將3 U/μg的RNase R與5μg的總RNA混合，在37℃下孵育15分鐘，反應產物使用微量RNA純化試劑盒純化，并反轉錄為cDNA，采用反向引物進行qRT-PCR檢測circMICAL2和線性MICAL2基因豐度變化。

1.2.5" circMICAL2內源穩定性檢測（放線菌素D處理）

在原代肌細胞培養基中以2 μg/mL的濃度添加放線菌素D，分別在0、4、8、12 h培養后收取細胞提取總RNA，去除基因組DNA，反轉錄合成cDNA，采用qRT-PCR分別以反向引物對檢測circMICAL2和線性MICAL2基因表達，對比分析circMICAL2和線性MICAL2基因的半衰期。

1.2.6" circMICAL2組織表達譜

采用qRT-PCR以反向引物對circMICAL2進行組織表達譜分析，GAPDH為內參。反應體系：2×SuperReal Color PreMix 10 μL；上、下游引物各1 μL；cDNA模板1 μL；加dd H2O至7 μL。反應條件：95℃預變性15 min，95℃變性10 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，總40個循環，每個循環檢測熒光強度，qRT-PCR結束后根據熔解曲線檢測PCR產物的特異性，基因表達結果采用比較Ct值法（2-△△Ct）進行分析，每個樣本重復3次。

1.2.7" circMICAL2靶向miRNA與基因預測與功能富集

使用targetscan 8.0和miRanda（www.bioinformatics.com.cn）軟件對circMICAL2靶向miRNA及下游基因結合位點進行預測分析，利用Cytoscape 3.9.1構建circMICAL2-miRNA-mRNA網絡互作圖的制作，并采用DAVID（https：//david.ncifcrf.gov）軟件對circMICAL2靶基進行GO和KEGG富集分析。

1.3" 數據處理

運用GraphPad軟件對兩組間circMICAL2表達差異進行獨立樣本t檢驗并繪圖，Plt;0.05表示統計意義上的差異顯著。

2" 結果與分析

2.1" 雞circMICAL2的鑒定

研究表明，以cDNA為模板時，正向引物和反向引物分別擴增出224 bp和348 bp目的條帶，且條帶清晰明亮；以基因組DNA（gDNA）為模板時，僅正向引物可擴增出目的條帶，且條帶明亮。結果證明雞circMICAL2反向成環真實存在。雞circMICAL2的閉合環狀結構。圖2，圖3

2.2" circMICAL2的穩定性檢測

研究表明，經RNase R酶消化處理組circMICAL2基因豐度與對照組相比無顯著差異（Pgt;0.05），RNase R酶消化處理組線性MICAL2基因豐度極顯著低于對照組（Plt;0.01），雞circMICAL2環狀結構對RNase R酶消化具有較強的抗性，雞circMICAL2真實存在。圖4

circMICAL2和線性MICAL2基因的表達隨著放線菌素D處理時間的增長，circMICAL2和線性MICAL2基因的表達豐度均逐漸降低，但每個檢測時間點circMICAL2表達豐度高于線性MICAL2基因，circMICAL2內源穩定較強。圖5

2.3" circMICAL2雞不同組織中的表達

研究表明，circMICAL2在成年雞和雛雞各組織中均有表達，其中在成年雞和雛雞胸肌和腿肌肌肉中的表達量均高于其他組織。circMICAL2在成年雞胸肌中的表達量顯著高于雛雞（Plt;0.05），在成年雞腿肌中的表達量顯著高于雛雞（Plt;0.05），在成年雞心臟中的表達量顯著高于雛雞（Plt;0.05）。circMICAL2在雞肌肉生長發育的過程中發揮著重要作用。圖6

2.4" circMICAL2功能預測

研究表明，circMICAL2與gga-miR-103-3p和gga-miR-130b-3p具有靶向作用，其中gga-miR-103-3p具有178個潛在靶基因，gga-miR-130b-3p具有47個潛在靶基因。圖7

共鑒定了49個顯著富集GO條目，包括了13個細胞成分、18個生物學過程和18個分子功能生物進程上，主要富集于調控RNA聚合酶Ⅱ基因啟動子的轉錄（GO：0006357～regulation of transcription from RNA polymerase II promoter）、細胞內訊息傳遞（GO：0035556～intracellular signal transduction）、細胞核（GO：0005634～nucleus）、細胞質（GO：0005737～cytoplasm）、細胞溶質（GO：0005829～cytosol）金屬離子結合（GO：0046872～metal ion binding）、蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶活性（GO：0004674～protein serine/threonine kinase activity）等。圖8

circMICAL2 的靶基因顯著富集于8條信號通路，包括MAPK信號通路（gga04010：MAPK signaling pathway）、TGF-β信號通路（gga04350：TGF-beta signaling pathway）、細胞周期（gga04110：Cell cycle）、卵母細胞成熟抑制因子（gga04114：Oocyte meiosis）等。圖9

3" 討 論

3.1

circRNA不僅與人類疾病密切相關，circRNA還在牛、豬、雞等經濟動物生長發育、機體代謝以及繁殖形狀等方面發揮著重要作用［13-15］。circRNA在動物肌肉生長發育過程中起著重要的調控作用，circRNA可通過與肌肉特異性miRNA相互作用，從而參與肌肉生長發育的調控，影響肌肉代謝及細胞能量水平［16-17］。Wei等［18］研究指出circLMO7作為miR-378a-3p的競爭性內源RNA參與牛肌肉發育，circLMO7的過度表達會抑制牛原代成肌細胞的分化。Liu等［19］研究指出綿羊骨骼肌發育同樣與circRNA調控有關，其中circCHRNG作為miR-133海綿上調血清應答因子（SRF）和心肌細胞特異性增強因子2A（MEF2A）的表達水平，從而促進羊成肌細胞增殖。circRNA同樣在雞肌肉生長發育過程中發揮著重要調控作用。circRBFOX2s可以吸附miR-206來促進雞成肌細胞增殖，具有調控雞肌肉生長的作用［20］。circACLY消除gga-miR-6660-3p對靜原雞成肌細胞增殖和分化的抑制，從而促進靜原雞成肌細胞的增殖和分化［21］。余嬌等［22］研究指出，circ-ZBTB10在肌肉組織中高表達，是雞肌肉生長發育過程中的重要調控因子。研究驗證了circMICAL2的真實性，circMICAL2組織表達譜分析表明circMICAL2在在成年雞和雛雞的胸肌和腿肌肌肉中表達量較高，且circMICAL2在雞不同生長發育時期肌肉中的表達量具有顯著差異，circMICAL2對雞肌肉生長發育具有調控作用。

3.2

circRNA具有miRNA結合位點，可以作為miRNA海綿競爭性地結合miRNA調控下游靶基因的表達，從而發揮生物學作用。試驗研究了circMICAL2靶向miRNA以及靶基因預測，分析circMICAL2可能存在的生物學功能。結果表明，circMICAL2靶向的miRNA分別為gga-miR-103-3p和gga-miR-130b-3p，并預測得到225個潛在靶基因。miR-103在動物肌細胞的增殖方面具有重要的調控作用，miR-103在牛骨骼肌衛星細胞分化的過程中表達量上調，具有促進牛骨骼肌衛星細胞的作用［23］。miR-130b能夠通過靶向Sp1轉錄因子促進小鼠肌源分化，在骨骼肌再生和肌病進展中發揮作用［24］。miR-130b-3p負調控Rb1cc1在雞原代成肌細胞分化中的表達，從而促進雞肌肉生長發育［25］。后續研究中應進一步探討circMICAL2與gga-miR-103-3p和gga-miR-130b-3p調控關系，基于miRNA下游調控靶基因闡釋circMICAL2在雞肌肉生長發育中的調控作用。通過對circMICAL2下游225個潛在靶基因的KEGG富集分析得出，circMICAL2的下游靶基因主要富集于TGF-β信號通路（TGF-beta signaling pathway）、MAPK信號通路（MAPK signaling pathway）、細胞周期（Cell cycle）等通路。值得注意的是轉化生長因子-β（TGF-β）信號通路對肌肉的生長發育影響顯著，TGF-β信號通路在骨骼肌生長發育調節中起著重要的作用［26］。TCEA3通過Annexin A1激活TGF-β信號通路從而促進小鼠成肌細胞的分化［27］。TGF-β家族成員肌肉生長抑制素（MSTN）在牛骨骼肌中高表達，敲除MSTN時可以促進牛肌肉衛星細胞的增殖［28］。MAPK信號通路已被證實參與調節豬、大鼠成肌細胞的增殖和分化［29- 30］。另外，MAPK通路同樣被證實參與雞骨骼肌生長發育調節［31］。

4" 結 論

雞circMICAL2真實存在，circMICAL2在雞的肌肉組織（胸肌和腿肌）中高表達，成年雞胸肌和腿肌中circMICAL2表達水平均顯著高于雛雞（P＜0.05）。circMICAL2靶向gga-miR-130b-3p和gga-miR-103-3p，且調控下游225個潛在靶基因。KEGG富集分析發現circMICAL2可能通過TGF-β和MAPK信號通路調控雞肌肉生長發育。circMICAL2在雞肌肉生長發育過程中發揮著重要的調控作用。

參考文獻（References）

［1］

李向陽， 張莉. 2021年中國禽肉市場回顧及 “十四五” 時期展望［J］. 農業展望， 2022， 18（1）： 33-39.

LI Xiangyang， ZHANG Li. Review on China’s poultry market in 2021 and its outlook for the 14th five-year plan period［J］. Agricultural Outlook， 2022， 18（1）： 33-39.

［2］ 鄧小英， 劉圣林， 胡浩， 等. CircRNA翻譯功能的研究進展及問題［J］. 生理科學進展， 2022， 53（3）： 234-238.

DENG Xiaoying， LIU Shenglin， HU Hao， et al. Research advances and problems on the translation functions of CircRNA［J］. Progress in Physiological Sciences， 2022， 53（3）： 234-238.

［3］ Bahn J H， Zhang Q， Li F， et al. The landscape of microRNA， Piwi-interacting RNA， and circular RNA in human saliva［J］. Clinical Chemistry， 2015， 61（1）： 221-230.

［4］ Rochow H， Franz A， Jung M， et al. Instability of circular RNAs in clinical tissue samples impairs their reliable expression analysis using RT-qPCR： from the myth of their advantage as biomarkers to reality［J］. Theranostics， 2020， 10（20）： 9268-9279.

［5］ Xie M Y， Yu T， Jing X M， et al. Exosomal circSHKBP1 promotes gastric cancer progression via regulating the miR-582-3p/HUR/VEGF axis and suppressing HSP90 degradation［J］. Molecular Cancer， 2020， 19（1）： 112.

［6］ Rybak-Wolf A， Stottmeister C， Gla？ar P， et al. Circular RNAs in the mammalian brain are highly abundant， conserved， and dynamically expressed［J］. Molecular Cell， 2015， 58（5）： 870-885.

［7］ Peng W， Zhu S X， Chen J L， et al. Hsa_circRNA_33287 promotes the osteogenic differentiation of maxillary sinus membrane stem cells via miR-214-3p/Runx3［J］. Biomedicine amp; Pharmacotherapy = Biomedecine amp; Pharmacotherapie， 2019， 109： 1709-1717.

［8］ Cai B L， Ma M T， Zhou Z， et al. circPTPN4 regulates myogenesis via the miR-499-3p/NAMPT axis［J］. Journal of Animal Science and Biotechnology，" 2022， 13（1）： 2.

［9］ Yue B L， Yang H Y， Wu J Y， et al. circSVIL regulates bovine myoblast development by inhibiting STAT1 phosphorylation［J］. Science China Life Sciences， 2022， 65（2）： 376-386.

［10］ Yan J Y， Yang Y L， Fan X H， et al. circRNAome profiling reveals circFgfr2 regulates myogenesis and muscle regeneration via a feedback loop［J］. Journal of Cachexia， Sarcopenia and Muscle， 2022， 13（1）： 696-712.

［11］ 歐陽宏佳. 環狀RNA對雞胚胎骨骼肌發育的影響［D］. 廣州： 華南農業大學， 2017.

OUYANG Hongjia. Effect of circular RNA on skeletal muscle development of chicken embryos［D］.Guangzhou： South China Agricultural University， 2017.

［12］ Zhao J， Zhao X Y， Shen X X， et al. CircCCDC91 regulates chicken skeletal muscle development by sponging miR-15 family via activating IGF1-PI3K/AKT signaling pathway［J］. Poultry Science，" 2022， 101（5）： 101803.

［13］ 徐海冬， 冷奇穎， PATRICIA Adu-Asiama， 等. 環狀RNA的特征及其在畜禽中的研究進展［J］. 生物技術通報， 2018， 34（11）： 56-69.

XU Haidong， LENG Qiying， ADUASIAMA PATRICIA， et al. Circular RNAs： research progress and its significance in birds and livestock［J］. Biotechnology Bulletin， 2018， 34（11）： 56-69.

［14］ 劉洪飛. 牛肌肉組織中品種特異性circQTL的鑒定和功能分析［D］. 楊凌： 西北農林科技大學， 2022.

LIU Hongfei. Identification and functional analysis of breed-specific circQTL in bovine muscle tissue［D］.Yangling： Northwest A amp; F University， 2022.

［15］ 付曉偉， 歐陽永灝， 洪樂， 等. 基于高通量測序技術的胰腺癌環狀RNA差異表達譜分析［J］. 安徽醫科大學學報， 2023， 58（1）： 101-108.

FU Xiaowei， OUYANG Yonghao， HONG Le， et al. Analysis of differential expression profile of circRNA in pancreatic cancer based on high-throughput sequencing technology［J］. Acta Universitatis Medicinalis Anhui， 2023， 58（1）： 101-108.

［16］ 賀花， 徐倩穎， 黃永震， 等. 環狀RNA概述及其在動物肌肉發育中的研究進展［J］. 黑龍江畜牧獸醫， 2020（3）： 32-35.

HE Hua， XU Qianying， HUANG Yongzhen， et al. Overview of circRNAs and its research progress in animal muscle development［J］. Heilongjiang Animal Science and Veterinary Medicine， 2020（3）： 32-35.

［17］ Liu R L， Liu X X， Bai X J， et al. Identification and characterization of circRNA in longissimus dorsi of different breeds of cattle［J］. Frontiers in Genetics， 2020， 11： 565085.

［18］ Wei X F， Li H， Yang J M， et al. Circular RNA profiling reveals an abundant circLMO7 that regulates myoblasts differentiation and survival by sponging miR-378a-3p［J］. Cell Death amp; Disease， 2017， 8（10）： e3153.

［19］ Liu Y， Chen Q， Bao J J， et al. Genome-wide analysis of circular RNAs reveals circCHRNG regulates sheep myoblast proliferation via miR-133/SRF and MEF2A axis［J］. International Journal of Molecular Sciences， 2022， 23（24）： 16065.

［20］ Ouyang H J， Chen X L， Wang Z J， et al. Circular RNAs are abundant and dynamically expressed during embryonic muscle development in chickens［J］. DNA Research： an International Journal for Rapid Publication of Reports on Genes and Genomes， 2018， 25（1）： 71-86.

［21］ 王衛振. 靜原雞circACLY調控成肌細胞增殖、分化和凋亡的機制研究［D］. 銀川： 寧夏大學， 2022.

WANG Weizhen. Study on the Mechanism of circACLY Regulating the Proliferation， Differentiation and Apoptosis of Myoblasts in Jingyuan Chicken［D］.Yinchuan： Ningxia University， 2022.

［22］ 余嬌， 黎鎮暉， 聶慶華， 等. 環狀RNA circZBTB10的鑒定及其對雞骨骼肌細胞增殖的影響［J］. 中國家禽， 2018， 40（24）： 7-11.

YU Jiao， LI Zhenhui， NIE Qinghua， et al. Identification of circZBTB10 and its function on chicken myoblast proliferation［J］. China Poultry， 2018， 40（24）： 7-11.

［23］ 孫曉峰， 張偉偉， 王陽， 等. MiR-103在牛骨骼肌衛星細胞中的分化調節作用［J］. 黑龍江畜牧獸醫， 2015（15）： 39-43， 294.

SUN Xiaofeng， ZHANG Weiwei， WANG Yang， et al. The role of miR-103 in the differentiation and regulation on bovine skeletal muscle satellite cells［J］. Heilongjiang Animal Science and Veterinary Medicine， 2015（15）： 39-43， 294.

［24］ Wang Y C， Yao X H， Ma M， et al. MiR-130b inhibits proliferation and promotes differentiation in myocytes via targeting Sp1［J］. Journal of Molecular Cell Biology， 2021， 13（6）： 422-432.

［25］ Xue J， Xue J W， Zhang J， et al. MiR-130b-3p/301b-3p negatively regulated Rb1cc1 expression on myogenic differentiation of chicken primary myoblasts［J］. Biotechnology Letters， 2017， 39（11）： 1611-1619.

［26］ 張菊香， 張鵬， 陳曉萍. TGF-β/肌肉生長抑制素信號通路對骨骼肌作用的研究進展［J］. 航天醫學與醫學工程， 2011， 24（3）： 224-228.

ZHANG Juxiang， ZHANG Peng， CHEN Xiaoping. Research progress on roles of TGF-β/myostatin signaling pathway in skeletal muscle［J］. Space Medicine amp; Medical Engineering， 2011， 24（3）： 224-228.

［27］ 葛瑤. TCEA3通過ANXA1介導TGF-β通路進而影響小鼠成肌細胞分化［D］. 哈爾濱： 東北農業大學， 2019.

GE Yao. TCEA3 Promotes Differentiation of C2C12 Cells Via An Annexin A1-mediated TGF-β Signaling Pathway［D］. Harbin： Northeast Agricultural University， 2019.

［28］ 胡思敏. 牛肌肉衛星細胞中抑制MSTN表達后對脂肪代謝相關基因的影響［D］. 呼和浩特： 內蒙古大學， 2015.

HU Simin. Effect of inhibiting MSTN expression in bovine muscle satellite cells on genes related to fat metabolism［D］.Hohhot： Inner Mongolia University， 2015.

［29］""" 馮陽. MIR-133b，miR-214和miR-495通過MAPK信號通路調節成肌細胞增殖和分化的研究［D］. 武漢： 華中農業大學， 2011.

FENG Yang. The study of MIR-133b， miR-214 and miR-495 regulating myoblast proliferation and differentiation through MAPK signaling pathway［D］. Wuhan： Huazhong Agricultural University， 2011.

［30］ Zou L X， Zhong Y Q， Li X， et al. 3D-printed porous tantalum scaffold improves muscle attachment via integrin-β1-activated AKT/MAPK signaling pathway［J］. ACS Biomaterials Science amp; Engineering，" 2023， 9（2）： 889-899.

［31］""" Wen L， Shumao L， Guihuan L ，et al. Integrative Analyses of miRNA-mRNA Interactions Reveal let-7b， miR-128 and MAPK Pathway Involvement in Muscle Mass Loss in Sex-Linked Dwarf Chickens［J］. International Journal of Molecular Sciences，" 2016， 17（3）： 276.

Identification of chicken circMICAL2， tissue expression profile analysis and its functional prediction

Gulipari Aikebai1， SHEN Xuemei2， YU Shigang1，2， WANG Gang2， YANG Yaling1， LIU Wujun2

（1. College of Animal Science/Xinjiang Agricultural University， Urumqi 830052， China 2. Engineering Research Center of Sichuan Province Higher School of Local Chicken Breeds Industrialization in Southern Sichuan/Leshan Normal University， Leshan Sichuan 614000，China ）

Abstract：【Objective】 The purpose of this study is to verify the authenticity of chicken circular RNA （circMICAL2） and explore the function and regulation mechanism of circMICAL2 in chicken muscle growth and development.

【Methods】 Specific primers based on circMICAL2 circular sequences were designed by PCR amplification， and RNase R and actinomycin D treatments were performed to detect the endogenous stability of circMICAL2.Eight tissue samples from heart， liver， lung， kidney， intestine， skin， chest muscle and leg muscles of 16-day-old and 180-day-old chickens （adult chickens） were collected， and the tissue expression profile of circMICAL2 in different development periods was completed by real-time PCR （qRT-PCR）; Bioinformatics was used to predict circMICAL2-targeted miRNA and mRNA， and to carry out GO function and KEGG pathway enrichment analysis.

【Results】 Chicken circMICAL2 really existed，and its cyclization stability was strong; circMICAL2 was widely expressed in all tissues of adults and chicks， and circMICAL2 was most highly expressed in their chest and leg muscles of adults and chicks， and the expression of circMICAL2 in both adult leg and thorax muscles was significantly higher than that in chicks （Plt;0.05）， indicating that circMICAL2 was closely related to the regulation of chicken muscle growth and development. circMICAL2 targets gga-miR-103-3p and gga-miR-130b-3p regulated 225 downstream potential target genes. The target genes of circMICAL2 were mainly enriched in TGF-β signaling pathway， MAPK signaling pathway， cell cycle and other related signaling pathways.

【Conclusion】 Chicken circMICAL2 really exists， and the expression of circMICAL2 plays an important role in regulating the growth of muscle during different growth and development periods.

Key words：circRNA; muscle; chicken; tissue expression; growth and development

Fund projects：Sichuan Science and Technology Program （2022YFN0039）; Leshan Normal University Science and Technology Program （DGZZ202002，22HX00051）

Correspondence author：LIU Wujun（1966-），female，from Luyi， Henan，professor，research direction：Animal genetics and breeding and reproduction，（E-mail）lwj_ws@163.com

WANG Gang（1979-），male，from Qijiang， Chongqing，professor，research direction：Monitoring and prevention and control of animal diseases，Treatment and utilization of aquaculture waste，（E-mail）Lswanggang@163.com