大鼠心肌細胞H9C2多元復合支架的制備及優(yōu)選

［摘要］ 目的

制備大鼠心肌細胞H9C2的聚己內酯（PCL）/殼聚糖（CS）多元復合支架，并優(yōu)選有利于H9C2細胞生長的支架。

方法 通過靜電紡絲法制備PCL/CS支架（支架A）、PCL/CS/氧化鋅（ZnO）支架（支架B）、PCL/CS/ZnO/碳納米管（CNTs）支架（支架C）三種多元復合支架，采用X射線衍射（XRD）、傅里葉紅外光譜（FTIR）、熱重分析（TG）、拉曼光譜測試等方法驗證支架制備是否成功，采用電鏡觀察及拉伸應力、水接觸角、電導率、膨脹率檢測等方法評估三種支架的理化特性，采用DAPI染色、電鏡觀察、CCK-8實驗等方法評估三種支架的生物相容性。

結果 XRD、FTIR、TG、拉曼光譜測試結果顯示三種支架制備成功。電鏡觀察結果顯示支架C的纖維直徑顯著長于支架A、B（F=73.050，t=8.724、9.747，Plt;0.05）；拉伸應力測試結果顯示支架B的拉伸應力顯著高于支架A、C（F=13.833，t=3.641、3.802，Plt;0.05）；水接觸角檢測結果顯示三種支架皆親水；電導率測試結果顯示支架B、C的電導率顯著高于支架A（F=798.780，t=32.155、30.048，Plt;0.05）；膨脹率測試結果顯示，在PBS緩沖液中浸泡后，支架A第5小時膨脹率顯著高于第0.5小時（F組內=53.103，Plt;0.05），支架C在第2～5小時中各時間點膨脹率顯著高于第0.5小時（F組內=103.748，Plt;0.05）；在第0.5～4小時中各時間點，支架A膨脹率顯著高于支架B、C，在第0.5～2小時中各時間點，支架B膨脹率顯著高于支架C（F組間=35.226～162.448，Plt;0.05）。DAPI染色及電鏡圖像結果顯示，在三種支架上培養(yǎng)96 h以后，支架B、C表面H9C2細胞數(shù)量較支架A增多。CCK-8實驗結果顯示，支架A、B、C表面H9C2細胞在第18小時～第5天中各時間點的吸光度值均顯著高于第12小時（F組內=37.159～67.083，Plt;0.05）；在第12小時～第5天各時間點，支架C表面H9C2細胞的吸光度值均顯著高于支架A、B（F組間=26.039～80.994，Plt;0.05）。

結論 大鼠心肌細胞H9C2的多元復合支架符合細胞外基質特征，能夠支持心肌細胞生長，其中PCL/CS/ZnO/CNTs支架顯示出較高的生物相容性，比純PCL/CS支架在心臟組織工程中更具應用潛力。

［關鍵詞］ 羧甲基纖維素鈉；殼聚糖；細胞外基質；組織工程；組織支架；肌細胞，心臟

［中圖分類號］ R318.1;R605

［文獻標志碼］ A

Preparation and optimization of composite scaffolds for rat H9C2 cardiomyocytes

LIU Jie， "LIU Xu，" ZHU Xiaoyi

（Department of Cardiovascular Surgery， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266003， China）

; ［ABSTRACT］＼ Objective To prepare composite scaffolds for rat H9C2 cardiomyocytes， and to optimize the scaffolds that facilitate the growth of H9C2 cardiomyocytes.

Methods The electrospinning method was used to prepare three types of compo-

site scaffolds， i.e.， polycaprolactone （PCL）/chitosan （CS） scaffold （scaffold A）， PCL/CS/zinc oxide （ZnO） scaffold （scaffold B）， and PCL/CS/ZnO/carbon nanotubes （CNTs） scaffold （scaffold C）， and the preparation of scaffolds was verified by the methods including X-ray diffraction （XRD）， Fourier transform infrared （FTIR） spectroscopy， thermogravimetric （TG） analysis， and Raman spectroscopy. Electron microscopy and tensile stress， water contact angle， conductivity， and expansion rate tests were used to eva-

luate the physical and chemical properties of the three types of scaffolds， and DAPI staining， electron microscopy， and CCK-8 assay were used to evaluate the biocompatibility of the three types of scaffolds.

Results XRD， FTIR spectroscopy， TG analysis， and Raman spectroscopy showed that the three types of scaffolds were successfully prepared. Electron microscopy showed that scaffold C had a significantly longer fiber diameter than scaffold A （F=73.050，t=8.724，9.747，Plt;0.05）. The tensile stress test showed that scaffold B had a significantly higher tensile stress than scaffolds A and C （F=13.833，t=3.641，3.802，Plt;0.05）. The water contact angle test showed that all three types of scaffolds were hydrophilic. The conductivity test showed that scaffolds B and C had a significantly higher conductivity than scaffold A （F=798.780，t=32.155，30.048，Plt;0.05）. The expansion rate test showed that for scaffold A， the expansion rate at 5 h after immersed in PBS buffer was significantly higher than that at 0.5 h （Fintra-group=53.103，Plt;0.05）， and for scaffold C， the expansion rate at 2-5 h was significantly higher than that at 0.5 h （Fintra-group=103.748，Plt;0.05）; at each time point of 0.5-4 h， scaffold A had a significantly higher expansion rate than scaffolds B and C， and at each time point from 0.5 to 2 h， scaffold B had a significantly higher expansion rate than scaffold C （Finter-group=35.226-162.448，Plt;0.05）. DAPI staining and electron microscopy images showed that after the culture of H9C2 cardiomyocytes on the three types of scaffolds for 96 h， scaffolds B and C had a significant increase in the number of H9C2 cardiomyocytes compared with scaffold A. CCK-8 assay showed that the absorbance values of H9C2 on scaffolds A， B， and C at each time point from 18 h to 5 days were significantly higher than those at 12 h （Fintra-group=37.159-67.083，Plt;0.05）， and at each time point from 12 h to 5 days， H9C2 on scaffold C had a significantly higher absorbance value than scaffolds A and B （Finter-group=26.039-80.994，Plt;0.05）.

Conclusion The composite scaffolds for rat H9C2 cardiomyocytes conform to the characteristics of extracellular matrix and can support the growth of cardiomyocytes， among which PCL/CS/ZnO/CNTs scaffolds show relatively high biocompatibility and have a greater potential than PCL/CS scaffolds in cardiac tissue engineering.

［KEY WORDS］ Carboxymethylcellulose sodium; Chitosan; Extracellular matrix; Tissue engineering; Tissue scaffolds; Myocytes cardic

心臟移植是目前臨床治療心臟衰竭的最終手段，但因其供體有限無法在臨床上得到廣泛應用。心臟組織工程（CTE）集合了生物學、材料科學和醫(yī)學等學科的技術，是一種很有前途的治療心功能受損的手段，其開發(fā)的用于重建心臟組織功能的替代品由種子細胞、生物材料和生物活性因子組成。心肌細胞可以播種于由生物材料組成的支架中，該支架為體外形成心肌組織提供了必要的微環(huán)境。然而，能夠模擬心肌機電耦合能力的理想細胞支架目前較少［1］，如何較好地構建出符合心肌細胞外基質電生理特性的細胞支架已成為目前研究熱點。本研究通過添加導電性物質氧化鋅（ZnO）納米顆粒、碳納米管（CNTs），使用靜電紡絲法合成了基于聚己內酯（PCL）/殼聚糖（CS）的多元復合納米纖維支架，驗證并比較所制備支架的理化特性和生物相容性，優(yōu)選更符合心肌細胞外基質特征的大鼠心肌細胞系H9C2多元復合支架，為心臟組織工程支架的應用提供新選擇。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

PCL購自上海麥克林生化科技有限公司，ZnO購買于上海西格瑪奧德里奇貿易有限公司，CS、CNTs、甲酸、乙醇購自上海國藥集團化學試劑有限公司，乙酸購自北京西美杰科技有限公司，DAPI、FITC-鬼筆環(huán)肽購自上海碧云天生物技術股份有限公司，青霉素-鏈霉素溶液、胎牛血清、多聚甲醛、PBS緩沖液、大鼠心肌細胞系H9C2細胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司，CCK-8實驗試劑盒購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 PCL/CS多元復合支架的制備及驗證

向3.5 mL 99.5%甲酸和1.5 mL 88.0%乙酸的混合物中加入0.8 g PCL和0.1 g CS攪拌過夜，得到的溶液轉移到5 mL一次性注射器中，放入靜電紡絲機當中進行靜電紡絲（在轉速為220 r/min、22 ℃、相對濕度35%的條件下持續(xù)進行8 h，施加電壓17 kV，流量0.1 mL/h，針距10 cm），制備出PCL/CS支架（支架A）；向同樣的甲酸、乙酸混合物中加入0.8 g PCL、0.1 g CS和0.05 g ZnO，攪拌過夜后通過靜電紡絲機制備出PCL/CS/ZnO支架（支架B）；再向同樣的甲酸、乙酸混合物中加入0.8 g PCL、0.1 g CS和0.05 g CNTs，攪拌過夜后通過靜電紡絲機制備出PCL/CS/ZnO/CNTs支架（支架C）。采用X射線衍射（XRD）測試［2］、傅里葉紅外光譜（FTIR）測試［3］、熱重分析（TG）測試［4］、拉曼光譜測試［5］驗證三種支架的組成及物質結構。

1.3 三種支架的理化特征評估

1.3.1 掃描電子顯微鏡（SEM）觀察支架纖維結構

取三種支架噴金，用SEM（JEM-2100F）在10 kV下對三種支架的纖維形貌進行觀察，保存SEM圖像并用Image J軟件分析支架的纖維結構。

1.3.2 支架的拉伸應力測試 取三種支架，分別切成5 cm×1 cm大小的矩形碎片，放置在電子萬能試驗機（CMT6103）的夾具中，以2 mm/min的延伸速度縱向拉伸直至失效，將得到的數(shù)據(jù)用Origin軟件進行分析，得出支架的拉伸應力。

1.3.3 支架的水接觸角測試 取三種支架分別固定在載玻片上，向表面加入3 μL去離子水，待液滴平衡3 s后，使用水接觸角分析儀（SCD200）測量水接觸角。

1.3.4 支架的電導率測試 取三種支架，使用超高電阻測量儀（ST2643）在待測支架上設置三個電極，通過電流探頭輸入機器自動調節(jié)電流，同時在探頭間測量電壓，得到電阻率數(shù)據(jù)，取其倒數(shù)得到支架電導率。

1.3.5 支架的膨脹率測定 取三種支架測量其干質量，將支架在PBS緩沖液中浸泡0.5 h后取出，用濾紙吸除支架表面多余的水分后，立即測量支架的質量。重復上述實驗，PBS緩沖液中浸泡時間分別改為1、2、3、4、5 h，其他步驟同前。支架各時間點的膨脹率通過相關公式［6］計算得到。

1.3.6 支架的孔隙率測定 將三種支架在25 ℃的真空烘箱當中放置24 h以后，稱重，再在體積分數(shù)0.999的乙醇中浸泡24 h以后，再次稱重，靜置揮發(fā)去除乙醇后再稱重一次。支架的孔隙率根據(jù)相關公式［7］計算得到。

1.4 大鼠心肌細胞H9C2在支架上黏附情況評估

將大鼠H9C2心肌細胞加入含質量分數(shù)0.1胎牛血清、100 kU/L青霉素和100 kU/L鏈霉素的培養(yǎng)基中，置于37 ℃、含體積分數(shù)0.05的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞融合率約達90%時，以1∶2的比例傳代一次，隨后分別將10 000個細胞接種到表面積為1 cm2的三種支架上。分別在48、96 h以后用4%多聚甲醛固定支架上的細胞，再用DAPI染色，使用熒光顯微鏡（尼康A1R MP）觀察并拍攝細胞圖像。取培養(yǎng)96 h后用4%多聚甲醛固定的細胞，依次用體積分數(shù)0.30、0.50、0.70、0.80、0.90、0.95、1.00的乙醇溶液［8］對其進行洗脫，使用SEM觀察并拍攝細胞圖像。

1.5 大鼠心肌細胞H9C2在支架上面的增殖能力評估

將三種支架置于96孔培養(yǎng)板中，并加入大鼠H9C2心肌細胞，置于37 ℃、含體積分數(shù)0.05的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0.5 h，每孔中加入CCK-8溶液10 μL，孵育1～4 h。重復上述實驗，將細胞在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)的時間分別改為12 h、18 h及1、3、5、7 d，其他步驟同前。使用酶標儀測量各孔溶液在波長450 nm處的吸光度值，以吸光度值代表細胞的增殖能力。

1.6 統(tǒng)計學分析

使用SPSS 25.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。每個實驗重復進行3次，結果取均值。符合正態(tài)分布的計量資料以x-±s表示，多組間比較采用單因素方差分析或者重復測量設計的方差分析，兩兩比較則采用獨立樣本t檢驗。以Plt;0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結" 果

2.1 三種支架制備成功驗證

XRD、FTIR檢測結果顯示，PCL和CS在三種支架中均存在，ZnO在支架B中存在，ZnO、CNTs在支架C中存在（圖1a、b）；TG檢測結果顯示，支架B中ZnO含量約為6%，支架C中CNTs含量約為5%（圖1c）；拉曼光譜檢測結果顯示，支架C當中CNTs的結構缺陷和雜質含量均較少（圖1d）。

2.2 三種支架的理化特征比較

2.2.1 SEM觀察支架纖維結構 SEM圖像顯示，三種支架的靜電紡絲纖維排布取向隨機，相互連接，無明顯液滴，支架A、B、C的平均纖維直徑分別為（65.9±1.4）、（62.6±3.5）和（118.6±4.3）nm，支架C的纖維直徑顯著長于支架A、B（F=73.050，t=8.724、9.747，Plt;0.05）。見圖2。

2.2.2 三種支架拉伸應力比較 支架A、B、C的拉伸應力分別為（0.220±0.078）、（4.310±1.120）和（0.040±0.020）MPa，三種支架的拉伸應力比較差異顯著，支架B的拉伸應力顯著高于支架A、C（F=13.833，t=3.641、3.802，Plt;0.05）。

2.2.3 三種支架水接觸角測試結果 支架A、B、C水接觸角分別為60.5°、76.1°、0°，表明支架皆親水。

2.2.4 三種支架電導率比較 支架A、B、C的電導率分別為（0.404±0.016）×10－10、（0.079±0.025）、（0.019±0.062）S/m，支架B、C的電導率均顯著性高于支架A（F=798.780，t=32.155、30.048，Plt;0.05）。

2.2.5 三種支架膨脹率比較 重復測量設計的方差分析結果顯示，時間、支架類型及其交互作用均對支架的膨脹率具有顯著性的影響（F時間=118.110，F(xiàn)支架類型=112.327，F(xiàn)交互=30.237，Plt;0.05）。單獨效應結果顯示，支架A浸泡于PBS緩沖液后第5小時的膨脹率顯著高于第0.5小時（F組內=53.103，Plt;0.05），支架C浸泡于PBS緩沖液后第2～5小時中各時間點膨脹率均顯著性高于第0.5小時（F組內=103.748，Plt;0.05）；在第0.5～4小時中各時間點，支架A的膨脹率顯著高于支架B、C，在第0.5～2小時中各時間點，支架B膨脹率顯著高于支架C（F組間=35.226～162.448，Plt;0.05）。見表1。

2.2.6 三種支架孔隙率比較 支架A、B、C的孔隙率分別為（99.011±8.610）%、（93.376±9.870）%、（94.418±3.700）%，各支架孔隙率均高于90%，但三種支架間比較無顯著差異（P＞0.05）。

2.3 三種支架上大鼠心肌細胞H9C2的黏附能力評估

DAPI染色結果表明，與支架B、C相比，支架A表面H9C2黏附數(shù)量有限。SEM圖像顯示，在三種支架上培養(yǎng)至第96小時時，支架B、C表面H9C2黏附數(shù)量較支架A增多（圖3），黏附的細胞不僅覆蓋在納米纖維表面，而且穿透支架的孔隙，支架C上的細胞幾乎擴散到整個生物支架上。

2.4 三種支架上大鼠心肌細胞H9C2的增殖能力評估

重復測量設計的方差分析結果顯示，時間、支架類型及其交互作用均對H9C2細胞吸光度值有顯著影響（F時間=139.357，F(xiàn)支架類型=38.762，F(xiàn)交互=12.542，Plt;0.05）。單獨效應結果顯示，支架A、B、C表面的H9C2細胞在第18小時～第5天中各時間點的吸光度值均顯著性高于第12小時（F組內=37.159～67.083，Plt;0.05）；在第12小時～第5天中各時間點，支架C表面H9C2細胞的吸光度值均顯著高于支架A、B（F組間=26.039～80.994，Plt;0.05）。見表2。

3 討" 論

心臟組織工程的發(fā)展為體外構建人體組織及器官帶來了希望，其中心臟組織生物支架為受損心肌的功能修復提供了可能。適用于心臟組織工程的生物支架應具備良好的生物相容性、三維網狀結構和導電性等功能特征，上述特征對于刺激心肌細胞的黏附和增殖至關重要。

本研究拉伸應力測試結果顯示，支架B的拉伸應力顯著高于支架A、C。PCL可使支架在拉伸應力下延展良好，而CS較高的帶電基團水平提高了支架的斷裂強度，支架B拉伸應力的增強可歸因于ZnO在支架纖維結構中的有效分散及其自身界面的相互作用［9-10］，而支架C應力較低可能是由于CNTs團聚阻礙了ZnO的分散，使支架力學性能表現(xiàn)較差［11］。既往研究表明，應力強度較小的支架更能模擬早期心肌組織的機械微環(huán)境，促進心肌細胞某些功能的成熟［12］，因此支架A、C比B更符合理想的心肌組織模擬生長基質環(huán)境。本研究水接觸角測試結果表明支架C的親水性更高，可能是因為CNTs具有親水性基團，如羧基基團［13］，而支架的親水性增加會促進細胞對支架的黏附［14］。SEM鏡下支架C的纖維直徑變大，可能是由于外加場強和溶液的黏性增加，致使紡絲液射流不穩(wěn)定引起的［15］。

支架纖維直徑增大可致拉伸應力降低，更有利于心肌細胞生長。高孔隙率有利于支架中空氣和水分的滲透，本研究三種支架的孔隙率均大于90%。天然心肌組織具有一定電導率［16］，本研究支架A幾乎不

導電，導電性材料ZnO和CNTs的添加使支架B、C更適用于心臟組織工程。支架的高膨脹率會導致植入物松動，并對周圍組織和微環(huán)境造成壓力［17］。支架在PBS溶液中浸泡過久會導致其崩解，從而影響支架的膨脹率。為更好地測量支架的膨脹率，本研究在PBS溶液浸泡支架0.5～5 h內觀察支架膨脹率，結果顯示在第0.5～4小時中各時間點，支架A膨脹率顯著高于支架B、C，在第0.5～2小時中各時間點，支架B膨脹率顯著高于支架C。ZnO、CNTs的加入使支架的膨脹率變低，有利于支架微結構的維持。本研究中含有CNTs成分的支架C在維持體內形狀、支持組織發(fā)育和承受體內各向應力方面更能滿足心臟組織工程的需要［18］。另外，高孔隙率的支架能為細胞在支架上的遷移和增殖提供充足機會，也保障了支架的保水能力，為細胞的初始生長和生物活性分子的持續(xù)釋放創(chuàng)造了合適環(huán)境。本研究中三種支架的孔隙率均大于90%，并且支架間無顯著差異。

為評估支架表面生物相容性，本研究將大鼠心肌細胞H9C2孵育48、96 h后，通過DAPI染色和SEM圖像觀察細胞的附著情況，發(fā)現(xiàn)支架C顯著改善了細胞在支架上的黏附密度及范圍，ZnO、CNTs的加入明顯補償了支架A低生物活性的缺陷。已有研究結果表明，ZnO可以刺激血管及骨組織形成，加速器官修復［19-20］，CNTs也有利于促進組織再生及強化［21］。為進一步觀察三種支架上的細胞增殖情況，本研究檢測了H9C2在支架上孵育第12、18小時及第1、3、5天時的吸光度值，結果表明三種支架上細胞增殖強度均隨時間處長而增高，且各時間點支架C上的細胞增殖強度均顯著高于支架A、B。心肌細胞H9C2在支架C上表現(xiàn)出良好的生長潛力，分析原因，可能是由于CNTs增加了細胞黏附的位點［22］，為大鼠心肌細胞的培養(yǎng)提供了更合適的微環(huán)境。

本研究存在的一定的局限性。首先，本研究檢測出添加了ZnO、CNTs的復合支架具有導電性，但心肌細胞在支架上生長行為的改善與導電性增加間關系仍待進一步深入研究；另外，本研究對支架上細胞生長行為的研究時間有限，所獲結果可能不適用于評估更長研究時間內支架上細胞的生長情況。

綜上所述，本研究成功制備了包含ZnO、CNTs成分的用于心臟組織工程的PCL/CS多元復合支架。其中，PCL/CS/ZnO/CNTs支架表現(xiàn)出優(yōu)越的微觀結構，具有與心肌細胞外基質較符合的電生理特性，更能促進大鼠心肌細胞黏附和增殖，為體外構建心臟組織提供了一定實驗基礎。

作者聲明：所有作者均參與了研究設計、論文的寫作及修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文，且均聲明不存在利益沖突。

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（本文編輯 范睿心 厲建強）