PRRSV HNHK3-2021毒株的ORF5和ORF7序列分析

doi：10.6048/j.issn.1001-4330.2024.05.028

摘" 要：【目的】研究海南豬繁殖與呼吸綜合征病毒PRRSV的流行病學特征和遺傳變異規律。

【方法】采集海南省海口市及周邊地區樣品，分離出PRRSV HNHK3-2021 毒株，并測定NSP2基因以及 ORF5 和ORF7基因序列，采用Lasergene 7.1進行序列比對分析，用MEGA-X進行遺傳演化分析。

【結果】分離出的PRRSV HNHK3-2021株為美洲型毒株，PRRSV HNHK3-2021株和EF112447 HEB1、EU109503 GD、EU624117 XH-GD的ORF5和ORF7的核苷酸相似性較高，分別為99.2%～99.3%和99.5%～100%，推導氨基酸相似性為99%～99.5%和100%；PRRSV HNHK3-2021株和EU864232 SHB、AY262352_HB-2（sh）2002、AY656990 Abst-1、AY032626 CH-1a、EU807840 CH-1R的ORF5和ORF7的核苷酸相似性為87.1%～96.4%和91.4%～97.3%，推導氨基酸的相似性為86.6%～93%和91.9%～97.6%；PRRSV HNHK3-2021株和JN654459 NADC30、KP860909 FJZ03、MH068878 SD17-38、AY881994 FJ-1的ORF5和ORF7的核苷酸相似性為85.4%～87.1%和89%～91.4%。氨基酸的相似性為86.1%～87.1%和89.5%～91.9%。

【結論】RRSV HNHK3-2021 毒株和EU624117 XH-GD具有最近的遺傳距離。

關鍵詞：

豬繁殖與呼吸綜合征；遺傳進化；ORF5；ORF7

中圖分類號：S85""" 文獻標志碼：A""" 文章編號：1001-4330（2024）05-1292-09

收稿日期（Received）：

2023-10-12

基金項目：

海南省省屬科研院所技術創新專項（jscx202001）;國家自然科學基金項目（32060796）;家畜疫病病原生物學國家重點實驗室開放基金（SKLVEB2020KFKT021）;海南省農業科學院院本級科研項目（HAAS2022PT0205）；國家重點研發計劃（2023YFC3404302）

作者簡介：

范悅軒（1997-），男，新疆奇臺人，碩士研究生，研究方向為家畜傳染病學，（E-mial）1245219231@qq.com

通訊作者：

曹宗喜（1982-） ，男，河南新鄉人，研究員，博士，碩士生/博士生導師，研究方向為家畜傳染病學，（E-mial）caozongxi@163.com

劉光亮（1975-），男，四川資中人，研究員，博士，碩士生/博士生導師，研究方向為動物疫苗研制及分子免疫學，（E-mial）liuguangliang01@caas.cn

0" 引 言

【研究意義】 豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRS virus，PRRSV）所引起的一種高度接觸性傳染病，引起母豬流產和仔豬呼吸道疾病。通過對海南省海口市及周邊地區樣品的分離鑒定后，分析典型毒株PRRSV HNHK3-2021的基因，了解PRRSV在海南的流行情況，進而對海南PRRS防控提供支持。【前人研究進展】豬繁殖與呼吸綜合征病毒PRRSV危害豬養殖業［1］。PRRSV為單股正鏈RNA病毒，長度大約為15 kb，至少包含1個開放閱讀框（ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5、ORF5a、ORF6、ORF7），NSP2作為PRRSV最大的復制酶蛋白［2］，基于各種亞型的PRRSV在該區域差異極為明顯［3］。NSP2能夠順式或反式切割 Nsp2/3結合處［4］，在PRRSV的復制中 至關重要的作用［5］。ORF5編碼的囊膜蛋白是 GP5，GP5含有與病毒中和、病毒保護相關的表位［6］。ORF5基因是 PRRSV 基因組中變化最大的區域之一，各個亞型的PRRSV在此處同樣差異明顯，基于ORF5的PRRSV的分型是公認的PRRSV分型［7］。ORF7編碼的N蛋白是病毒的核衣殼蛋白［8］，該蛋白在血清學反應中較為保守［9］。【本研究切入點】有關海南豬繁殖與呼吸綜合征和PRRSV的研究數據較少，

需對毒株PRRSV HNHK3-2021的 ORF5 和ORF7基因進行測序分析。【擬解決的關鍵問題】

對海南省海口市及周邊地區采樣，進行病毒分離，并對分離獲得的毒株PRRSV HNHK3-2021進行NSP2的基因以及 ORF5 和ORF7基因序列測定分析，了解海南PRRS分子流行情況。

1" 材料與方法

1.1" 材 料

Marc-145細胞由海南省熱帶動物繁育與疫病研究重點實驗室保存；Trizol 試劑、胎牛血清、DMEM培養基、購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司Ex Taq DNA 聚合酶、pMD18 -T購自寶生物工程（大連）有限公司，Plasmid Mini Kit、Gel DNA Exteration Mini Kit、反轉錄酶購自南京諾唯贊生物科技有限公司。NSP2、ORF5、ORF7的擴增引物參照賀冬梅等［10］。表1

1.2" 方 法

1.2.1" 樣品中基因提取

用研缽將組織樣研磨碎，使用Trizol法提取RNA，使用反轉錄試劑盒對樣品反轉錄，反轉錄體系為5× H：SCRIPT Ⅱ qFT Super Mix Ⅱ 4 μL， RNA 100 ng ，dd水補齊至20 μL。反應條件為50℃ 15 min；85℃ 5 s。反轉錄產物進行cDNA的PCR，將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，條件為恒壓90 V，電泳結束后使用紫外凝膠成像系統觀察試驗結果，篩選出陽性樣品。

1.2.2" 病原分離

將篩選出的陽性樣品接種到Marc-145細胞上，放入溫箱每天觀察細胞病變情況，細胞病變達60%～70%，將細胞反復凍融3次，4℃" 6 000 r/min離心10 min，取上清。如此反復，盲傳3～5代。

將已經盲傳3～5代，有明顯病變的Marc-145放入-80℃冰箱，直至完全凍結后在室溫完全溶解，如此反復3次后，提取RNA，反轉錄，進行PCR檢測。

1.2.3" 擴增目的基因

病毒RNA采用Trizol法提取，反轉錄體系為5× H：SCRIPT Ⅱ qFT Srper Mix Ⅱ 4 μL， RNA 100 ng ，dd水補齊至20 μL。反應條件為50℃ 15 min；85℃ 5 s。PRC反應體系：。Ex Taq DNA 聚合酶預混劑25 μL，底物2 μL，水23 μL。反應條件：94℃ 3 min；94℃ 10 s，55℃ 30 s，72℃ 2 min，共30個循環［11］。

1.2.4" 目的基因的連接轉化

將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，對目的條帶進行膠回收，回收產物和pMD18 -T連接，連接產物轉化于DH5α感受態細胞。37℃溫箱培養16 h后挑取陽性菌落送測序。

1.2.5" 測序

從NCBI選取AY032626 CH-1a等14株PRRSV序列運用Lasergene 7.1進行序列比對和相似性分析，用MEGA-X進行遺傳演化分析對測序結果進行序列比對。

2" 結果與分析

2.1" 病原分離結果

研究表明，檢測為PRRSV陽性的樣品接種到Mrac-145細胞上，培養7 d，盲傳3代后，出現細胞圓縮、空泡化、折光性增強、聚集、脫落的細胞病變。2021年度成功分離出6株PRRSV毒株。盲傳3代后，將出現病變的細胞通過反復凍融的方法收集病毒，提取RNA后反轉錄為得到cDNA，使用PCR方法對得到的cDNA進行復檢驗證結果一致。圖1

2.2" NSP2分析

研究表明，對比PRRSV HNHK3-2021株核酸序NSP2與其他毒株，其相較于經典株AY032626 CH-1a在2 780～2 712和2 887～2 992發生了不連續缺失，與高致病毒株EU624117 XH-GD變異株的缺失位置一致，PRRSV HNHK3-2021屬于美洲型高致病型毒株。圖1

2.3" ORF5基因序列分析

研究表明，ORF5基因片段的序列為603 bp，PRRSV HNHK3-2021株的ORF5和EF112447 HEB1、MF370557 FZ06A、EF075945 HUB1、FJ548855 JXA1 P15、EU200962、 Henan-1、EU624117 XH-GDDE等高致性PRRSV的等位基因的核苷酸相似性為98.72%～99.3% ；與KC445138 HZ-31、JN654458 SDSU73、DQ988080 Ingelvac ATP、AY262352_HB-2（sh）2002、AY656990 Abst-1、AY032626 CH-1a、EU807840 CH-1R等經典株PRRSV的等位基因的核苷酸相似性為89.1%～95.8%；和JN654459 NADC30、KP860909 FJZ03、MH651746 SDQZ-1609、MH651747 SDZC-1609、KT945017 HNjz15、MH651748 TJZH-1607、KP861625 CHsx1401等NADC30類PRRSV的等位基因的核苷酸相似性為85.2%～87%。

ORF5的推導氨基酸有200個，堿性氨基酸18個，酸性氨基酸12個，疏水性氨基酸87個，極性氨基酸60個，等電點8.474。RRSV HN株的ORF5和EF112447 HEB1、MF370557 FZ06A、EF075945 HUB1、FJ548855 JXA1 P15、EU200962 Henan-1、EU624117 XH-GDDE等高致性PRRSV的等位基因的推導氨基酸相似性為98.4%～99.0% ；與KC445138 HZ-31、JN654458 SDSU73、DQ988080 Ingelvac ATP、AY262352_HB-2（sh）2002、AY656990 Abst-1、AY032626 CH-1a、EU807840 CH-1R等經典株PRRSV的等位基因的推導氨基酸相似性為86.8%～94.9%；與JN654459 NADC30、KP860909 FJZ03、MH651746 SDQZ-1609、MH651747 SDZC-1609、KT945017 HNjz15、MH651748 TJZH-1607、KP861625 CHsx1401等NADC30類PRRSV的等位基因的推導氨基酸相似性為84%～85.5%。表2，圖2

PRRSV HNHK3-2021和EU624117 XH-GD的遺傳距離最近，其與疫苗毒FJ548855 JXA1 P15在同一分支，在對該毒株的防控中可以對FJ548855 JXA1 P15對應的疫苗優先考慮，并且PRRSV HNHK3-2021與EF112447 HEB1、MF370557 FZ06A、EF075945 HUB1、EU200962 Henan-1等高致性PRRSV屬于同一分支；與KC445138 HZ-31、JN654458 SDSU73、DQ988080 Ingelvac ATP、AY262352_HB-2（sh）2002、AY656990 Abst-1、AY032626 CH-1a、EU807840 CH-1R等經典株PRRSV的遺傳距離較近與JN654459 NADC30、KP860909 FJZ03、MH651746 SDQZ-1609、MH651747 SDZC-1609、KT945017 HNjz15、MH651748 TJZH-1607、KP861625 CHsx1401等NADC30類PRRSV的遺傳距離較遠。

ORF7片段長度為372 bp，PRRSV HNHK3-2021株的ORF7與EF112447 HEB1、MF370557 FZ06A、EF075945 HUB1、FJ548855 JXA1 P15、EU200962 Henan-1、EU624117 XH-GDDE等高致性PRRSV的等位基因的核苷酸相似性為99.5%～100% ；與KC445138 HZ-31、JN654458 SDSU73、DQ988080 Ingelvac ATP、AY262352_HB-2（sh）2002、AY656990 Abst-1、AY032626 CH-1a、EU807840 CH-1R等經典株PRRSV的等位基因的核苷酸相似性為91.9%～96%；與JN654459 NADC30、KP860909 FJZ03、MH651746 SDQZ-1609、MH651747 SDZC-1609、KT945017 HNjz15、MH651748 TJZH-1607、KP861625 CHsx1401等NADC30類PRRSV的等位基因的核苷酸相似性為88.4%～89.2%。表3，圖3

ORF7的推導氨基酸有123個，堿性氨基酸19個酸性氨基酸7個，疏水性氨基酸29個，極性氨基酸43個，等電點10.208。PRRSV HNHK3-2021株的ORF7與EF112447 HEB1、MF370557 FZ06A、EF075945 HUB1、FJ548855 JXA1 P15、EU200962 Henan-1、EU624117 XH-GDDE等高致性PRRSV的等位基因的推導氨基酸相似性為100% ；與KC445138 HZ-31、JN654458 SDSU73、DQ988080 Ingelvac ATP、AY262352_HB-2（sh）2002、AY656990 Abst-1、AY032626 CH-1a、EU807840 CH-1R等經典株PRRSV的等位基因的推導氨基酸相似性為92.7%～96%；與JN654459 NADC30、KP860909 FJZ03、MH651746 SDQZ-1609、MH651747 SDZC-1609、KT945017 HNjz15、MH651748 TJZH-1607、KP861625 CHsx1401等NADC30類PRRSV的等位基因的推導氨基酸相似性為88.7%～90.3%。

PRRSV HNHK3-2021和EU624117 XH-GD的遺傳距離最近，其與疫苗毒FJ548855 JXA1 P15在同一分支，在對該毒株的防控中選取滅活疫苗JXA1，并且PRRSV HNHK3-2021與EF112447 HEB1、MF370557 FZ06A、EF075945 HUB1、EU200962 Henan-1、等高致性PRRSV屬于同一分支；與KC445138 HZ-31、JN654458 SDSU73、DQ988080 Ingelvac ATP、AY262352_HB-2（sh）2002、AY656990 Abst-1、AY032626 CH-1a、EU807840 CH-1R等經典株PRRSV的遺傳距離較近與JN654459 NADC30、KP860909 FJZ03、MH651746 SDQZ-1609、MH651747 SDZC-1609、KT945017 HNjz15、MH651748 TJZH-1607、KP861625 CHsx1401等NADC30類PRRSV的遺傳距離較遠。圖4

3" 討 論

3.1

將PRRSV HNHK3-2021與數據庫中的不同毒株進行對比，其ORF5和ORF7片段都相較于EU624117 XH-GD、EF112447 HEB1、EU109503 GD更加接近。該病毒作為高致病性毒株，其NSP2缺失位點同結果與文獻等［12-14］的研究結果一致。

我國在1995年出現PRRS病例，1996年報道分離出以 CH-1a為代表的經典型毒株［15］。2006年發現以高熱、高發病、高死亡的高致病性毒株［16］，其在NSP2中具有30個氨基酸的缺失［17］，該毒株造成豬死亡［18］。在2013年我國又出現了PRRSV的流行，是由新的NADC30-like毒株所引起的。

3.2

GP5對于病毒復制具有重要意義［19］。ORF5基因是不同亞型的PRRSV存在差異最大的區域之一，歐洲型PRRSV毒株和美洲型PRRSV毒株在此區域只有51%～55%的序列相同，因此在大多數情況下ORF5可以起到病毒分型的作用。N蛋白由ORF7基因編碼，為核衣殼蛋白，為病毒粒子的主要結構蛋白之一，N蛋白可以形成由二硫鍵所連接的同源二聚體，功能是包裝病毒基因組RNA，并且N蛋白是唯一已知的不編碼跨膜結構域或在PRRSV病毒粒子上無外結構域的結構蛋白。滅活疫苗不能保護豬免受高致病性PRRSV的攻擊［20］。PRRSV HN在進化樹上和疫苗毒FJ548855 JXA1 P15在同一分支，因此在今后對PRRSV HN的防治中可以優先使用疫苗 JXA1等高致病性疫苗株進行免疫。

4" 結 論

將海南分離到PRRSV HNHK3-2021株的GP5、GP7基因序列與GenBank上登錄的21株PRRSVGP5、GP7基因序列構建遺傳進化樹顯示，與EU624117 XH-GD（廣東江門分離株）親緣關系最近，為高致病性毒株，屬于美洲型變異株。RRSV HNHK3-2021 毒株和EU624117 XH-GD具有最近的遺傳距離。

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Sequence analysis of ORF3 and ORF5 of PRRSV HNHK3-2021 strain isolated in Hainan

FAN Yuexuan1，2， MA Jiamei1，2， HUANG Chunyuan2，ZHENG Jiaxin2， CHEN Suzhen1，2， ZHANG Yan2， LIU Guangliang1，3，CAO Zongxi1，2

（1. College of Veterinary Medicine， Xinjiang Agricultural University， Urumqi 830052， China; 2. Hainan Provincial Key Laboratory of Tropical Animal Breeding and Disease Research， Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine， Hainan Academy of Agricultural Sciences， Haikou 571100， China; 3. Hainan Provincial Academician Innovation Center， Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine， Hainan Academy of Agricultural Sciences， Haikou 571100， China）

Abstract：【Objective】 To explore the epidemiological characteristics and genetic variation of PRRSV in Hainan.

【Methods】" Samples were collected from Haikou and surrounding areas.The PRRSV strain HNHK3-2021 was isolated， and the NSP2 genes， as well as the ORF5 and ORF7 gene sequences， were determined.Sequence alignment analysis was conducted using Lasergene 7.1， and genetic evolution analysis was performed using MEGA-X.

【Results】" The PRRSV HNHK3-2021 strain isolated was found to be of American origin with high nucleotide similarity to EF112447 HEB1， EU109503 GD， and EU624117 XH-GD ORF5 and ORF7 （99.2%-99.3% and 99.5%-100%， respectively）.The derived amino acid similarity was 99%-99.5% and 100%.The nucleotide similarities of ORF5 and ORF7 of PRRSV HNHK3-2021 strain and EU864232 SHB， AY262352_HB-2（sh）2002， AY656990 Abst-1， AY032626 CH-1a， EU807840 CH-1R were found to be 87.1% -96.4% and 91.4%-97.3%， respectively.Similarly， the similarity of amino acids was 86.6%-93% and 91.9%-97.6%.The nucleotide similarities of ORF5 and ORF7 of PRRSV HNHK3-2021 strain and JN654459 NADC30， KP860909 FJZ03， MH068878 SD17-38， AY881994 FJ-1 were found to be 85.4%-87.1% and 89%-91.4%.The similarity of amino acids was 86.1%-87.1% and 89.5%-91.9%.

【Conclusion】 The PRRSV HNHK3-2021 strain and EU624117 XH-GD have the closest genetic distance.

Key words：porcine reproductive and respiratory syndrome; genetic evolution analysis; ORF5; ORF7

Fund projects：Technological Innovation Project of Hainan Provincial Scientific Research Institutes（jscx202001）;The National Natural Science Foundation of China（32060796）;Open Fund of the State Key Laboratory of Pathogenic Biology of Livestock Diseases（SKLVEB2020KFKT021）;Hainan Provincial Academy of Agricultural Sciences Research Project at the same level（HAAS2022PT0205）；National Key Ramp;D Program of China（2023YFC3404302）

Correspondence author：CAO Zongxi （1982- ）， male， from Xinxiang Henan， researcher， doctor， doctoral supervisor， research direction： livestock infectious diseases， （E-mail）caozongxi@163.com

LIU Guangliang （1975- ）， male， from Zizhong Sichuan， researcher， doctor， doctoral supervisor， research direction：animal vaccine development and molecular immunology， （E-mail）liuguangliang01@caas.cn