創傷后癲癇生物標志物研究進展

【摘要】 生物標志物是指可以作為正常生理過程、病理過程或對反應指標進行客觀測量的指標，具有非常廣泛的用途，如疾病診斷、判斷疾病分期、評價新藥或新療法的安全性與有效性等。創傷后癲癇（PTE）作為創傷性顱腦損傷（TBI）后最為嚴重的并發癥已經嚴重影響到國民健康，理應得到所有人的重視。本文總結的PTE生物標志物包括血漿/血清和腦脊液分子生物標志物、影像學生物標志物和電生理生物標志物，以期更加完善關于PTE的科學研究，并為其客觀評定提供思路。

【關鍵詞】 癲癇發生；外泌體；生物標記物；microRNA；創傷性腦損傷

【中圖分類號】 R651 【文獻標志碼】 A 【文章編號】 1672-7770（2024）05-0584-04

Research progress on biomarkers for post-traumatic epilepsy WANG Yong， XIE Yabin， ZHANG Chunyang， SHAO Guo， LI Ye， TONG Linghong， DONG Yanfang. Baotou Medical College， Inner Mongolia University of Science and Technology， Baotou 014010， China

Corresponding authors： DONG Yanfang， XIE Yabin

Abstract： Biomarkers are indicators that can be used as objective measures of normal physiological processes， pathological processes， or indicators of response， and have a very wide range of uses， such as diagnosis， disease staging， evaluation of the safety and efficacy of new drugs or treatments and so on. Post-traumatic epilepsy（PTE）， as the most serious complication after traumatic brain injury（TBI）， has seriously affected human health and deserves everyone’s attention. The PTE biomarkers summarized in this paper include plasma/serum and cerebrospinal fluid molecular biomarkers， imaging biomarkers and electrophysiological biomarkers， in order to improve the scientific research on PTE and provide ideas for its objective evaluation.

Key words： seizures; exosome; biomarker; microRNA; traumatic brain injury

基金項目：國家自然科學基金項目（81960238，82160250）

作者單位：014010 包頭，內蒙古科技大學包頭醫學院（王勇）；內蒙古科技大學包頭醫學院第一附屬醫院神經外科（王勇，張春陽，李燁，佟凌虹，董艷芳）；內蒙古科技大學包頭醫學院（謝雅彬）；深圳市龍崗區第三人民醫院（邵國）

通信作者：董艷芳，謝雅彬

近幾十年來，中國國內經濟發展迅速，交通、建筑等行業蓬勃發展。伴隨著這一發展，創傷性顱腦損傷（traumatic brain injury，TBI）的發病率也隨之增加，進而導致了創傷后癇性發作（posttraumatic seizures，PTS）的增加。PTS已成為全球神經科醫生面臨的新挑戰，一旦任由PTS進展，患者便會從偶發驚厥發展到頑固的創傷后癲癇（posttraumatic epilepsy，PTE）^［1］。全球的研究人員正在積極尋找新的方法來探索導致驚厥事件的高危因素。為了有效地規避導致PTE的危險因素，降低其發病率，首先要對PTE的臨床特征進行研究。PTE根據受傷后發作的時間可分為3類^［2］：24 h內發生的稱為即刻發作；早期發作出現在24 h到一周之間；而1周后為遲發性發作；如果反復發作則可確診為PTE。需要明確的是，將創傷后的單次癇性發作定義為PTE是不恰當的，因為能夠引發癇性發作的因素很多。PTS與PTE之間的這種差異對癲癇的診斷、預后及治療產生直接影響^［3］。PTE目前已成為TBI后患者致殘及死亡的主要原因^［4］。在司法及保險理賠領域，PTE致傷致殘的評定等級很高^［5］，一般可達四級傷殘。但是目前尚無臨床治療方法可用于阻止或緩解高危患者的癲癇發生或緩解診斷后的癲癇病程。因此，能夠發現有利于預測、診斷及評估PTE預后的生物標記物就顯得尤為必要。基于PTE的臨床及病理機制特點，其生物標志物大致可分為以下三類：（1）血液及腦脊液中生物標記物；（2）神經電生理生物標記物；（3）磁共振影像生物標記物。現根據上述類別對PTE的生物標記物研究進展綜述如下。

1 血液及腦脊液中生物標記物

相較于其他的生物標記物，血液和腦脊液易于獲得，可檢測的項目也比較豐富，在血細胞或細胞外囊泡中存在著多種循環和腦脊液來源的生物標記物，它們存在于不同的體液成分中，有些可以與蛋白質相結合。這些體液成分還可以攜帶有關生物標志物的來源和功能的信息。因此，可以根據定位區間劃分TBI、癲癇和PTE生物標志物的數據。

1.1 外泌體中miRNA 目前已經有研究在輕度、中度和重度TBI中循環或腦脊液miRNA/（noncoding RNA，ncRNA）作為其生物標志物的潛力，而循環和腦脊液miRNA/ncRNA作為癲癇生物標志物的潛力也得到了獨立研究。這些數據可以用來評估TBI和癲癇之間是否存在共同的循環或腦脊液miRNA和ncRNA特征，其中miRNA是最具有研究前景的外泌體組分之一。miRNA是長度約為22個核苷酸（nt）的非編碼RNA^［6］。miRNA分布廣泛，不僅能在組織中檢測到，而且在體液中也檢測到，如血漿和血清、腦脊液（CSF）、尿液、唾液、母乳、精液和眼淚^［7］，這些miRNA統稱為循環miRNA（circulating miRNA，cimiRNA）。所有已知的miRNA中，有70%在大腦中表達，有些是大腦特異性的^［8］。有研究發現^［9］，在癲癇患者切除的海馬體中，miRNA-134上調，其耗竭具有抗癲癇作用。由于miRNA表達與癲癇之間存在雙向因果關系，并且存在cimiRNA，因此可以合理地假設miRNA可以作為生物標志物，有助于確定癲癇的診斷或預測治療結果^［10］。與其他RNA不同的是，cimiRNA具有顯著的抗降解性，它們可以主動釋放，也可以作為細胞死亡的結果釋放。但是這些不同的釋放形式對分析前樣品制備和分析過程本身提出了挑戰，因為分析結果在很大程度上取決于輸入樣品的類型、RNA提取技術和檢測方法^［7］。除了已經有大量不同的miRNA之外，異構體的存在也增加了另一個層次的復雜性。異構粒是miRNA的變體，其序列和/或長度不同，通過替代切割、RNA編輯或非模板化核苷酸加成產生^［11］。在癲癇中，迄今為止還沒有關于異構粒的研究。

1.2 血腦屏障損傷后因子 出血和血腫是PTE發生損傷的基礎^［12］。從一過性的血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）通透性增加和腦內微血管破裂到硬膜下和腦實質出血，上述均為TBI后會出現的各種不同程度的顱腦出血性損傷，尤其是BBB的破壞。BBB是由腦的毛細血管內皮細胞、平滑肌細胞/周細胞和神經膠質末梢組成，它們共同組成分離血液和腦組織的功能單元^［13］。BBB可以保護神經元免受血液中毒素的侵害，并調節血液成分進出大腦細胞外空間的通道。腦水腫和血管痙攣是重型TBI的標志，而應激或損傷的內皮細胞會增加血管內皮特異性糖蛋白血管性血友病因子（ von Willebrand factor，vWF ）的表達。有研究發現，小鼠實驗性腦出血后，上調vWF的處理導致周細胞丟失，BBB完整性受損，血腫周圍水腫更嚴重^［14］。Suidan等^［15］的研究發現，vWF可以通過缺氧和毛果蕓香堿誘導的實驗性癲癇發作釋放到血漿中。然而，vWF作為BBB損傷和/或伴隨缺氧的診斷生物標志物的統計學性能尚未得到檢驗。在一些實驗模型和人類PTE中^［16-18］，BBB受損會增加癲癇發作易感性。這些數據產生了一個假設，即PTE的分子標志物可能起源于BBB本身，而不僅僅是腦組織衍生的物質。

1.3 蛋白質生物標記物 在癲癇研究領域，蛋白質生物標志物已被用于區分癲癇患者與對照組的患者。大多數研究集中于不同的腦源性蛋白，研究較多的是補體。6種補體分析物（ C3、C4、蛋白多糖、H因子、C1抑制劑、聚集素）被證明有助于區分癲癇患者和對照^［19］。顱腦穿透性傷更易出現PTE^［20］，其可能機制在于硬腦膜的破損會損傷、破壞成纖維細胞，然后釋放結構蛋白、膠原蛋白、網狀纖維和糖胺聚糖進入腦脊液和體循環。此外，腦源性神經營養因子也可用于區分癲癇發作次數較多的患者^［21］。因此蛋白質生物標志物為識別繼發性損傷過程中的特殊病理改變及其時間特征提供了可靠和客觀的手段，進而為治療干預提供了機會，可以限制損傷，改善功能恢復，并防止損傷引起的慢性疾病。

1.4 炎癥因子 炎癥是損傷后的基本防御機制，也是中、重度TBI潛在的致病機制^［22］。事實上，神經炎癥也是PTE發生發展的主要病理機制之一^［23］。神經炎癥可能在維持PTE方面發揮重要作用，因為癲癇發作可以增加BBB通透性，允許外周免疫細胞進入腦實質并釋放炎癥分子，從而導致惡性循環。此外，自身免疫對PTE的影響也不容忽視。重型TBI會導致嚴重的腦組織損傷，將腦細胞內外的蛋白質釋放到間質、腦脊液和體循環中，而這些蛋白質及其降解產物可以引發免疫反應^［24］。有研究發現，結合自身免疫反應，神經炎癥可能是癲癇發生和維持PTE的最重要病理機制^［25］。

1.5 遺傳因素 目前只有少數研究報告了遺傳因素對人類PTE和動物實驗的影響。Kumar等^［26］的研究報道了谷氨酸轉運蛋白基因SLC1A1和SLC1A3突變與TBI后癲癇風險增加有關，星形膠質谷氨酸轉運蛋白基因的遺傳變異可以使重度顱腦損傷后癲癇發作和PTS風險增高。Diamond等^［27］發現腺苷調控周期的遺傳變異與PTE發生風險增加相關，同時編碼腺苷激酶（一種將腺苷磷酸化為單磷酸腺苷的酶）的ADK基因的特異性變異和編碼5′-核苷酸酶的NT5E基因也會影響TBI后癲癇發生的快速進展。目前，遺傳因素可被評估為TBI后癲癇發生的預后生物標志物，可被用于指導臨床醫生更密切地監測TBI后有癲癇發生風險的個體，豐富抗癲癇發生試驗的患者群體，并觀察預測/藥效學/反應生物標志物的性能，以預測攜帶不同遺傳變異的患者亞群對治療的反應。

2 神經電生理生物標記物

自19世紀初以來，科學家們已經應用神經生理學平臺來監測正常和患病的中樞神經系統的活動，Berger在1924年首次記錄了人類腦電圖（electroencephalogram，EEG）^［28］。此后，EEG通常用于確診癲癇^［29］，然而其敏感性有限；約1/3癲癇患者總是顯示發作間期癲癇樣放電（interictal epileptiform discharges，IED），約60%偶爾會顯示IED，8%在30 min常規EEG掃描中從未顯示IED^［30］。因此，即便使用激發方法（如睡眠剝奪、過度換氣和光刺激等）重復進行EEG掃描，也會在相當一部分患者群體中錯過IED；而在神經系統患者中，EEG的特異性也限制在88%^［31］。美國加州大學的一項研究發現，可將高頻振蕩（80～500 Hz）作為癲癇動物模型中（包括側向液壓沖擊傷）致癇性和癲癇發生的生物標志物^［32］。但是，使用大型動物的PTE研究仍然有限，在理想情況下，針對PTE的實驗動物的大腦應盡量類似人類大腦。有研究團隊使用豬作為PTE的實驗動物模型^［33］，對其進行了長達13個月的長程視頻EEG檢測并描述了檢測方法。盡管EEG中的癲癇樣活性幾十年來一直被用作癲癇的診斷生物標志物，但EEG在癲癇發生的生物標志物發現中的應用卻一直很少，這可能與使用成本、對患者進行長期記錄的實用性以及需要分析大量數據相關的挑戰有關。

3 磁共振影像生物標記物

核磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）作為一項無創并安全的臨床檢查方法，易于轉化為臨床癲癇發病研究，其作為生物標志物分析平臺的價值可謂巨大。然而，目前只有少數PTE的實驗和臨床研究將磁共振影像應用于生物標志物的發現。Huttunen等^［34］假設功能性MRI（functional MRI，fMRI）可用于識別損傷后癲癇發生過程中具有過度興奮性的大腦區域，他們將大鼠隨機分為假手術對照組和TBI組。在假手術組作為的實驗對照中，戊四氮（pentylenetetrazole，PTZ）誘導的血氧水平依賴性信號（blood oxygenation level-dependent，BOLD）的激活首先出現在雙側皮層中。相比之下，在56%的TBI大鼠中，PTZ誘導的BOLD信號始于同側病灶周圍區域，隨后是對側皮層的激活。在其余44%的TBI大鼠中，BOLD信號則類似于假手術對照組，開始于雙側。這些發現表明，病灶周圍皮層對TBI后PTZ誘導的過度興奮敏感，提示腦創傷病灶周圍致癇區的演變。而TBI后BBB破壞的嚴重程度（即其滲透性）也被認為是 PTE發生后有希望的預后生物標志物。有研究小組證明^［35］，利用動態對比增強核磁共振成像（synamic contrast enhanced MRI，DCE-MRI）的參數體積轉移系數（Ktrans）值可以定量測量BBB破壞后的滲透性，評估BBB的功能障礙。可以合理推測損傷部位BBB功能障礙可能是TBI后癲癇發生的預后生物標志物。

4 總 結

有價值的生物標志物可以在多數情況下將健康受試者與患者區分開來。鑒于PTE的發病機制多與TBI重疊，導致二者之間患者體內細胞微環境改變較難區分，一方面由于腦損傷的原因多且復雜，導致單一指標特異性不高；另一方面由于臨床檢測手段局限等原因，使得各種體液來源的生物標志物應用于臨床尚需時日。由此可見，比較已發表的TBI和癲癇研究之間的miRNA等體液來源的生物標志物特征是復雜而艱難的。為了克服這些挑戰，美國國家神經疾病和中風研究所（National Institute of Neurological Disorders and Stroke，NINDS）資助的抗癲癇治療癲癇生物信息學研究（EpiBioS4Rx）聯盟首次嘗試協調臨床前程序，以發現PTE的分子、電生理和MRI生物標志物^［36］。例如，聯盟已經應用了關于動物實驗的標準化血液采樣^［37］和MRI^［38］協議。MRI可以確認或排除潛在致癇性病變的存在^［39］。然而，所有大腦皮層病變均可（并非一定）引起癲癇，因此影像學檢查結果不具有特異性，相當大比例的癲癇患者最終的MRI結果尚無定論^［40］。現階段，不論是何種類型的癲癇發作，還是需要使用傳統診斷方式EEG、神經影像學檢查及臨床病史來明確。總體而言，對PTE的生物標志物研究發現還處于早期階段，但隨著對疾病及生物標志物的深入認識、大樣本的實驗及各種精密檢驗儀器不斷涌現，相信在不久的將來可以找到更加便捷、客觀的生物標志物指標。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：王勇、李燁、佟凌虹負責起草、修改論文；謝雅彬、邵國負責設計論文框架、指導撰寫論文；張春陽、董艷芳負責擬定寫作思路、指導撰寫論文。

［參 考 文 獻］

［1］ DeGrauw X，Thurman D，Xu LK，et al.Epidemiology of traumatic brain injury-associated epilepsy and early use of anti-epilepsy drugs：an analysis of insurance claims data，2004—2014［J］.Epilepsy Res，2018，146：41-49.

［2］ Anwer F，Oliveri F，Kakargias F，et al.Post-traumatic seizures：a deep-dive into pathogenesis［J］.Cureus，2021，13（4）：e14395.

［3］ Cotter D，Kelso A，Neligan A.Genetic biomarkers of posttraumatic epilepsy：a systematic review［J］.Seizure，2017，46：53-58.

［4］ Keret A，Shweiki M，Bennett-Back O，et al.The clinical characteristics of posttraumatic epilepsy following moderate-to-severe traumatic brain injury in children［J］.Seizure，2018，58：29-34.

［5］ 周鳳娟，劉鴻霞，賈孝，等.外傷性癲癇遺傳標記物研究進展［J］.中國法醫學雜志，2019，34（6）：582-585.

Zhou FJ，Liu HX，Jia X，et al.Research advances on genetic biomarkers of posttraumatic epilepsy［J］.Chin J Forensic Med，2019，34（6）：582-585.

［6］ van den Berg MMJ，Krauskopf J，Ramaekers JG，et al.Circulating microRNAs as potential biomarkers for psychiatric and neurodegenerative disorders［J］.Prog Neurobiol，2020，185：101732.

［7］ Sohel MH.Extracellular/circulating microRNAs：release mechanisms，functions and challenges［J］.Achiev Life Sci，2016，10（2）：175-186.

［8］ Ludwig N，Leidinger P，Becker K，et al.Distribution of miRNA expression across human tissues［J］.Nucleic Acids Res，2016，44（8）：3865-3877.

［9］ Morris G，Langa E，Fearon C，et al.MicroRNA inhibition using antimiRs in acute human brain tissue sections［J］.Epilepsia，2022，63（8）：e92-e99.

［10］Pitk?nen A，Ekolle Ndode-Ekane X，Lapinlampi N，et al.Epilepsy biomarkers-Toward etiology and pathology specificity［J］.Neurobiol Dis，2019，123：42-58.

［11］Tanzer A，Hofacker IL，Lorenz R.RNA modifications in structure prediction-Status quo and future challenges［J］.Methods，2019，156：32-39.

［12］Xu T，Yu XY，Ou S，et al.Risk factors for posttraumatic epilepsy：a systematic review and meta-analysis［J］.Epilepsy Behav，2017，67：1-6.

［13］Singh AV，Chandrasekar V，Laux P，et al.Micropatterned neurovascular interface to mimic the blood-brain barrier’s neurophysiology and micromechanical function：a BBB-on-CHIP model［J］.Cells，2022，11（18）：2801.

［14］Zhu XM，Cao YL，Wei LX，et al.Von Willebrand factor contributes to poor outcome in a mouse model of intracerebral haemorrhage［J］.Sci Rep，2016，6：35901.

［15］Suidan GL，Brill A，De Meyer SF，et al.Endothelial Von Willebrand factor promotes blood-brain barrier flexibility and provides protection from hypoxia and seizures in mice［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2013，33（9）：2112-2120.

［16］Marchi N，Teng QS，Ghosh C，et al.Blood-brain barrier damage，but not parenchymal white blood cells，is a hallmark of seizure activity［J］.Brain Res，2010，1353：176-186.

［17］Dadas A，Janigro D.Breakdown of blood brain barrier as a mechanism of post-traumatic epilepsy［J］.Neurobiol Dis，2019，123：20-26.

［18］Randi AM，Laffan MA.Von Willebrand factor and angiogenesis：basic and applied issues［J］.J Thromb Haemost，2017，15（1）：13-20.

［19］Kopczynska M，Zelek WM，Vespa S，et al.Complement system biomarkers in epilepsy［J］.Seizure，2018，60：1-7.

［20］K?r?k A，Ya?ar S，Durmaz MO.Prognostic factors in craniocerebral gunshot wounds：Analysis of 30 patients from the neurosurgical viewpoint［J］.Ulus Travma Acil Cerrahi Derg，2020，26（6）：859-864.

［21］Chen SF，Jou SB，Chen NC，et al.Serum levels of brain-derived neurotrophic factor and insulin-like growth factor 1 are associated with autonomic dysfunction and impaired cerebral autoregulation in patients with epilepsy［J］.Front Neurol，2018，9：969.

［22］Simon DW，McGeachy MJ，Bay？r H，et al.The far-reaching scope of neuroinflammation after traumatic brain injury［J］.Nat Rev Neurol，2017，13（9）：572.

［23］Webster KM，Sun MJ，Crack P，et al.Inflammation in epileptogenesis after traumatic brain injury［J］.J Neuroinflammation，2017，14（1）：10.

［24］Agoston DV，Kamnaksh A.Protein biomarkers of epileptogenicity after traumatic brain injury［J］.Neurobiol Dis，2019，123：59-68.

［25］Soltani Khaboushan A，Yazdanpanah N，Rezaei N.Neuroinflammation and proinflammatory cytokines in epileptogenesis［J］.Mol Neurobiol，2022，59（3）：1724-1743.

［26］Kumar RG，Breslin KB，Ritter AC，et al.Variability with astroglial glutamate transport genetics is associated with increased risk for post-traumatic seizures［J］.J Neurotrauma，2019，36（2）：230-238.

［27］Diamond ML，Ritter AC，Jackson EK，et al.Genetic variation in the adenosine regulatory cycle is associated with posttraumatic epilepsy development［J］.Epilepsia，2015，56（8）：1198-1206.

［28］I·nce R，Adan?r SS，Sevmez F.The inventor of electroencephalography（EEG）：Hans Berger（1873—1941）［J］.Childs Nerv Syst，2021，37（9）：2723-2724.

［29］Chen H，Koubeissi MZ.Electroencephalography in epilepsy evaluation［J］.Continuum（Minneap Minn），2019，25（2）：431-453.

［30］Benbadis SR，Beniczky S，Bertram E，et al.The role of EEG in patients with suspected epilepsy［J］.Epileptic Disord，2020，22（2）：143-155.

［31］Sharma A，Rai JK，Tewari RP.Epileptic seizure anticipation and localisation of epileptogenic region using EEG signals［J］.J Med Eng Technol，2018，42（3）：203-216.

［32］Bragin A，Li L，Almajano J，et al.Pathologic electrographic changes after experimental traumatic brain injury［J］.Epilepsia，2016，57（5）：735-745.

［33］Martinez-Ramirez L，Slate A，Price G，et al.Robust，long-term video EEG monitoring in a porcine model of post-traumatic epilepsy［J］.eNeuro，2022，9（4）：ENEURO.0025-ENEURO.0022.2022.

［34］Huttunen JK，Airaksinen AM，Barba C，et al.Detection of hyperexcitability by functional magnetic resonance imaging after experimental traumatic brain injury［J］.J Neurotrauma，2018，35（22）：2708-2717.

［35］Yu MM，Wang ML，Yang DX，et al.Dynamics of blood brain barrier permeability and tissue microstructure following controlled cortical impact injury in rat：a dynamic contrast-enhanced magnetic resonance imaging and diffusion kurtosis imaging study［J］.Magn Reson Imaging，2019，62：1-9.

［36］Pitk?nen A，O’Brien TJ，Staba R.Preface-Practical and theoretical considerations for performing a multi-center preclinical biomarker discovery study of post-traumatic epileptogenesis：lessons learned from the EpiBioS4Rx consortium［J］.Epilepsy Res，2019，156：106080.

［37］van Vliet EA，Puhakka N，Mills JD，et al.Standardization procedure for plasma biomarker analysis in rat models of epileptogenesis：Focus on circulating microRNAs［J］.Epilepsia，2017，58（12）：2013-2024.

［38］Immonen R，Smith G，Brady RD，et al.Harmonization of pipeline for preclinical multicenter MRI biomarker discovery in a rat model of post-traumatic epileptogenesis［J］.Epilepsy Res，2019，150：46-57.

［39］Drexlin JC，Schweizer D，Stein VM.Diagnostics in epilepsy-potential of magnetic resonance imaging［J］.Tierarztl Prax Ausg K Kleintiere Heimtiere，2021，49（1）：29-42.

［40］Rostampour M，Hashemi H，Najibi SM，et al.Detection of structural abnormalities of cortical and subcortical gray matter in patients with MRI-negative refractory epilepsy using neurite orientation dispersion and density imaging［J］.Phys Med，2018，48：47-54.

（收稿2023-06-01 修回2023-07-20）