柑橘葉皰斑病毒櫻桃株系的全基因組克隆和初步鑒定

DOI：" 10.13855/j.cnki.lygs.2024.05.004

摘" 要：本研究利用small RNA高通量測序在甜櫻桃中發現了與乙型線性病毒科柑橘病毒屬的柑橘葉皰斑病毒具有較高同源性一種病毒。對該病毒進行全基因組克隆，分析發現，該病毒在核苷酸水平上與柑橘葉皰斑病毒的同源性為80%；該病毒的外殼蛋白基因序列與柑橘葉皰斑病毒的外殼蛋白基因序列進行同源性比較，在核苷酸水平上，同源性為79%，在氨基酸水平上，同源性為88%。根據該科病毒新種的劃分標準，認為該病毒為柑橘葉皰斑病的一個新株系，將其命名為柑橘葉皰斑病毒櫻桃株系。

關鍵詞：柑橘葉皰斑病毒CLBV；small RNA高通量測序；同源性分析

中圖分類號：" S662.5" 文獻標識碼：" A

文章編號：" 1002-2910（2024）05-0016-04

收稿日期：2024-08-06

基金項目：山東省自然科學基金面上項目（ZR2021MC117）；煙臺市大櫻桃育種聯合攻關團隊創建項目；山東省重點研發計劃項目 （ 2022TZXD006） 。

*通信作者：王甲威（1981-） ，男，山東聊城人，副研究員，從事果樹種質資源與遺傳育種研究工作。E-mail：wangjw-sdip@qq.com

作者簡介：王剛（1994-），男，山東聊城人，研究實習員，從事果樹種質資源與遺傳育種研究工作。E-mail：1468055441@qq.com

Whole genome cloning and preliminary identification of CLBV strain in Prunus

WANG Gang， QIAO Qian， ZHU Dongzi， LIU Qingzhong， WANG Jiawei*

（Shandong Institute of Pomology/ Ministry of Agriculture Huanghuai area Pomology Science Observation Experimental Station， Tai'an， Shandong 27100，China）

Abstract：In this study， small RNA high-throughput sequencing was used to identify a virus with high homology to the citrus leaf blister virus（CLBV） of the genus beta-linear virus in sweet cherry. The whole genome of the virus was cloned， and it was found that the virus had 80% homology with CLBV at nucleotide level; the sequence homology of the coat protein gene of this virus was compared with that of CLBV. The homology was 79% at the nucleotide level and 88% at the amino acid level. According to the classification criteria， this virus was considered a new strain of CLBV， and named Citrus Leaf Blotch virus Strain Prunus.

Key words：citrus leaf blister spot virus CLBV; small RNA high-throughput sequencing; homology analysis

柑橘葉皰斑病毒（CLBV）是屬于β線性病毒科（Beta flexiviridae）柑橘病毒屬（Citrivirus）的正義單鏈RNA病毒［1］。在美國加利福尼亞州首次發現該病毒，可引起橘橙葉片出現皰斑，并命名為橘橙葉皰斑病毒（Dweet mottle virus，DMV），隨后在西班牙采用嫁接鑒定技術研究發現金橘（Fortunel la margarita）感染CLBV［2］。進一步研究確認DMV和CLBV為同種病毒的不同分離物。在自然條件下，CLBV主要侵染柑橘屬（Citrus L.）和獼猴桃屬（Actinidia L.）植物，最近采用深度測序技術在中國櫻桃上首次檢測到該病毒［3］。該病毒主要通過嫁接傳播，具有較低的種傳能力，不能被昆蟲傳播。在獼猴桃上發現一種病毒（M3-A，JN900477）與CLBV具有較高的同源性，但因其序列的復雜性很難確定其為CLBV的一個新株系或是該屬病毒的一個新種，在此將其暫定為CLBV的新株系［4］。CLBV在世界上分布范圍較廣，包括西班牙、法國、意大利、日本、澳大利亞、新西蘭、美國，對柑橘生產造成了較大危害［5-7］。筆者介紹了柑橘葉皰斑病毒櫻桃株系（CLBV strain Prunus）的全基因組克隆方法及初步分析鑒定［8-10］。

1" 材料與方法

1.1" 試驗材料

試驗所用的柑橘葉皰斑病毒感染的櫻桃枝條樣本取材于山東省果樹研究所泰東試驗基地，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，DNA回收試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司。

1.2" 試驗設計

1.2.1 柑橘葉皰斑病毒櫻桃株系的全基因組克隆

引物設計。根據small RNA的分析結果，設計了3對引物，進行CLBV strain Prunus基因組序列的擴增，引物序列見下表1。

基因組序列擴增。以甜櫻桃CLBV感染枝條樣品的反轉錄產物為模板，進行CLBV strain Prunus的基因組序列擴增。

1.2.2 目的片段回收克隆及測序

目的片段回收與連接。將PCR產物電泳后的目的條帶進行切膠回收，切膠試劑盒為快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，將回收產物進行連接，所用連接試劑盒為pEASY-T1 Simple Cloning Kit。

陽性克隆的PCR鑒定及測序結果分析。用PCR方法鑒定陽性克隆，取1 μL菌水混合液于25 μL PCR體系中，用M13 Forward Primer 和M13 Reverse Primer 鑒定陽性克隆，每個產物挑選5個克隆進行測序。測序完成后，去除克隆載體序列，進行測序結果的拼接，得到CLBV strain Prunus基因組的序列。

1.2.3 擴增CLBV strain Prunus基因組的5’端序列

根據CLBV strain Prunus基因組序列的測序結果設計5’RACE的引物，進行CLBV strain Prunus基因組5’端序列的擴增，引物序列見表2。

1.2.4 擴增CLBV strain Prunus基因組的3’端序列

根據CLBV strain Prunus基因組序列的測序結果設計3’RACE的引物，進行CLBV strain Prunus基因組3’端序列的擴增，引物序列見表3。

1.2.5 CLBV strain Prunus全基因組序列拼接

通過基因組序列的克隆、3’RACE及5’RACE的測序結果，可以拼接得到CLBV strain Prunus基因組的全序列。

2" 結果與分析

2.1" 基因組序列擴增結果

甜櫻桃CLBV感染枝條樣品進行CLBV strain Prunus的基因組序列擴增，電泳結果見圖1，從圖中可以看到，3對引物都擴增得到了目的條帶。

2.2" CLBV strain Prunus全基因組序列拼接結果

經過拼接得到了CLBV strain Prunus基因組的全序列，基因組全長8 672 nt，包含68 nt的5’UTR和528 nt的3’UTR。

2.3" 甜櫻桃CLBV 中sRNA測序讀數的總體分析

甜櫻桃CLBV 樣品通過HiSeq2000高通量測序平臺進行small RNA測序，測序策略為單端50 nt，得到的原始讀數約1500萬，去除接頭、低質量數據和序列長度小于18 nt的讀數后序列總長度為345 940 499 nt，具有很好的深度和一致性，可進行分析比較（表4）。

2.4" 甜櫻桃CLBV 中的sRNAs不同長度分析

將甜櫻桃CLBV 樣品中來源于CLBV strain Prunus的sRNAs根據長度進行分類，發現來源于病毒的sRNAs以21 nt和22 nt大小為主（圖2）。

2.5" 甜櫻桃CLBV的同源性分析及初步鑒定

2.5.1 CLBV strain Prunus的基因組同源性分析

將CLBV strain Prunus基因組全序列在NCBI上進行Blast分析，我們得到了與CLBV strain Prunus同源性較高的病毒序列。通過分析發現在GenBank上共注冊了4個CLBV病毒的基因組全序列，分別為AJ318061、EU857539、EU857540和FJ009367，以及暫定為CLBV新株系的JN900477、JN983454、JN983455和JN983456，其中AJ318061被選為CLBV病毒的參考序列（NC_003877）。從序列長度上分析，CLBV strain Prunus與這8個CLBV株系的序列長度不同，其中NC_003877、EU857539、EU857540和FJ009367序列長度均為8 747 nt， JN900477、JN983454、JN983455和JN983456序列長度均為8 782 nt，而CLBV strain Prunus序列長度為8 762 nt。將CLBV strain Prunus基因組全序列與這8個CLBV株系進行了序列比對，發現其相似性與第1組為80%，與第2組為75%。進一步的分析發現，這9個CLBV株系的基因組結構仍然分為3組（表5）。CLBV strain Prunus基因組編碼了3個ORF，其中，ORF1編碼了一個229 kDa融合蛋白，包括甲基轉移酶（methyltransferase ）、解旋酶（helicase）和RNA復制酶基因（RNA-dependent RNA polymerase）；ORF2編碼了一個40 kDa蛋白，推測為移動蛋白（Movement Protein）； ORF3編碼了一個40.2 kDa的蛋白，推測為外殼蛋白（coat protein）。

2.5.2 CLBV strain Prunus株系種屬關系的初步鑒定

為分析CLBV strain Prunus與甲型、乙型、丙型病毒科其他成員的親緣關系，選取這3個科其他屬病毒的外殼蛋白基因的的氨基酸序列，進行了進化關系分析，采用MEGA6.0軟件，選擇最大似然法（Maximum Likelihood，bootstrap replicates out of the 1000 replicates）進行進化關系分析，進化關系如圖3。從圖上可以看出，CLBV strain Prunus與CLBV、CLBV strain Actinidia具有較近的親緣關系，在同一個進化分支，與該科其他病毒親緣關系較遠［11］。

2.5.3 CLBV與其他CLBV株系的同源性分析

為了進一步分析CLBV strain Prunus與其他CLBV株系的親緣關系，將在GenBank注冊的所有CLBV的序列進行了同源性分析。從圖4上可以看出，CLBV strain Prunus與CLBV其他株系的親緣關系較遠，說明CLBV strain Prunus為一個新株系，這一株系可能僅在櫻桃上，能否侵染柑橘或獼猴桃尚需進一步研究。

3" 小結

根據CLBV strain Prunus測序的結果，得到了CLBV strain Prunus的全基因組序列。通過分析發現來自于CLBV strain Prunus的small RNA主要為21 nt和22 nt，這與其他植物病毒來源的small RNA相同，說明在櫻桃可能與其他植物具有相同的病毒防御機制。通過進化樹分析，進一步確認了CLBV strain Prunus株系的種屬地位，并根據外殼蛋白基因的氨基酸序列同源性分析結果，結合該科病毒的種的分類標準確認其為CLBV的一個新株系。

參考文獻：

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