子宮內膜異位癥患者異位內膜組織中Ninj1、IL-1β及PGP-9.5的表達及意義

［摘要］ 目的

探討子宮內膜異位癥（endometriosis，EMT）患者的異位內膜組織中神經損傷誘導蛋白1（Ninj1）、白細胞介素-1β（IL-1β）及蛋白基因產物9.5（PGP-9.5）的表達及與痛經的關系。

方法 以2020年4月—2021年4月在我院行婦科術后病理檢查確診為卵巢EMT患者的異位內膜組織40例為A組，并獲取其中20例患者的在位子宮內膜組織為B組，收集同期20例子宮肌瘤患者的正常子宮內膜組織作為C組。根據有無痛經將A組分為痛經亞組與非痛經亞組，每組20例。采用免疫組織化學方法檢測A、B、C組內膜組織中Ninj1、IL-1β及PGP-9.5的表達，并分析其相關性；采用酶聯免疫吸附試驗檢測A組與C組患者外周血中IL-1β的表達水平。

結果

A組患者外周血中IL-1β的表達水平顯著高于C組（t=-4.184，Plt;0.05）；與C組相比，A、B組內膜組織中3種蛋白陽性表達構成比均明顯升高（χ2=4.286～19.394，Plt;0.05），與B組相比，A組內膜組織中3種蛋白陽性表達構成比明顯升高（χ2=4.149～5.272，Plt;0.05）。痛經亞組內膜組織中Ninj1與PGP-9.5蛋白陽性表達構成比明顯高于非痛經亞組（χ2=8.533、11.905，Plt;0.05）。A組內膜組織中Njnj1與PGP-9.5、IL-1β的表達呈正相關（r=0.733、0.628，Plt;0.05）。

結論 Ninj1、IL-1β及PGP-9.5在異位內膜組織中陽性表達比例較高，可能參與EMT的發生與發展；痛經亞組內膜組織中Ninj1與PGP-9.5蛋白的陽性表達構成比高于非痛經亞組，可能與EMT疼痛發生機制密切相關。

［關鍵詞］ 子宮內膜異位癥；細胞黏附分子，神經元；白細胞介素1β；神經組織蛋白質類；痛經

［中圖分類號］ RR711.71

［文獻標志碼］ A

Expression and significance of Ninj1， IL-1β and PGP-9.5 in ectopic endometrial tissues of patients with endometriosis

ZHAO Li， LI Yuying， WANG Lei， JIAO Jinwen， SUN qi，" HUANG Meisha， YUAN Fang

（Department of Gynecology， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266003， China）

; ［ABSTRACT］＼ Objective To investigate the expression levels of nerve injury-induced protein 1 （Ninjl）， interleukin-1β（IL-1β）， and protein gene product 9.5 （PGP-9.5） in the ectopic endometrial tissues of patients with endometriosis （EMT） and their relationship with dysmenorrhea.

Methods Ectopic endometrial tissues from 40 patients with ovarian EMT diagnosed by post-ope-

rative gynecological pathological examination in our hospital from April 2020 to April 2021 were selected as group A. In situ endo-metrial tissues from 20 of these patients were obtained as group B. Normal endometrial tissues from 20 patients with uterine fi-broids in the same period were collected as group C. Group A was divided into a dysmenorrhoea subgroup and a non-dysmenorrhoea subgroup according to the presence or absence of dysmenorrhoea， with 20 patients per subgroup. The expression levels of Ninj1， IL-1β， and PGP-9.5 in the endometrial tissues of groups A， B， and C were measured by immunohistochemistry， and their correlation was analyzed. The expression level of IL-1β in the peripheral blood of patiens in groups A and C was measured by enzyme-linked immunosorbent assay.

Results The expression level of IL-1β in the peripheral blood of patients in group A was signifi-cantly higher than that in group C （t=-4.184，Plt;0.05）. The positive expression rates of three proteins in the endometrial tissues were significantly increased in groups A and B compared with group C （χ2=4.286-19.394， Plt;0.05）and in group A compared with group B （χ2=4.149-5.272，Plt;0.05）. The positive expression rates of Ninjl and PGP-9.5 proteins in the endometrial tissues were significantly higher in the dysmenorrhoea subgroupthan in the non-dysmenorrhoea subgroup （χ2=8.533，11.905，Plt;0.05）. The expression of Ninj1 was positively correlated with the expression of PGP-9.5 and IL-1β in the endometrial tissues of group A （r=0.733， 0.628，Plt;0.05）.

Conclusion Ninjl， IL-1β， and PGP-9.5 are highly expressed in the ectopic endometrial tissues，which may be involved in the occurrence and development of EMT. The positive expression rates of both Ninjl and PGP-9.5 in the endometrial tissues of the dysmenorrhoea subgroup were higher than those in the non-dysmenorrhoea subgroup， which may be closely related to the mechanism of EMT pain.

［KEY WORDS］ Endometriosis; Cell adhesion molecules， neuronal; Interleukin-1beta; Nerve tissue proteins; Dysmenorrhea

子宮內膜異位癥（endometriosis，EMT）是一種常見的婦科疾病，其特征是子宮內膜組織在子宮腔范圍以外的其他部位生長，其中可能包括卵巢、輸卵管、盆腔組織等處。EMT發病率占育齡期女性的10%～15%，且這一比例仍在逐年上升［1］。患者典型的疼痛癥狀（痛經、慢性盆腔疼痛和性交痛）在青春期和成年女性患者中高達70%～80%，上述癥狀對患者的身心健康和社交生活造成不良影響。該病發病機制復雜，目前尚未明確。神經損傷誘導蛋白1（Ninj1）在胚胎組織中廣泛存在，尤其是在具有上皮起源的組織中［2］，其可調節神經系統，促進軸突生長及血管生成，介導炎癥反應［3］，但目前對Ninj1的研究較為局限，鮮有在女性生殖系統中的研究。蛋白基因產物9.5（PGP-9.5）是來源于神經外胚層細胞的神經內分泌系統特定組織標志物，可以用來標記神經纖維。研究發現，神經纖維的密度和EMT相關疼痛相關［4］，本研究通過比較Ninj1、IL-1β及PGP-9.5在EMT異位組織中及在EMT痛經與非痛經患者內膜組織中的表達差異，探討Ninj1、IL-1β及PGP-9.5在EMT發生發展及疼痛發生機制中的作用，為尋找新的子宮內膜異位癥治療靶點及有效緩解患者疼痛提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料來源

選擇2020年4月—2021年4月間于我院接受EMT手術的患者40例，收集其異位內膜組織，設為A組。上述患者術后病理檢查結果均證實為卵巢EMT。在A組進一步選擇20例患者的在位內膜組織設為B組。作為對照，選取同期20例子宮肌瘤患者并獲取其正常子宮內膜組織設為C組。A組患者平均年齡（41.89±3.74）歲，B組患者平均年齡（41.83±4.39）歲，C組患者平均年齡（43.78±3.08）歲。針對A組，進一步根據患者是否有痛經將其分為痛經亞組和非痛經亞組，每亞組各20例患者。A組與C組患者年齡具有可比性。所有患者納入標準：①手術前未曾患自身免疫性疾病或傳染性疾病；②在手術前3個月內未接受過如免疫抑制劑、激素等抗炎藥物治療。

1.2 實驗方法

1.2.1 免疫組織化學方法（SP法）檢測3組患者子宮內膜組織中Ninj1、IL-1β及PGP-9.5蛋白的表達情況 術中留取的3組患者的相應內膜組織，均置于-80 ℃冰箱凍存，根據術后病理，確定入組患者，制作石蠟包埋切片。對研究中樣本進行兩種不同的染色方法，分別是HE染色和SP法染色，以PBS液替代一抗作為陰性對照。綜合分析每張切片中細胞的染色強度及陽性細胞百分比，對染色強度及陽性細胞百分比進行評分，若染色強度與陽性細胞百分比的得分乘積超過2分，便認定其為陽性表達［5］。

1.2.2 酶聯免疫吸附實驗（ELISA）檢測A組與C組患者外周血中IL-1β的表達情況 手術前1 d采集患者外周靜脈血3～5 mL，將血液樣本在4 ℃下于離心機中離心15 min，將血清分離并存儲在溫度為-80 ℃的冰箱中，以備后續實驗使用。根據人IL-1β ELISA試劑盒（伊萊瑞特E-EL-H0149c）操作手冊，執行相應的步驟以測定患者血清中IL-1β表達水平。

1.3 統計學方法

使用SPSS 26.0軟件進行統計學分析。計量資料以x-±s表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；對于定性資料，組間比較采用χ2檢驗，相關性分析

使用Spearman方法。以Plt;0.05為差異有顯著性。

2 結" 果

2.1 不同內膜組織中Ninj1、PGP-9.5及IL-1β蛋白表達情況比較

A、B組內膜組織中Ninj1、PGP-9.5及IL-1β蛋白陽性表達構成比與C組相比均明顯升高（χ2=4.286～19.394，Plt;0.05）；與B組相比，A組內膜組織中3種蛋白陽性表達構成比均明顯升高（χ2=4.149～5.272，Plt;0.05）。痛經亞組內膜組織中Ninj1與PGP-9.5蛋白表達構成比高于非痛經亞組（χ2=8.533、11.905，Plt;0.05），IL-1β蛋白表達情況無顯著差異（P＞0.05）。見表1、圖1～3。

2.2 A組與C組患者血清中IL-1β表達水平比較

A、C組患者血清中IL-1β表達水平分別為（9.47±0.62）、（8.55±0.72）ng/L，兩組比較差異有顯著性（t=-4.184，Plt;0.05）。

2.3 A組內膜組織中Ninj1、PGP-9.5及IL-1β表達的相關性

A組內膜組織中Njnj1與PGP-9.5、IL-1β的表達呈正相關（r=0.733、0.628，Plt;0.05）。

3 討" 論

目前我們尚未完全了解EMT的發病機制，其涉及多方面復雜因素，包括炎癥、免疫、內分泌以及遺傳等［6］。痛經、慢性盆腔痛和性交痛是EMT患者典型的癥狀，目前為止，對于疼痛癥狀的處理包括藥物治療和手術治療兩種，無論何種方式均會產生某些有害影響，但目前對EMT患者疼痛發生機制的研究亦無明確的定論。

異位內膜的存在引發EMT激活了自身免疫系統，并使得巨噬細胞數量得到提升，這也增加了包括IL-1β以及腫瘤壞死因子在內的諸多炎癥因子的分泌量。存在炎性環境的情況下，不僅炎癥因子的表達被促進，且這些炎癥因子還會反過來參與和促進EMT的發生發展［7］。巨噬細胞產出的IL-1β是關鍵的炎癥細胞因子和免疫調節分子，它不僅能激發炎癥反應，也能促進異位內膜在腹腔內的植入、子宮異位內膜血管的形成以及提升其他細胞因子的濃度，最終加快異位病灶的進攻、粘連進程以及血管的再生，對EMT的發生和進展起到關鍵影響［8-9］。有研究結果顯示，新生成的血管周邊總是附帶神經的分布［10］。Ninj1是一種新發現的炎癥調控標志物，具有促進神經軸突生長的特性。根據本研究結果，A組血清中IL-1β水平及異位內膜組織中三種蛋白的陽性表達構成比均顯著高于C組，這提示IL-1β以及Ninj1均可能參與了EMT的發生和發展過程。MIYASHITA等［11］研究發現，IL-1β和Ninj1在卵巢子宮內膜異位囊腫和腹壁子宮內膜異位病灶中均表現為強陽性表達，與本研究結果一致。此外，向子宮內膜基質細胞培養液中添加IL-1β后，經過3～6 h孵育，Ninj1 mRNA表達增加，提示Ninj1可能通過炎癥遞質在微環境中的誘導參與了EMT的發病過程。本研究進一步證實了A組組織當中Ninj1與IL-1β表達呈正相關，支持了上述結論。

PGP-9.5又稱泛素C末端水解酶（UCHL-1），被視為一種敏感的神經標志物，能夠精確標記神經元細胞和神經纖維［4］。某些研究發現，只有在存在疼痛癥狀的患者群體當中，子宮內膜功能層會出現PGP-9.5突出顯示的神經纖維，也就是說，此類神經纖維的分布密集程度和疼痛癥狀是正相關的。對腹壁EMT患者的異位病灶、灶旁正常組織當中PGP-9.5陽性的神經纖維進行染色分析發現，異位組織中神經密度分布高于正常組織［12-13］。本研究結果表明，相較于C組，異位內膜組織中PGP-9.5蛋白的表達顯著增強。進一步分析痛經亞組和非痛經亞組發現，痛經亞組的異位內膜組織中蛋白陽性表達構成比高于非痛經亞組。此外，痛經亞組中Ninj1的表達與PGP-9.5呈正相關，即隨著PGP-9.5的增加，Ninj1的表達也增加。這提示Ninj1可能與疼痛癥狀的發生存在一定關系。MIYASHITA等［11］的研究也表明，在EMT組織中，Ninj1和PGP-9.5蛋白的表達均較正常子宮內膜組織中顯著增高。通過蘇木精反染證實，PGP-9.5在組織中的陽性表達區域與Ninj1的陽性表達區域一致。這提示神經生長可能是疼痛產生的一個潛在原因。因此，EMT又被稱為血管神經性疾病［14］。

炎癥反應能夠觸發神經纖維的激活，促進組胺、5-羥色胺、神經生長因子（NGF）、Ninj1和前列腺素等神經遞質釋放［15］，建立神經疼痛調控環路，導致疼痛感覺的產生。在EMT中，局部炎癥反應可以通過刺激神經末梢，介導疼痛感覺，并隨后調控促炎神經調節劑的釋放，最終導致疼痛的發生［16］。多種因子能夠直接誘導周圍神經的敏化，從而參與形成反饋回路，導致炎癥和疼痛之間的循環持續存在。此外，長期處在慢性炎癥環境中，可能會使神經纖維分布不同，甚至重新分布，其中為了維持局部炎癥微環境的平衡，同時增加疼痛信號［17］，可能導致局部感覺纖維的增加，而失去交感神經纖維，這可能是EMT患者疼痛的機制之一。

郎景和院士提出的“在位內膜決定論”明確了EMT發病中在位子宮內膜的關鍵作用，并對經血逆流種植學說進行了修正和擴充［18］。本研究結果顯示，EMT在位內膜組織中Ninj1、PGP-9.5和IL-1β表達均顯著高于對照內膜組織，與在位內膜決定論的觀點相一致。

總而言之，本研究驗證了EMT患者異位內膜組織中Ninj1、PGP-9.5及IL-1β的高表達。Ninj1不僅在促進神經生長中發揮了作用，參與了EMT的發生和發展，還可能與疼痛產生機制相關。然而，Ninj1在這些過程中的具體分子機制仍需進一步深入研究。

倫理批準和知情同意：本研究涉及的所有試驗均已通過青島大學附屬醫院醫學倫理委員會的審核批準（文件號QYFYWZLL27072）。受試對象或其親屬已經簽署知情同意書。

作者聲明：袁芳、趙麗、李玉英、孫琦及黃美莎參與了研究設計；趙麗、袁芳、焦今文及王蕾參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發表該論文，且均聲明不存在利益沖突。

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（本文編輯 耿波）