?鎘脅迫下鄰苯二甲酸酯降解菌的篩選及其應用研究?

引用格式：周冰玉，周宇，王春平，等. 鎘脅迫下鄰苯二甲酸酯降解菌的篩選及其應用研究[J]. 湖南農業科學，2024（6）：1-4，9.

DOI：10.16498/j.cnki.hnnykx.2024.006.001

收稿日期：2024-02-01

基金項目：湖南省自然科學基金（2020JJ5321；2021JJ30412）

作者簡介：周冰玉（1989—），女，湖南長沙市人，工程師，主要從事農業環境資源基礎與應用研究。

通信作者：劉標

摘要：為豐富鎘脅迫下能高效降解鄰苯二甲酸酯的微生物資源，該研究通過含有鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）和鎘的無機鹽液體培養基從實驗室保藏菌株中篩選到1株DEHP高效降解菌B-7，并對菌株特性進行了研究。菌株B-7為解淀粉芽孢桿菌，生物安全性高，對DEHP的降解性能優良，發揮降解作用的最適溫度為25～40℃、最適pH值為6～8。菌株B-7在DEHP初始濃度為400 mg/L、鎘含量為10 mmol/L的無機鹽培養基中培養4 d，其對DEHP的降解率高達93.1%，且該菌株對DMP、DEP、DBP均具有較強的降解能力。在鎘和DEHP復合污染的土壤中，B-7與土壤土著微生物的協同降解顯著提高了DEHP的降解率，表明該菌株在鎘和鄰苯二甲酸酯復合污染土壤的微生物修復領域具有潛在應用價值。

關鍵詞：鄰苯二甲酸酯；鎘；解淀粉芽孢桿菌；土壤生物修復

中圖分類號：Q939.96; X172 文獻標識碼：A 文章編號：1006-060X（2024）06-0001-04

Screening and Application of a Phthalate Ester-Degrading Strain under Cadmium Stress

ZHOU Bing-yu，ZHOU Yu，WANG Chun-ping，LIU Fen，LIU Biao

（Hunan Institute of Microbiology， Changsha 410009， PRC）

Abstract： To enrich the phthalate ester （PAE）-degrading microbial resources under cadmium stress， we screened out an efficient di-（2-ethylhexyl） phthalate （DEHP）-degrading strain B-7 by using the inorganic salt liquid medium containing DEHP and cadmium from the strains preserved in our laboratory and studied the characteristics of the strain. Strain B-7 was Bacillus amyloliquefaciens with high biosafety and strong ability of degrading DEHP. The strain exerted the optimal degradation effect at 25-40 ℃ and pH 6-8. When cultured in the inorganic salt medium with an initial DEHP concentration of 400 mg/L and cadmium concentration of 10 mmol/L for 4 days， the strain showcased the degradation rate of 93.1% for DEHP. Moreover， the strain demonstrated strong degradation effects on dimethyl phthalate （DMP）， diethylphthalate （DEP）， and dibutyl phthalate （DBP）. In the soil contaminated with both cadmium and DEHP， strain B-7 coordinated with the indigenous microorganisms in soil to increase the degradation rate of DEHP. The results suggested that strain B-7 demonstrated a promising application prospect in the bioremediation of cadmium and PAE-contaminated soil.

Key words： phthalate esters; cadmium; Bacillus amyloliquefaciens; soil bioremediation

鄰苯二甲酸酯（Phthalic acid esters，PAEs）作為增塑劑被廣泛使用。在塑料薄膜制品中，PAEs主要以游離態存在，它們依靠氫鍵和范德華力而不是共價鍵結合，因此不能穩定存在于塑料中。隨著時間的推移，PAEs會逐漸從塑料薄膜中釋放出來造成環境污染[1-2]。PAEs是一類具有內分泌干擾特性的雌激素，即使在低濃度下也會干擾動物的內分泌系統，且伴有致畸、致突變和致癌的風險[3]。隨著大棚蔬菜產業的發展，地膜的投入量大幅度增加，導致農田土壤中PAEs含量不斷上升。這些有機污染物不僅影響土壤質量，還可能通過食物鏈進入人體，最終危害人類的健康[4-5]。近年來，人們對土壤質量和農產品安全的關注度不斷提高，如何降解農田土壤的PAEs成為亟待解決的問題[6]。

在土壤中，PAEs的水解和光解速率非常緩慢，主要依靠微生物降解[7]。部分土壤中缺少降解PAEs的高效土著微生物，導致這些土壤中殘留的PAEs濃度較高。通過添加外源微生物菌劑，可以提高土壤中PAEs的降解率，且該措施具有綠色高效、成本低、操作簡單等優點，成為當前的研究熱點[8-13]。目前報道的降解菌株大多數是針對單一鄰苯二甲酸酯污染進行篩選的，而實際土壤中往往存在PAEs和重金屬的復合污染[14]。陳欣瑤等[15]研究發現土壤微生物量和微生物菌落數隨著鎘含量的增加而降低，因此已篩選菌株在復合污染土壤修復中的應用效果有待進一步評價。

該研究以相對難降解的鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）為對象，以實驗室前期保存的用于生物有機肥添加的生物安全菌株為菌種庫，從中篩選能夠在鎘脅迫下高效降解DEHP的菌株，并對其應用效果進行分析，以期豐富鄰苯二甲酸酯和鎘復合污染土壤修復的微生物資源。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與培養基

主要試劑為鄰苯二甲酸二甲酯（DMP）、鄰苯二甲酸二乙酯（DEP）、鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）、鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP），均購自國藥集團化學試劑有限公司（分析純，＞99%）。

種子培養基為牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.4。無機鹽（MSM）培養基：KH2PO4 4.5 g，K2HPO4 5.8 g，（NH4）2SO4 2.0 g，NaCl 0.75 g，CaCl2 0.02 g，MgCl2 0.16 g，FeCl3 0.002 g，pH值7.0；固體培養基按1.5%～2%的比例添加瓊脂粉。含PAEs的MSM培養基：分別用甲醇配置4種PAEs母液（濃度為10 g/L），0.22 μm無菌濾膜過濾，再按比例添加到MSM培養基中，配制成以PAEs為唯一碳源的培養基；往上述培養基中加入一定量的CdCl2配置成含鎘和PAEs的無機鹽培養基。

1.2 鎘脅迫下鄰苯二甲酸酯降解菌株的篩選

1.2.1 降解菌株的初篩 待篩選菌種為11株實驗室分離保存的、可用于生物有機肥添加的生物安全菌株，編號分別為X-4、X-6、X-7、X-8、B-3、B-6、B-7、B-8、B-9、LH-1和LH-2。利用牛肉膏蛋白胨培養基制備11株待篩菌株的種子液，按1%接種量分別將各菌株種子液接種到含有DEHP和鎘的MSM液體培養基中（DEHP終濃度為400 mg/L、鎘含量為10 mmol/L），在30℃、150 r/min條件下遮光振蕩培養，第4天時取樣測定各培養液的OD600，以此判斷菌株在鎘脅迫下利用碳源PAEs生長繁殖的能力。

1.2.2 降解菌株的復篩 將初篩獲得的菌株接種到牛肉膏蛋白胨培養基中，培養16 h至對數生長期，收集菌液離心、棄上清，加入無菌水重懸菌體，作為種子液備用。按1%（V/V）的接種量將種子液轉接到DEHP初始濃度為400 mg/L、鎘含量為10 mmol/L的MSM培養基中，30℃、150 r/min條件下遮光振蕩培養，每隔1 d取樣測定培養液中剩余的DEHP含量，連續測定7 d。

1.3 DEHP含量的測定

對培養液中剩余的DEHP進行萃取復溶，利用高效液相色譜法（HPLC）測定DEHP含量[16]。具體操作方法為：在培養液中加入50 mL正己烷萃取，收集有機相，重復2次；將2次萃取液混合，在旋轉蒸發儀上將正己烷蒸干，加入10 mL甲醇溶解萃取物，過0.22 μm有機相過濾器，濾液用HPLC色譜儀測定DEHP含量。HPLC條件：色譜柱為Agilent Eclipse XDB-18（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇 ∶ 水=95∶5；進樣量20 μL，柱溫35℃，流速1 mL/min，檢測波長為228 nm。

1.4 不同溫度、pH值對菌株降解DEHP的影響

1.4.1 溫度的影響 按1%的接種量將復篩菌株種子液轉接至DEHP初始濃度為400 mg/L、鎘含量為10 mmol/L的MSM培養基中，分別設定培養溫度為15、20、25、30、35、40℃，其他條件相同，培養4 d后測定培養液的DEHP含量。以相同溫度但未添加外源菌劑的處理作為對照，按照公式（1）計算各溫度下的降解率。

1.4.2 pH值的影響 分別用HCl和NaOH將DEHP初始濃度為400 mg/L、鎘含量為10 mmol/L的MSM液體培養基的pH值調節為4、5、6、7、8、9，再接種1%菌株種子液，30℃、150 r/min條件下遮光培養4 d后測定DEHP含量，以相同初始pH值但未添加外源菌劑的處理作為對照，按照公式（1）計算各pH值下的降解率。

1.5 菌株對不同類型PAEs的降解能力比較

按1%的接種量將復篩菌株的種子液轉接到含不同類型PAEs（DMP、DEP、DBP、DEHP）的MSM培養基中（初始濃度均為400 mg/L），30℃、150 r/min條件下遮光培養4 d。使用紫外分光光度計測定菌株生長量，采用高效液相色譜法檢測各類型培養液中PAEs的殘留含量，根據公式（2）計算降解率。

（2）

1.6 鎘脅迫下菌株對DEHP污染土壤的修復能力

模擬試驗所用土壤取自湖南益陽某辣椒種植農田（未檢出DEHP，鎘含量為0.79 mg/kg）。菌株通過牛肉膏蛋白胨培養基擴繁后，將菌液離心后棄上清液，使用無菌水重懸菌體，調節菌懸液濃度至108 CFU/mL備用。為了探明鎘脅迫下單一菌株B-7對DEHP污染土壤的修復能力以及菌株B-7與土壤土著微生物協同降解DEHP的效果，試驗設置土壤滅菌組和未滅菌組。分別取500 g過20目篩后土壤及滅菌土壤（121℃滅菌40 min）裝入塑料盆中，添加DEHP溶液調節終濃度約為100 mg/kg，按1%量（V/W，

mL/g）接種B-7菌懸液到土壤中，將塑料盆放置于防雨水的塑料大棚中，每隔5 d取樣測定DEHP含量，總周期30 d。滅菌組與未滅菌組均以接種相同體積蒸餾水為對照，每個處理設置3個生物學重復。土壤中DEHP的萃取檢測方法參照謝婧[17]研究的步驟進行。

1.7 數據統計分析

使用Excel 2007軟件進行數據處理和繪圖，使用SPSS 25軟件進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 鎘脅迫下鄰苯二甲酸降解菌株的篩選

在初篩試驗中，經過4 d培養后，菌株B-7的培養液OD600為1.028，其他10株細菌均未見明顯生長，OD600為0，即11株細菌中只有B-7能在鎘脅迫下以DEHP作為唯一碳源進行生長繁殖。菌株B-7為實驗室前期分離獲得的解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens），在微生物肥料生物安全通用技術準則（NY/T 1109—2017）中，解淀粉芽孢桿菌為第一級免做毒理學試驗的菌種，生物安全性高。菌株B-7在以DEHP為唯一碳源的培養基中能夠迅速生長，生長遲緩期很短。由圖1可知，接種1 d后對DEHP初始濃度為400 mg/L的培養液進行測定，發現DEHP降解率達到50.1%，此后繼續保持較強的降解速率，4 d后DEHP降解率達到93.1%。隨著培養基中DEHP的消耗及次級代謝產物的積累，菌株B-7逐漸進入衰亡期，DEHP含量無顯著變化。在其他高效降解菌株（如E1、ASW6D）篩選過程中均經歷富集馴化過程，而菌株B-7未經馴化對DEHP的降解率就達90%以上，說明菌株B-7具有優良的DEHP降解性能。

2.2 不同溫度、pH值對B-7降解DEHP的影響

為了探究菌株B-7適應實際農業生產環境的性能，該研究分析了不同溫度條件下菌株B-7對DEHP降解能力的差異。如圖2（a）所示，在15～25℃范圍內，B-7對DEHP的降解率與溫度呈正相關關系，表明低溫對B-7的降解性能有顯著影響；在25～40℃范圍內，其降解率均保持在較高的水平，表明該菌株能在較寬范圍的環境溫度下發揮作用。

不同pH值條件下菌株B-7對DEHP的降解率有顯著差異，結合湖南地區土壤pH值的實際情況，分析pH值4～9時B-7對DEHP降解情況。圖2（b）顯示，菌株降解DEHP的最佳pH值為6～8，此時降解率均達86%以上；在pH值為5或9時，降解率顯著降低，但仍大于60%。這表明，pH值對菌株B-7降解性能有較大影響，但較寬pH范圍下B-7均能高效降解DEHP。

2.3 菌株B-7對不同類型PAEs降解能力的分析

表1顯示，菌株B-7在4種PAEs底物的培養基中均能較好地生長，培養4 d后DMP、DEP、DBP和DEHP的降解率均大于85%，統計分析結果表明，菌株B-7對4種PAEs的降解能力并無顯著性差異。

2.4 鎘脅迫下B-7對DEHP污染土壤的修復效果

由圖3可知，在對照組中，經過滅菌處理后，土壤中的DEHP降解速度非常緩慢，30 d時降解率僅為12.4%，而未滅菌土壤中DEHP降解率為53.3%，表明土壤微生物在DEHP的降解中起主要作用；接種B-7的滅菌土壤組降解率為45.5%，而未滅菌土壤組降解率達到85.7%，說明在菌株B-7與土壤土著微生物協助配合下，土壤中的DEHP降解率得到顯著提高。在滅菌和未滅菌2種類型的土壤中，B-7接種組的降解率均顯著高于相對應的未接種組，表明菌株B-7顯著提高了土壤中DEHP的降解率。

3 結論與討論

該研究從實驗室保存菌株中篩選到1株在鎘脅迫下能高效降解鄰苯二甲酸酯的解淀粉芽孢桿菌B-7。在DEHP初始濃度為400 mg/L的MSM培養基中培養4 d后，菌株B-7對DEHP的降解率可達93.1%，B-7在以DEHP為唯一碳源的培養基中能夠迅速生長，生長遲緩期很短，這一結果與紫色桿菌屬菌株E1[14]、分枝桿菌ASW6D[18]降解DEHP的研究結果類似。微生物的生長繁殖主要受環境溫度、pH值的影響，其分泌的相關功能酶的活性也與這2個環境條件密切相關。菌株B-7發揮作用的最適溫度為25～40℃，這與楊婧等[18]的研究中菌株ASW6D最適溫度范圍類似；菌株B-7的最適pH值為6～8，在這個范圍外，其對DEHP的降解能力大大降低，這與Wu等[19]研究中菌株JDC-41降解DBP的特性類似。此外，該研究發現菌株B-7對DMP、DEP、DBP和DEHP多種類型的PAEs均有較強的降解能力且對4種PAEs的降解能力無顯著性差異，這與已報道的菌株ASW6D[18]和B3[20]降解DMP、DEP、DBP比降解DEHP的效果更佳這一結果不同。根據調查，我國部分農田土壤為多種PAEs的復合污染（主要是DBP、DEHP），該菌株能夠降解多種PAEs，進一步說明在修復多種PAEs污染的農田土壤上具有實際應用價值。探究鎘脅迫下B-7對DEHP污染土壤的修復能力，發現添加菌株B-7可以顯著提高土壤中DEHP的降解率，證明其在鎘和PAEs復合污染土壤的微生物修復領域具有潛在應用價值。

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（責任編輯：王婷）