基于細胞鐵死亡相關基因構建胰腺導管腺癌患者預后風險評分模型及其應用價值

［摘要］ 目的

探討基于細胞鐵死亡相關的基因構建胰腺導管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）患者預后風險評分模型及其應用價值。

方法 從癌癥基因組圖譜（TCGA）數據庫、基因表達綜合數據庫和基因型組織表達數據庫中獲取PDAC及正常胰腺組織的轉錄組測序數據和PDAC患者總體生存期（OS）等臨床資料，從GeneCards數據庫獲取細胞鐵死亡相關基因資料。通過R軟件篩選PDAC組織與正常胰腺組織間差異表達基因（DEGs）。利用單因素Cox回歸分析和LASSO回歸分析構建PDAC患者預后風險評分模型，通過該風險評分模型將TCGA數據庫中PDAC病例分為高、低風險兩組，繪制Kaplan-Meier生存分析曲線，比較兩組患者OS。通過CCK-8實驗和免疫印跡實驗進一步驗證該風險評分模型中細胞鐵死亡關鍵基因與PDAC細胞鐵死亡間的關系。

結果 成功構建了由SLC6A14、DKK1、KRT19、AURKA、EMP1、ANXA2、LGALS3 7個細胞鐵死亡相關基因構成的PDAC患者預后風險評分模型；Kaplan-Meier生存分析曲線顯示，低風險組患者的OS顯著長于高風險組（Plt;0.05）。CCK-8實驗結果顯示，PDAC細胞系中AsPC-1及BxPC-3細胞AURKA敲降組第3～5天的細胞存活率均顯著低于陰性對照組（t=4.57～12.84，Plt;0.05）；免疫印跡實驗結果顯示，AsPC-1及BxPC-3細胞的AURKA敲降組細胞中AURKA、SLC7A11、GPX4蛋白相對表達量均顯著低于陰性對照組（t=4.22～11.79，Plt;0.05）。

結論

AURKA基因的下調可能通過促進PDAC細胞鐵死亡的發生導致PDAC的發生發展，基于細胞鐵死亡相關基因的風險評分模型對PDAC患者的預后評估具有重要參考價值。

［關鍵詞］ 癌，胰腺管；鐵死亡；基因表達；回歸分析；預后；計算生物學；數據庫，遺傳學

［中圖分類號］ R735.9

［文獻標志碼］ A

Establishment of a prognostic risk scoring model for patients with pancreatic ductal adenocarcinoma based on cell ferroptosis-related genes and its application value

QING Gong， JING Xue， JIANG Yueping

（Department of Gastroenterology， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266003， China）

; ［ABSTRACT］＼ Objective To establish a prognostic risk scoring model for patients with pancreatic ductal adenocarcinoma （PDAC） based on cell ferroptosis-related genes， and to investigate its application value.

Methods The Cancer Genome Atlas （TCGA） database， Gene Expression Omnibus database， and Genotype-Tissue Expression database were used to obtain the transcriptome sequencing data of PDAC tissue and normal pancreatic tissues and the clinical data of PDAC patients including overall survival （OS）， and the GeneCards database was used to obtain the data on cell ferroptosis-related genes. R software was used to identify the differentially expressed genes （DEGs） between PDAC tissue and normal pancreatic tissue. The univariate Cox regression analysis and LASSO regression were used to establish a prognostic risk scoring model for PDAC patients， and based on this risk scoring model， the PDAC cases in TCGA database were divided into low- and high-risk groups. The Kaplan-Meier survival curves were plotted to compare OS between the two groups. CCK-8 assay and Western blotting were used to further validate the association between the key genes of cell ferroptosis in the risk scoring model and cell ferroptosis in PDAC.

Results A prognostic risk scoring model for PDAC patients was successfully established based on seven cell ferroptosis-related genes， i.e.， SLC6A14， DKK1， KRT19， AURKA， EMP1， ANXA2， and LGALS3， and the Kaplan-Meier survival curve showed that the low-risk group had a significantly longer OS than the high-risk group （Plt;0.05）. CCK-8 showed that compared with the negative control group， the AURKA knockdown group of AsPC-1 and BxPC-3 PDAC cell lines had a significantly lower viability on days 3-5 （t=4.57-12.84，Plt;0.05）， and Western blotting showed that compared with the negative control group， the AURKA knockdown group of AsPC-1 and BxPC-3 cells had significantly lower relative protein expression levels of AURKA， SLC7A11， and GPX4 （t=4.22-11.79，Plt;0.05）.

Conclusion Downregulation of the AURKA gene may lead to the development and progression of PDAC by promoting ferroptosis in PDAC cells， and the risk scoring model based on cell ferroptosis-related genes has a significant reference value for the prognostic assessment of PDAC patients.

［KEY WORDS］ Carcinoma， pancreatic cuctal; Ferroptosis; Gene expression; Regression analysis; Prognosis; Computatio-

nal biology; Databases， genetic

胰腺導管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）是一種侵襲性強且生存預后極差的惡性腫瘤［1-2］。預估到2030年，其可能上升為人類癌癥相關死亡的第二病因［3］。PDAC的治療方法主要包括手術切除、放療、化療、介入治療及靶向治療等［4］。目前根治性手術仍是實現PDAC治愈并延長患者生存期的主要治療方法，然而全世界只有不到20%的患者在診斷時具有手術適應證［5］。細胞鐵死亡是一種不同于細胞凋亡、自噬以及壞死的細胞死亡方式［6-7］。近年來細胞鐵死亡在腫瘤治療中的潛在應用價值被廣泛研究［8-9］。研究表明，癌細胞可能通過調節細胞鐵死亡通路來增強自身抗氧化能力，從而更好地適應腫瘤微環境，增加對各類治療的抵抗，最終影響癌癥患者的預后［10-11］。目前關于細胞鐵死亡相關基因對PDAC患者預后的評估價值尚缺乏深入研究。本研究嘗試構建一個基于細胞鐵死亡相關基因評估PDAC患者預后的風險評分模型，并通過體外細胞實驗初步探討該風險評分模型篩選出的細胞鐵死亡關鍵基因與PDAC發生間的關系，以期能為PDAC的早期診斷及預后評估提供新的理論依據，為PDAC患者靶向治療研究提供新方向。

1 資料與方法

1.1 一般資料的獲取與處理

從癌癥基因組圖譜（TCGA）數據庫（https：//portal.gdc.cancer.gov/）、基因表達綜合（GEO）數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中的兩個數據集（GSE183795、GSE62452）以及基因型組織表達（GTEx）數據庫（http：//commonfund.nih.gov/GTEx/）中獲取PDAC及正常胰腺組織的轉錄組測序數據和PDAC患者總體生存期（OS）等臨床資料，并從GeneCards數據庫（https：//www.genecards.org/）中獲取787個細胞鐵死亡相關基因。用R語言limma軟件包對TCGA數據庫中PDAC組織與GTEx數據庫中正常胰腺組織的mRNA轉錄組測序數據進行細胞鐵死亡相關基因的差異表達分析，篩選標準為|log2FC|＞3且p.adjlt;0.05。

1.2 基于細胞鐵死亡相關基因的PDAC患者預后風險評分模型的構建與評價

使用R語言survival軟件包對PDAC與正常胰腺組織間差異表達的細胞鐵死亡相關基因進行單因素Cox回歸分析，以識別PDAC患者OS相關基因。將TCGA數據庫中PDAC病例作為訓練集，GEO數據庫中PDAC病例作為驗證集，使用R語言的glmnet軟件包通過LASSO回歸分析來構建PDAC患者預后風險評分模型，通過該風險評分模型計算出所有患者的風險評分，并以風險評分中位數為閾值分別將訓練集與驗證集患者分為高風險組和低風險組。采用Kaplan-Meier（K-M）生存分析比較兩組患者OS差異，使用R語言survivalROC軟件包繪制受試者工作特征（ROC）曲線以評估模型預測效能，并選取模型中風險系數最高的基因進行后續體外細胞實驗。

1.3 PDAC組織與正常胰腺組織之間差異表達基因（DEGs）的富集分析

使用R語言clusterProfiler軟件包對PDAC組織與正常胰腺組織間DEGs進行GO功能富集分析和KEGG通路分析［12］。同時使用limma軟件包聯合clusterProfiler軟件包對訓練集中高、低風險組患者進行基因集富集分析（GSEA）。

1.4 小干擾RNA（siRNA）轉染人胰腺腺癌細胞系細胞

使用Lipofectamine 3000將siRNA轉染到人胰腺腺癌細胞系AsPC-1細胞與BxPC-3細胞（購自武漢普諾賽生命科技有限公司）中。隨后將上述兩種細胞分別分為陰性對照組（siNC組）與AURKA敲降組（siAURKA組）。

1.5 CCK-8實驗檢測AsPC-1細胞和BxPC-3細胞存活能力

將步驟1.4處理后的四組細胞分別置入96孔培養板中，每組細胞設置3個復孔，每孔中含4 000個細胞，隨后每孔中加入CCK-8溶液10 μL，置于37 ℃、含體積分數0.05的CO2培養箱中孵育3 h，以酶標儀測量各組溶液在波長450 nm處的吸光度（A）值并計算各組細胞存活率，四組細胞均連續測量5 d。細胞存活率=［（A實驗孔-A空白孔）/（A對照孔-A空白孔）］×100%。

1.6 免疫印跡實驗檢測AsPC-1細胞和BxPC-3細胞中AURKA、SLC7A11、GPX4蛋白相對表達量

使用包含PMSF和cocktail的RIPA蛋白裂解液從步驟1.4處理后的AsPC-1、BxPC-3細胞中提取總蛋白，以120 V恒壓60 min電泳分離蛋白，290 mA恒流90 min將蛋白轉移至PVDF膜上，并以50 g/L脫脂牛奶室溫封閉1 h。分別加入一抗AURKA（1∶1 000，美國CST公司）、GAPDH（1∶5 000，武漢三鷹生物技術有限公司）、SLC7A11（1∶1 000，美國ABclonal公司）、GPX4（1∶1 000，杭州華安生物技術有限公司），于4 ℃下孵育14～16 h。將HRP標記的山羊抗兔或小鼠二抗（1∶5 000，上海碧云天生物技術有限公司）與PVDF膜在室溫下孵育1 h。加入ECL化學發光液顯影并拍照，使用Image J軟件分別分析AURKA、SLC7A11、GPX4及GAPDH蛋白條帶灰度值。以GAPDH作為內參照，計算AURKA、SLC7A11、GPX4三種蛋白的相對表達量，結果取3次重復實驗的均值。

1.7 統計學方法

采用R 4.2.1及Graphpad Prism軟件對數據進行統計學分析。服從正態分布的連續變量以x-±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗；分類變量以例（率）表示，組間比較采用Wilcoxon檢驗；采用K-M生存分析曲線進行患者生存預后分析。以Plt;0.05為差異具有統計學意義。

2 結" 果

2.1 PDAC組織與正常胰腺組織間細胞鐵死亡相關基因的差異表達分析

從TCGA和GTEx數據庫共篩選出1 761個PDAC組織與正常胰腺組織的DEGs，從GeneCards數據庫共獲取787個細胞鐵死亡相關基因。將上述兩個基因集取交集，獲得72個細胞鐵死亡相關基因。將這72個基因使用survivalROC軟件包進行Cox回歸分析，最終篩選出13個影響PDAC患者預后的相關基因（Plt;0.05），見表1。

2.2 PDAC患者預后風險評分模型的構建與評價

將上述13個PDAC患者預后相關基因進行LASSO回歸分析，最終篩選出SLC6A14、DKK1、KRT19、AURKA、EMP1、ANXA2、LGALS3等總計7個基因共同構建風險評分模型。風險評分分值=0.031×

SLC6A14表達量＋0.034×DKK1

表達量＋0.100×KRT19表達量＋0.208×AURKA表達量＋0.125×EMP1表達量＋0.045×ANXA2表達量＋0.071×LGALS3表達量，以評分的中位數為閾值將PDAC患者分為高風險組（訓練集89例，驗證集100例）和低風險組（訓練集89例，驗證集99例）。K-M生存分析曲線顯示，訓練集及驗證集的高、低風險組患者OS均存在顯著差異（Plt;0.05），其中低風險組患者OS更長（圖1A、B）。ROC曲線結果則表明，訓練集中PDAC預后風險評分模型預測PDAC患者1、2、3年OS的曲線下面積（AUC）分別為0.739、0.704、0.736（圖1C），驗證集中上述指標分別為0.542、0.629、0.700（圖1D）。

2.3 PDAC組織與正常胰腺組織間DEGs的基因富集分析

GO功能富集分析結果顯示，PDAC組織與正常胰腺組織間72個DEGs主要存在于含膠原的細胞外基質、細胞骨架結構等處，主要參與磷脂酶抑制劑的激活、NADPH氧化酶的激活等生物學過程。KEGG通路分析結果顯示，上述基因主要在細胞鐵死亡信號通路中富集。GSEA結果顯示，DEGs主要參與了P53信號通路、ECM受體相互作用信號通路等。

2.4 AURKA敲降對AsPC-1和BxPC-3細胞存活率的影響

CCK-8實驗結果顯示，時間、組別、時間與組別交互作用對AsPC-1及BxPC-3細胞存活率有顯著影響（F時間=51.01、164.30，F組別=48.83、124.10，F時間*組別=9.11、45.30，Plt;0.05）；其中AsPC-1及BxPC-3細胞siAURKA組第3～5天細胞存活率低于siNC組（t=4.57～12.84，Plt;0.05）。見表2。

2.5 siNC組與siAURKA組細胞中SLC7A11、AURKA、GPX4蛋白表達水平比較

免疫印跡實驗結果顯示，AsPC-1細胞siNC組細胞中AURKA、SLC7A11、GPX4蛋白相對表達量分別為1.21±0.12、0.91±0.03、0.99±0.05，siAURKA組細胞中三種蛋白相對表達量分別為0.51±0.01、0.37±0.02、0.64±0.06，AsPC-1細胞siNC組三種蛋白相對表達量均顯著高于siAURKA組（t=4.40～11.79，Plt;0.05）。BxPC-3細胞siNC組細胞中AURKA、SLC7A11、GPX4三種蛋白相對表達量分別為1.07±0.11、0.95±0.01、0.95±0.02，siAURKA組細胞中三種蛋白相對表達量分別為0.37±0.02、0.62±0.04、0.71±0.05，BxPC-3細胞siNC組三種蛋白相對表達量亦顯著高于siAURKA組（t=4.22～8.27，Plt;0.05）。見圖2。

圖2 AsPC-1、BxPC-3細胞的siNC組與siAURKA組蛋白表達水平比較

3 討" 論

PDAC是一種高度侵襲性腫瘤，PDAC患者的5年生存率低于12%［13］。細胞鐵死亡是一種獨特的細胞死亡形式，不同于細胞自噬、凋亡及壞死，細胞鐵死亡主要由鐵離子引起細胞內脂質過氧化物沉積所致［14］。SLC7A11/GPX4信號軸在細胞鐵死亡調節中扮演重要角色［15-16］。當SLC7A11出現功

能障礙時會導致GPX4水平下調，而GPX4是抑制

細胞脂質過氧化和細胞鐵死亡發生的關鍵調控基因［17-18］。大量研究表明細胞鐵死亡在腫瘤的發展過程中具有重要作用［19-21］，但目前關于細胞鐵死亡相關基因在PDAC患者預后中作用的研究較少。

本研究對TCGA等數據庫中PDAC組織與正常胰腺組織間基因進行差異表達分析，結合GeneCards數據庫中的細胞鐵死亡相關基因，篩選出72個PDAC組織與正常胰腺組織間差異表達的細胞鐵死亡相關基因。采用了單因素Cox回歸分析結合LASSO回歸分析，成功構建了包括SLC6A14、DKK1、KRT19、AURKA、EMP1、ANXA2以及LGALS3等7個細胞鐵死亡相關基因預測PDAC患者預后的風險評分模型。目前已有研究顯示上述7個基因在腫瘤進展中起重要作用。如SLC6A14在結直腸癌中表達上調，可激活Akt-mTOR信號通路促進腫瘤進展［22］。DKK1通過增加SLC7A11的表達，以保護轉移癌細胞免受脂質過氧化和細胞鐵死亡影響［23］。KRT19則直接與β-catenin/RAC1復合物相互作用，調節乳腺癌的腫瘤特性［24］。AURKA/CXCL5軸在非小細胞肺癌自噬當中發揮著重要的作用，細胞毒性自噬的激活減弱了AURKA/CXCL5介導的非小細胞肺癌細胞的惡性生物學行為［25］。EMP1的缺失可促進膀胱癌細胞遷移，并賦予其抵抗細胞鐵死亡和氧化應激的能力［26］。ANXA2通過激活MYC-HIF1A-VEGF軸以促進食管癌進展［27］。LGALS3的過表達增強了肝癌細胞向骨骼轉移的能力［28］。本研究隨后將PDAC患者分為高、低風險組，繪制K-M生存分析曲線，發現高風險組患者的OS較低風險組更短，表明該風險評分模型對PDAC患者的預后預測具有一定的參考價值；ROC曲線結果則顯示本風險評分模型在

PDAC患者1、2、3年OS的預測中均具有較好效

能。另外，PDAC與正常胰腺組織中差異表達的細胞鐵死亡相關基因功能富集分析結果顯示，DEGs主要參與了細胞鐵死亡信號通路、P53信號通路、ECM受體相互作用信號通路等信號通路，從一定程度上揭示了上述基因導致PDAC的潛在生物學機制，為未來深入研究提供了一定理論依據。

在體外細胞實驗中，CCK-8實驗結果顯示人胰腺腺癌細胞系AsPC-1和BxPC-3細胞的siAURKA組細胞第5天細胞存活率較siNC組顯著下降；進一步的免疫印跡實驗發現當AURKA敲降導致AsPC-1細胞和BxPC-3細胞中AURKA蛋白表達水平下調時，GPX4和SLC7A11蛋白表達水平也隨之降低，即人胰腺腺癌細胞系中AURKA基因表達的下調可能誘導了細胞鐵死亡發生。

另外，本研究也存在一些局限性。首先，從回顧性數據中得出的預后預測模型需要通過前瞻性研究進行驗證，以提高其可靠性和可推廣性；其次，雖然我們通過體外實驗初步探索了AURKA基因在細胞鐵死亡中的作用，但對其具體機制及功能的理解仍然有限，未來需更深入地研究以便全面解析AURKA在PDAC發生發展中的作用；最后，LASSO回歸分析雖然在變量選擇中有效，但可能忽略了基因間復雜的交互作用，未來研究可以考慮采用更先進的機器學習方法來提高風險評分模型的精度。

總之，本研究對TCGA等數據庫中PDAC相關基因的綜合分析以及提取，成功構建了PDAC患者預后風險評分模型，該模型由SLC6A14、DKK1、KRT19、AURKA、EMP1、ANXA2、LGALS3等7個細胞鐵死亡相關基因組成，能夠為PDAC患者預后的評估提供一定參考。

作者聲明：卿功、江月萍參與了研究設計；卿功、荊雪參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發表該論文，且均聲明不存在利益沖突。

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（本文編輯 范睿心 厲建強）