溴蟲氟苯雙酰胺影響灰茶尺蠖成蟲合成與識別性信息素的能力

摘要：灰茶尺蠖（Ectropis grisescens"Warren）是重要的茶樹害蟲，廣泛分布于我國主要茶產區，干擾其性信息素通訊是防治該類害蟲的有效方式。使用亞致死劑量的溴蟲氟苯雙酰胺處理灰茶尺蠖成蟲，利用風洞測試發現雄蛾對性信息素誘芯表現出活躍、起飛、接觸行為發生的占比分別下降了13.79%、44.23%、60.00%，且反應發生時間顯著延長。進一步的電生理分析發現，處理組雄蛾對0.01 mg·L^-1的性信息素組分Z3，Z6，Z9-18：H的觸角電位反應下降了54.57%。另外，當雌蛾受到溴蟲氟苯雙酰胺處理，GC-MS分析結果顯示，雌蛾性腺性信息素主成分Z3，Z6，Z9-18：H和Z3，epo6，Z9-18：H的含量分別下降了21.76%和34.71%，雌蛾合成性信息素的能力顯著削弱。雌蛾經溴蟲氟苯雙酰胺處理，參與性信息素合成的潛在基因Egri-CYP340BD1表達量顯著下降。研究結果表明，溴蟲氟苯雙酰胺處理能顯著干擾灰茶尺蠖成蟲的性信息素通訊，將為茶園尺蠖類害蟲行為調控提供技術參考。

關鍵詞：灰茶尺蠖；溴蟲氟苯雙酰胺；性信息素識別；行為調控

中圖分類號："S571.1；R435.711 """"""""""""文獻標識碼：A"""""""""""文章編號：1000-369X（2024）04-618-09

Effects of Broflanilide on the Biosynthesis and Recognition of Sex Pheromone in the Tea Grey Geometrid Ectropis grisescens

XU Changxia¹， LUO Zongxiu²， MA Long^1*

1. College of Life Sciences， Jiangxi Science amp; Technology Normal University， Nanchang 330013， China;2. Tea Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Science， Hangzhou 310008， China

Abstract："The tea grey geometrid Ectropis grisescens"Warren"is a devastating chewing pest in tea plantations throughout China， and interfering with the sex pheromone recognition communication between female and male"moths becomes an effective method to manage this insect pest. In the present study， the sublethal dose of broflanilide was used to treat adult E. grisescens. The results of wind tunnel tests reveal that the broflanilide-treated male adults showed a declined percentage of the behavioral responses， including excitation， oriented flight， and source contact. However， the corresponding durations of behavioral responses in male moths were significantly increased. Further studies using electrophysiological assays demonstrate that the electroantennogram responses of broflanilide-treated"male moths to the sex pheromone of Z3，Z6，Z9-18：H at 0.01 mg·mL^-1"were"decreased by 54.57%. Besides， when female moths were treated with a sublethal dose of broflanilide， the gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS）"analyses demonstrates that the major sex pheromone components， Z3，Z6，Z9-18：H and Z3，epo6，Z9-18：H， in the female pheromone gland were decreased by 21.76% and 34.71%"respectively compared with the control. This result reveals the suppression of sex pheromone biosynthesis in broflanilide-treated female moths. Further study by qRT-PCR analysis reveals that a cytochrome P450 monooxygenase of Egri-CYP340BD1"enriched in pheromone gland was significantly up-regulated in broflanilide-treated female moths. Taken together， this study demonstrates that broflanilide treatment would manipulate the courtship of this insect pest， and the results would contribute to the design of insect-behavior-modifying technology in novel pest management.

Keywords："Ectropis grisescens， broflanilide， sex pheromone recognition， behavior modification

灰茶尺蠖（Ectropis grisescens"Warren）以幼蟲食葉為害，嚴重發生時可將茶樹葉片完全啃食，是危害我國茶葉生產的重要害蟲。由于灰茶尺蠖與另一種重要茶樹害蟲——茶尺蠖（Ectropis obliqua Prout）外形特征極為相似且分布地區存在重疊，在生產上常引起混淆，都稱為“茶尺蠖”，極大影響了專一性防控手段的使用^[1]。例如，在推廣茶尺蠖核型多角體病毒防治“茶尺蠖”時發現，不同地區的“茶尺蠖”對其敏感性存在巨大差異^[2]。后續對采自13個省份的2 588頭茶尺蠖和灰茶尺蠖樣品進行分子鑒定，結果發現灰茶尺蠖廣泛分布于我國主要茶產區，是危害茶樹的優勢尺蛾科物種，而茶尺蠖僅分布于江蘇、安徽、浙江的部分區縣^[3]。為了明確灰茶尺蠖的性信息素成分，羅宗秀等^[4]通過氣相色譜-昆蟲觸角電位聯用對灰茶尺蠖性腺粗提物進行分離鑒定，最終確定其性信息素成分為順3，順6，順9-十八碳三烯（Z3，Z6，Z9-18：H）和順3，順9-6，7-環氧十八碳二烯（Z3，epo6，Z9-18：H），為人工合成性信息素用于灰茶尺蠖的田間誘捕打下了基礎。隨后，通過灰茶尺蠖性腺轉錄組測序鑒定出了30個在雌蛾性腺高表達的細胞色素P450基因（Cytochrome P450"monooxygenases，CYPs），這些性腺高表達的CYPs可能參與性信息素的合成，通過環氧化作用把三烯轉化為環氧二烯^[5]。

鱗翅目昆蟲的求偶通訊主要依靠性信息素交流來完成，干擾鱗翅目害蟲的性信息素通訊成為害蟲防治的有效手段。日本靜岡縣使用人工合成的茶小卷葉蛾（Adoxophyes honmai）性信息素干擾雄蛾找到異性完成交配，迷向防治效果達到99%^[6]。已有研究表明，亞致死劑量的農藥也會干擾鱗翅目昆蟲的性信息素通訊。例如，使用亞致死劑量的噻蟲啉處理蘋果蠹蛾（Cydia pomonella），發現噻蟲啉顯著降低雌蛾的求偶行為，同時減少性信息素主成分Codlemone的合成^[7]。溴蟲氟苯雙酰胺（Broflanilide）是一種作用于γ-氨基丁酸受體的新型間二酰胺類殺蟲劑，對多種鱗翅目、鞘翅目、半翅目害蟲有較高的殺蟲活性^[8]。王洪濤等^[9]利用噴霧法進行了田間藥效試驗，發現10%的溴蟲氟苯雙酰胺懸浮劑對2種為害較重的茶園刺吸式害蟲黑刺粉虱（Aleurocanthus spiniferus"Quaintance）和小貫小綠葉蟬（Empoasca onukii"Matsuda）具有良好的防控效果，但使用溴蟲氟苯雙酰胺防治茶園尺蠖類害蟲還未見報道。本研究從行為學、電生理和性信息素定量分析等方面，探究溴蟲氟苯雙酰胺處理對灰茶尺蠖成蟲合成和識別性信息素的影響，旨在為茶園應用溴蟲氟苯雙酰胺防治灰茶尺蠖提供參考。

1"材料與方法

1.1 供試蟲源

研究所用灰茶尺蠖采自浙江省紹興市御茶村茶場，灰茶尺蠖幼蟲置于人工氣候室內，使用新鮮茶枝飼養。養蟲室溫度設置為（25±1） ℃，相對濕度為（70±5）%，光周期為14L︰10D。幼蟲飼養至化蛹，將雌雄蛹區分開后置于不同的養蟲籠內（50 cm×50 cm×50 cm），待成蟲羽化后用10%的蜂蜜水飼喂^[10]。

1.2 溴蟲氟苯雙酰胺處理灰茶尺蠖蛾

溴蟲氟苯雙酰胺懸浮劑（100 g·L^-1）購自巴斯夫植物保護（江蘇）有限公司，參照推薦用量及該藥劑對斜紋夜蛾的室內生測結果^[11]，選取并配制質量濃度為6.65 μg·mL^-1的該藥劑作為亞致死劑量，并測定該濃度對剛羽化的灰茶尺蠖成蟲24 h和48 h的校正死亡率。取133 μL藥劑溶于500 mL純水中，稀釋4倍后備用。將灰茶尺蠖的蛹置于養蟲籠內，白天進行暗處理，晚上進行光照處理，白天每隔1 h在紅光下觀察是否有成蟲羽化。將羽化后的成蟲區分雌雄后分別置于不同的養蟲籠中，每籠放置30頭，處理組噴20 mL的藥劑，對照組噴等量的清水。待溴蟲氟苯雙酰胺處理后48 h，通過風洞試驗測試處理雄蛾對性誘芯的趨性行為，切取雄蛾觸角測試對性信息素組分的觸角電位反應。另外，在紅光下觀察雌蛾是否展示出求偶行為，將處于求偶狀態下的雌蛾取出，收集性腺對性信息素組分進行定量分析。

1.3 風洞試驗

待溴蟲氟苯雙酰胺處理后48 h，用風洞試驗測試灰茶尺蠖雄蛾趨向性信息素的行為反應。風洞系統主體為有機玻璃構成（150 cm×50 cm×50 cm），前端安裝可調的氣流發生裝置、活性炭過濾系統以及平順氣流的蜂窩狀氣流通道。風洞后端安裝氣流流速控制閥以及溫度、濕度和風速監測系統。試驗期間風洞內溫度保持在21～25 ℃，相對濕度為70%～80%，氣流流速0.3～0.4 m·s^-1。性誘芯由異戊二烯橡膠塞構成，加入400 μg的Z3，Z6，Z9-18：H和600 μg的Z3，epo6，Z9-18：H，靜置30 min后使用。將性誘芯懸掛于風洞的前端，待測試的灰茶尺蠖雄蛾單頭放置于培養皿內用蓋子蓋住，隨后將培養皿置于風洞的下風口處。測試時，將培養皿蓋子打開，觀察和記錄單頭雄蛾在10 min內發生活躍、起飛、接觸誘芯等行為的時間。每組測試20頭灰茶尺蠖雄蟲，重復測試3組。

1.4 灰茶尺蠖雄蛾對性信息素組分的觸角電位反應

觸角電位技術（Electroantennogram，EAG）是研究昆蟲對揮發性信息物質電生理反應的一種重要方法，它是昆蟲觸角上全部化學感受器對刺激物的電生理反應的總和，通過反應值的大小可以初步判斷刺激物對昆蟲是否有生理活性。

待溴蟲氟苯雙酰胺處理灰茶尺蠖雄蛾48 h，測試雄蛾對性信息素組分觸角電位反應的變化。用鑷子將待測灰茶尺蠖雄蛾頭部取下，在顯微鏡下用刀片將觸角從基部切下，將觸角端部也切下一小段。將離體觸角的基部和端部用導電膠分別固定在電極兩端，電極裝在觸角電位儀上待測。氣流首先通過活性炭過濾，再通過加濕瓶，并以800 mL·min^-1的流速吹向觸角。待測性信息素組分Z3，Z6，Z9-18：H和Z3，epo6，Z9-18：H分別用正已烷配成10 μg·μL^-1的母液，然后稀釋得到4個質量濃度1、0.1、0.01、0.001 μg·μL^-1作為刺激味源。將20 μL的化合物滴到5 mm×60 mm的濾紙條上，待溶劑揮發后，迅速放到巴德斯滴管中，兩端封口靜置。測試時，味源刺激時間為0.3 s，兩次刺激時間間隔為60 s。以20 μL的正己烷作為空白對照，以反-2-己烯醛作為內參標準，EAG反應的相對值=（樣品的反應值－對照的反應值）/（參照的反應值－對照的反應值）。每一種濃度的性信息素組分至少測定15根觸角，每一頭灰茶尺蠖雄蛾僅隨機選用一根觸角。

1.5 灰茶尺蠖雌蛾性信息素的粗提取

灰茶尺蠖雌蛾性信息素的提取采用正已烷浸提法。待溴蟲氟苯雙酰胺處理后48 h，選擇求偶狀態下的雌蛾，擠壓雌蛾腹部使其性腺露出，自第8腹節剪下性腺。每10頭為一組，將剪下后的性腺放入裝有150 μL正己烷的進樣瓶中浸提30 min，粗提物用氮吹濃縮后置于﹣20 ℃冰箱中保存。

1.6 GC-MS分析灰茶尺蠖性信息素組分的含量

使用GC-MS對雌性灰茶尺蠖性信息素活性成分進行定量分析，所用的氣質聯用儀為Agilent 7890A氣相色譜串聯5977B質譜，裝配DB-23型毛細色譜柱。采用無分流進樣方式，進樣口溫度為220 ℃，柱溫起始溫度為50 ℃，保持2 min；然后以10 ℃·min^-1升至160 ℃；再以4 ℃·min^-1上升至220 ℃，保持5 min。所用載氣為99.999%純度的氦氣，流速為1 mL·min^-1。MS電離方式為電子轟擊電離，電離能量為70 eV，離子源發生器溫度為250 ℃，質量（m/z）掃描范圍為40～400。將梯度濃度的Z3，Z6，Z9-18：H和Z3，epo6，Z9-18：H正己烷標準品和灰茶尺蠖性信息素提取液使用自動進樣器連續進樣，進樣量為1 μL。

1.7"灰茶尺蠖雌蛾性腺總RNA的提取與反轉錄

使用總RNA快速提取試劑盒（浙江易思德）提取灰茶尺蠖性腺總RNA。待溴蟲氟苯雙酰胺處理后48 h，取5頭雌蛾性腺作為一組，設置3組生物學重復。并使用分光光度計和1%的瓊脂糖凝膠電泳進行RNA純度及完整性檢測。反轉錄采用HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR （+gDNA wiper）（南京諾唯贊）試劑盒說明書合成cDNA，步驟如下：取1 μg的總RNA為模板，加入4 μL的gDNA wiper Mix，補充RNase-free ddH₂O到16 μL，42 ℃孵育2 min。向第一步的反應液中加入4 μL的HiScript"Ⅲ"qRT SuperMix混勻。37 ℃孵育15 min，85 ℃孵育15 s，進行逆轉錄反應，產物在﹣20 ℃保存。

1.8 熒光定量qRT-PCR反應

用Beacon Designer 7.7軟件設計熒光定量引物（表1）。

熒光定量所用儀器為Roche Light Cycler 480 detector（Stratagene，La Jolla，CA，USA）。熒光定量試劑使用ChamQ^TM"SYBR qPCR Master Mix（南京諾唯贊），20 μL的反應體系包含：10 μL的ChamQ^TM"SYBR qPCR Master Mix、正反向引物各0.4 μL、2 μL的cDNA模板、7.2 μL的ddH₂O。反應條件如下：95 ℃"30 s（預變性）；95 ℃ 10 s，60 ℃"30 s，40個循環；95 ℃"15 s，60 ℃"60 s，95 ℃"15 s（熔解曲線分析）。每個反應設置3個獨立的生物重復，并重復3次（技術重復）。選擇甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）和GTP結合蛋白（GT）作為內參基因。采用2-△△CT法計算目的基因的相對表達水平^[12]。

1.9 數據分析

利用SPSS 21.0軟件對試驗數據進行統計分析，對照和藥劑處理組個體的行為反應差異采用卡方檢測進行分析。對照和藥劑處理組的基因表達量變化、EAG反應值、信息素組分含量的差異用Student’s t法進行差異顯著性檢驗。

2"結果與分析

2.1 溴蟲氟苯雙酰胺處理影響雌蛾對性誘芯的行為反應

通過風洞測試研究亞致死劑量的溴蟲氟

苯雙酰胺處理對灰茶尺蠖雄蛾趨向性信息素的行為變化，結果發現，與對照組相比，雄蛾經溴蟲氟苯雙酰胺處理后48 h對性誘芯表現出活躍、起飛、接觸行為發生的占比分別顯著下降了13.79%、44.23%、60.00%（圖1A），而表現出活躍、起飛、接觸行為發生時間分別顯著延長了28.44、38.94、68.40 s（圖1B），說明溴蟲氟苯雙酰胺處理顯著降低了灰茶尺蠖雌蛾對其性信息素的趨向行為。

2.2 溴蟲氟苯雙酰胺處理影響雄蛾對性信息素的觸角電位反應

亞致死劑量的溴蟲氟苯雙酰胺處理灰茶尺蠖雄蛾48 h，測試雄蛾對其性信息素組分的觸角電位反應的變化。結果發現，經溴蟲氟苯雙酰胺處理后48 h，與對照組相比，雄蛾對其性信息素組分Z3，Z6，Z9-18：H在0.01、0.1、1、10 mg·mL^-1質量濃度下的觸角電位反應分別下降了54.57%、52.62%、39.79%、49.66%（圖2A）。處理雄蛾對Z3，epo6，Z9-18：H在0.01、0.1、1、10 mg·mL^-1質量濃度下的觸角電位反應分別下降了25.88%、22.51%、38.25%、33.51%（圖2B）。結果說明溴蟲氟苯雙酰胺處理顯著削弱灰茶尺蠖雄蛾感知其性信息素的能力。

2.3 溴蟲氟苯雙酰胺處理影響雌蛾性信息素的合成

亞致死劑量的溴蟲氟苯雙酰胺處理灰茶尺蠖48 h后，使用GC-MS定量分析雌蛾性腺性信息素組分。結果發現，經溴蟲氟苯雙酰胺處理后48 h，與對照組相比，雌蛾性腺性信息素主成分Z3，Z6，Z9-18：H和Z3，epo6，Z9-18：H含量分別下降了21.76%和34.71%（圖3），說明灰茶尺蠖雌蛾性腺合成性信息素的能力受到了抑制。

2.4 溴蟲氟苯雙酰胺處理影響性信息素合成基因的表達

灰茶尺蠖Egri-CYP340BD1是雌蛾性腺特異表達的細胞色素P450單氧酶基因，推測其在灰茶尺蠖性信息素合成中發揮潛在的重要功能^[5]。使用qRT-PCR分析溴蟲氟苯雙酰胺處理后雌蛾，溴蟲氟苯雙酰胺處理后24 h和48 h，灰茶尺蠖雌蛾性信息素合成基因Egri-CYP340BD1表達量分別顯著下降了70.90%和55.59%（圖4）。

3 討論

灰茶尺蠖是重要的茶樹害蟲，廣泛分布于我國主要茶產區，給茶葉生產造成了嚴重的經濟損失，干擾其性信息素通訊是防治該害蟲的有效方式^[13]。已有研究表明，殺蟲劑通過影響雄蟲性信息素的感受能力，或改變雌蟲性信息素組分的滴度比例來干擾昆蟲的性信息素通訊^[14]。本研究選取了對鱗翅目害蟲有高效殺蟲活性的間二酰胺類殺蟲劑溴蟲氟苯雙酰胺，研究其對灰茶尺蠖成蟲合成和感知性信息素的影響。結果發現，灰茶尺蠖雄蛾經過亞致死劑量的溴蟲氟苯雙酰胺處理后，其對性信息素誘芯表現出活躍、起飛、接觸行為的發生比例分別顯著下降了13.79%、44.23%、60.00%，而反應時間顯著延長，這一現象表明灰茶尺蠖雄蛾識別性信息素的能力被顯著削弱。同樣，使用亞致死劑量的噻蟲胺處理小地老虎（Agrotis ipsilon）成蟲，結果發現0.25 ng的噻蟲胺處理會明顯削弱雄蛾趨向性誘芯的能力^[15]。用梯度濃度的溴氰菊酯處理亞洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）雄蛾，發現幸存的雄蛾對性信息素的定向行為顯著下降，下降程度與處理劑量顯著相關^[16]。此外，使用LC₂₀劑量的高效氯氰菊酯處理螟黃赤眼蜂（Trichogrammachilonis）會降低雄蜂識別性信息素的能力，同時交配率顯著降低，而LC₂₀的多殺菌素處理僅會削弱雄蜂的活動能力，對交配率和雄蜂識別性信息素的能力沒有產生明顯影響^[17]。綜上所述，某些種類的農藥處理會影響雄蟲識別其性信息素的能力，從而間接地影響成蟲的交配行為。

進一步通過電生理分析溴蟲氟苯雙酰胺處理對灰茶尺蠖感知性信息素能力的影響，結果發現，處理雄蛾對0.01 mg·L^-1的性信息素組分Z3，Z6，Z9-18：H的觸角電位反應降低了54.57%，對另一性信息素組分Z3，epo6，Z9-18：H的觸角電位反應下降了25.88%，結果說明溴蟲氟苯雙酰胺削弱了雄蛾感知性信息素的能力。同樣在小菜蛾（Plutella xylostella）氰戊菊酯抗性品系中發現，與敏感個體相比，抗性品系的雄蛾對寄主揮發物壬醛、水楊酸的甲酯、正辛醇、壬醛的觸角電位反應明顯降低，然而對異硫氰酸烯丙酯的反應卻顯著增強^[18]，然而在小菜蛾阿維菌素抗性品系中發現雄性抗性個體對性信息素的觸角電位反應更加強烈^[19]。究其原因，我們推測外源農藥處理通過調控昆蟲嗅覺系統中某些關鍵基因的表達，從而影響昆蟲觸角的電生理反應。已有研究支持這一觀點，例如在斜紋夜蛾中（Spodoptera litura）發現，毒死蜱或氟蟲腈處理會顯著降低觸角高表達的化學感受蛋白SlitCSP18的表達^[20]，而芐氯菊酯處理會顯著誘導小菜蛾氣味結合蛋白PxylOBP8的表達^[21]。還有研究發現，亞致死劑量的高效氯氰菊酯會降低桔小實蠅（Bactrocera dorsalis）對蘑菇醇、甲基丁香酚、乙酸乙酯的趨向行為和觸角電位反應，推測是由于高效氯氰菊酯削弱了非典型性氣味受體BdorORco的表達從而影響桔小實蠅的嗅覺感知功能^[22]。通過熒光競爭結合試驗，最近研究證實了昆蟲嗅覺識別的關鍵基因與農藥存在相互作用。例如在二點委夜蛾（Athetis lepigone）中發現，有機磷農藥辛硫磷強力結合其性信息素結合蛋白AlepPBP2和AlepPBP3，能與性信息素競爭結合這類載體蛋白，從而干擾雄蛾感知其性信息素的能力^[23]。

本研究發現，灰茶尺蠖雌蛾受到溴蟲氟苯雙酰胺處理，雌蛾性腺性信息素成分Z3，Z6，Z9-18：H和Z3，epo6，Z9-18：H的含量分別下降了21.76%和34.71%，削弱了雌蛾合成性信息素的能力。同樣，使用低劑量的谷硫磷處理薔薇斜條卷葉蛾（Choristoneura rosaceana），結果發現雌蛾性信息素的釋放量下降29%～33%，而雌蛾的求偶行為下降67%～100%^[24]。另外，在小菜蛾阿維菌素和蟲酰肼抗性品系中發現雌蛾性腺兩種性信息素主成分的合成量都低于敏感品系，同時雌性抗性個體表現出較低的求偶頻率^[19]，以上研究充分證明亞致死劑量的農藥處理可能削弱性腺合成性信息素的能力。本研究選取了在灰茶尺蠖雌蛾性腺高表達的CYP基因Egri-CYP340BD1，其在性腺的表達量是蟲體的149.05倍，可能參與性信息素合成過程中的環氧化作用^[5]，結果發現溴蟲氟苯雙酰胺處理顯著降低Egri-CYP340BD1的表達量。據此，筆者推測溴蟲氟苯雙酰胺處理會抑制茶尺蠖雌蛾性腺CYP的表達從而降低性信息素的合成。

綜上所述，溴蟲氟苯雙酰胺處理不僅能削弱灰茶尺蠖雄蛾感知性信息素的能力，還可以降低雌蛾性腺合成性信息素的能力，從而有效干擾灰茶尺成蟲之間的性信息素通訊，結果將為茶園尺蠖類害蟲行為調控技術的開發提供參考。

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