象草葉片花青素含量與葉際細菌群落的相關性分

關鍵詞：象草；花青素；16S rRNA；葉際微生物；細菌群落

中圖分類號：S543 文獻標志碼：A

定殖于葉際（phyllosphere，植物地上部分）的細菌和真菌等微生物被稱為葉際微生物（phyllosphere microorganisms），其中以細菌的豐度最大[1-4]。依據定殖位置的不同，可將葉際微生物分為兩類，一類是附生在植物表面的微生物，稱為附生微生物（epiphytes）；另一類是定殖于植物內部的微生物，稱為內生微生物（endophytes）[5]。研究表明，附生微生物的豐度和豐富度遠大于內生微生物，而內生微生物與植物細胞的關系較附生微生物更密切[6]。葉際微生物主要來源于土壤，部分來源于空氣[7-9]。對于微生物來說，葉際并不是一個穩定的環境，其組成受環境因素的影響，這些因素包括氣候、土壤類型、地理位置、溫度、光照和濕度等[10-12]。此外，宿主植物的基因型、年齡以及宿主植物內部的次生代謝物也會對葉際微生物群有較大影響[13-15]。

多項研究表明，植物葉片內部的次生代謝產物和有機揮發物會影響葉際微生物群落的構成[15-18]。黃酮類化合物——花青素是植物體內重要的水溶性次生代謝產物，影響植物果實、花朵和葉片的顏色[19]。花青素具有參與植物體內非生物脅迫和生物脅迫抗逆反應，減輕植物受環境、病害的傷害等功能[20-21]。此外，花青素還具有抗氧化、抗癌、軟化血管和降低血糖等多種功效，具有極高的藥用價值，已廣泛應用于醫藥領域[22]。目前對花青素合成及調控的分子機制已有較為深入的研究[19， 22]，但植物中的花青素對植物葉際微生物群落是否產生影響有待進一步研究。

象草（Pennisetum purpureum）是狼尾草屬多年生草本植物，廣泛種植于熱帶亞熱帶地區[23]。象草具有產量高、生長速度快等特性，常用作飼料、青貯飼料、生物乙醇和紙張的原料以及生態修復等[23]。紫色象草（P. purpureum cv. Purple）葉片為紫色，其葉片較矮象草（P. purpureum cv.Mott）富含多種花青素[24]。因花青素的諸多優點，紫色象草被視為比綠色象草更佳的飼用品種[25-26]。

本研究采用16S rRNA 高通量測序技術對紫色象草和矮象草的葉際細菌群落進行比較分析，從細菌多樣性、群落結構等方面對比紫色象草和矮象草葉際細菌群落，探究不同花青素含量的象草葉際細菌的差異性，為花青素與植物葉際微生物群落相互作用的研究和實際利用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為摩特矮象草（P. purpureum cv.Mott，Mott）和紫色象草（P. purpureum cv. Purple，Purple），種植于廣東省廣州市華南農業大學草業科學系引種園（23°10'N， 113°22'E），2 種象草種植距離約為4 m。

1.2 方法

1.2.1 象草葉片花青素含量測定 用0.1%鹽酸-甲醇溶液配制矢車菊素-3-O-葡萄糖苷（Sigma-Aldrich，#52976）的標準溶液，濃度分別為20.0、12.5、10.0、5.0、2.5 mg/L。使用分光光度計Nano-Photometer NP80（implen）測530 nm 處吸光度，得出標準曲線。

稱取1 g 象草葉片用于花青素濃度測定。低溫破碎葉片組織后，加入10 mL 0.1%鹽酸-甲醇溶液，震蕩后超聲5 min，4 ℃避光保存過夜。5000 r/min離心10 min，取上清液，加入5 mL 氯仿及5 mLddH2O，搖勻后5000 r/min 離心10 min，取上層紅色液體，測530 nm 處OD 值，依據標準曲線計算樣品花青素濃度。

1.2.2 象草葉際微生物取樣 于2022 年6 月在華南農業大學草業科學系引種園采集象草樣本，選取長勢一致的象草作為試驗材料，每株象草作為一個獨立生物學重復，每種材料設置5～7 個生物學重復。將所取葉片組織浸沒于無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）中，室溫震蕩洗滌20 min，收集液體并重復1 次。取出植物組織，加入無菌PBS，超聲洗滌10 min，收集上述洗滌液，于0.22 μm 濾膜過濾，濾膜保存于–80 ℃，用于提取葉表面附生微生物DNA。剩余植物組織使用5%次氯酸鈉溶液浸泡5 min，無菌水漂洗3 次后儲存于–80 ℃，用于提取葉內生微生物總DNA。

1.2.3 擴增子文庫構建及測序 選用FastDNA?SPIN Kit for soil（MP Biomedicals）試劑盒提取樣本DNA。使用引物799F（5′-AACMGGATTAGATACCCKG-3′）、1193R（5′-ACGTCATCCCCACCTTCC-3′）和1392R（5′-ACGGGCGGTGTGTRC-3′）對細菌16S rDNA V5～V7 區域進行巢式擴增。第一輪PCR 擴增使用引物799F 和1392R，程序為：經95 ℃ 3 min 預變性后，95 ℃變性30 s；55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，進行27 個循環擴增，然后72 ℃穩定延伸10 min。第一輪擴增產物使用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences）回收純化后作為第二輪PCR 反應的模板。第二輪PCR 使用引物799F 和1193R，除循環數變更為13 外，其余程序同第一輪PCR。PCR反應體系為：5×TransStart FastPfu 緩沖液4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，上游引物（5 μmol/L）0.8 μL，下游引物（5 μmol/L）0.8 μL，TransStartFastPfu DNA 聚合酶0.4 μL，模板DNA 10 ng，用ddH2O 補足至20 μL，每個樣本3 個重復。將同一樣本的PCR 產物混合后使用2%瓊脂糖凝膠純化回收PCR 產物。純化后的PCR 產物使用2%瓊脂糖凝膠電泳進行質量檢測，并檢測DNA 濃度。PCR 產物質量及濃度合格后，使用NEXTFLEXRapid DNA-Seq Kit 進行建庫，利用Illumina 公司的Miseq PE300 平臺進行測序。

1.2.4 生物信息學分析 測序所得原始數據使用QIIME2-2022.2 平臺進行質量過濾和分類學分析[27]。利用DADA2 軟件去除引物，對序列進行質量過濾和校正，鑒別出操作分類單元（operational taxonomicunits，OTU）的代表序列，生成OTU 表[28]。每個OTU 的代表序列使用Greengenes（13_8）數據庫進行分類學注釋。依據OTU 表，使用QIIME2軟件計算出樣本α 多樣性的Shannon 多樣性指數和Faith 系統發育多樣性指數；使用QIIME2 軟件構建樣本間的Bray-Curtis 距離矩陣，基于該矩陣進行主成分分析（PCoA），并使用非加權組平均法（UPGMA）對樣本進行聚類分析。通過置換多元方差分析（permutational multivariate analysis ofvariance，PERMANOVA）計算微生物群落結構的差異以及微生物群落組成分析（analysis of compositionof microbiomes，ANCOM）探究樣本間OTU 的差異[29-30]。利用OriginPro 2022b 軟件中的Welch’s t 檢驗分析屬水平相對豐度的差異，通過Spearman 相關性分析檢驗屬水平相對豐度與花青素含量的相關性，并繪制柱狀圖。

2 結果與分析

2.1 象草花青素含量定量分析

紫色象草與矮象草的葉型相似，但顏色差異很大。由于花青素的積累，紫色象草的葉片正面和背面均為紫色，而矮象草葉片整體為綠色（圖1A，圖1B）。為進一步探究2 種象草葉片花青素含量的差異，分別對2 種象草葉片的花青素含量進行定量分析。結果表明，紫色象草葉片中的花青素含量為（150.15±3.41）μg/g，矮象草為（7.80±0.29）μg/g，2 種象草葉片花青素含量呈極顯著差異（Plt;0.001），紫色象草葉片中的花青素含量是矮象草的近20 倍（圖1C）。

2.2 象草葉際細菌α 多樣性分析

采用16S rRNA 測序技術對2 種象草葉片表面附生細菌及葉片內生細菌群落進行分析，共得到2 994 242 條reads，經分析得到26 門、45 綱、76 目、120 科、155 屬和881 個OTU。Shannon指數是反映物種豐富度和均勻度的一個均勻指標；Faith 系統發育多樣性指數反映群落的豐富度。本研究利用這2 個指數在OTU 水平分別對兩類樣本進行α 多樣性分析。結果表明，紫色象草和矮象草同一區室的α 多樣性均無顯著差異（圖2）。

2.3 象草葉際細菌β多樣性分析

為進一步探究花青素對象草葉際細菌群落結構的影響，根據OTU 水平的相對豐度，對紫色象草和矮象草的葉際細菌群落進行主成分分析（圖3A）。主成分1 解釋度為40.48%，主成分2 解釋度為19.29%，總解釋度為59.77%。其中，葉表面附生細菌樣本和葉內生細菌樣本在X 軸（主成分1）出現分離。進一步分析2 種象草的葉際細菌群落發現，2 種象草葉片內部細菌樣本距離較近，而葉片表面附生細菌樣本在Y 軸（主成分2）出現分離，紫色象草和矮象草樣品明顯分開。使用非加權組平均法（unweighted pair-group methodwith arithmetic means， UPGMA）對葉際細菌樣本進行聚類分析也得出相似結果：所有樣本可以聚類為3個分支，分支1包含所有葉片內部細菌樣本，分支2 為紫色象草表面細菌樣本，分支3 為矮象草表面細菌樣本（圖3B）。此外，通過置換多元方差分析（permutational multivariate analysisof variance， PERMANOVA）發現，2 種象草葉片表面附生細菌樣本的差異較葉片內生細菌更顯著（表1）。以上結果顯示，紫色象草和矮象草葉表細菌群落存在較大差異。

2.4 象草葉際細菌組成分析

為解析象草葉際細菌組成，在細菌門水平上對不同樣本進行相對豐度分析（圖4，表2）。結果顯示，葉片內部細菌的優勢菌門（占比≥1%）為變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和厚壁菌門（Firmicutes）；葉片表面細菌的優勢菌門除上述3 種外，還包括放線菌門（Actinobacteria）和異常球菌-棲熱菌門（Deinococus-Thermus）。紫色象草葉片表面變形菌門和異常球菌-棲熱菌門的相對豐度顯著大于矮象草，而擬桿菌門相對豐度則顯著小于矮象草。以上結果表明，紫色象草和矮象草葉際微生物優勢菌門及其相對豐度存在差異。

2.5 象草葉際細菌差異OTU 及差異屬分析

對紫色象草和矮象草的OTU 相對豐度進行組間差異分析（圖5）。圖中橫軸clr 統計量表示差異量的大小，當其為正值時，表示紫色象草中該OTU 的相對豐度高于矮象草，負值則相反；縱軸W 統計量表示顯著度。在2 種象草葉片內部細菌群落中未發現相對豐度差異顯著的OTU，而在葉片表面細菌群落中發現3 個相對豐度顯著差異的OTU，紫色象草OTU7（甲基桿菌屬Methylobacterium）、OTU8（異常球菌屬Deinococcus）和OTU69（Unclassified_Methylobacteriaceae）的相對豐度均高于矮象草（表3）。在細菌屬水平上，紫色象草表面細菌群落中的甲基桿菌屬、異常球菌和Unclassified_Methylobacteriaceae 的相對豐度顯著高于矮象草。同時，Spearman 相關性分析得出，象草表面甲基桿菌屬、異常球菌和Unclassified_Methylobacteriaceae 的相對豐度與花青素含量呈正相關（圖6，表4）。

3 討論

3.1 紫色象草和矮象草葉片花青素含量差異顯著

花青素是植物的重要次生代謝物，是影響植物顏色的關鍵色素之一[22]。多項研究表明，花青素參與植物抗逆反應，能提高植物耐逆境脅迫能力[31-32]。目前，學界對于花青素的生物合成通路以及調控網絡已有較為清晰的認識，已發現多種轉錄因子參與花青素合成的調控，如MYB家族、bHLH 家族和WD 蛋白等。多項研究解析了作物中影響花青素合成的關鍵調控因子[33-35]，如蒺藜苜蓿中過表達LAP1 基因可促進花青素在葉片中的積累[36]；玉米中ZmR1 基因的序列變異及表達水平影響了花青素在整個植株上的積累[37]；白色葡萄中VvmybA1 基因啟動子區域存在反轉座子插入，導致花色素苷合成基因轉錄受阻，影響了漿果著色，從而使果實呈現白色[38]。

紫色象草是葉片高花青素含量的象草品種。本研究發現，紫色象草葉片中的花青素含量是矮象草葉片中花青素含量的近20倍。研究表明，2種象草花青素種類不同，紫色象草花青素多為天竺葵素和錦葵色素的衍生物，矮象草花青素多為矢車菊素的衍生物[24]。目前對于紫色象草葉片高花青素含量的遺傳機理已有一定的解析。紫色象草葉片中花青素合成基因表達水平較綠色葉片的矮象草顯著上調，多個調控花青素合成的轉錄因子的序列具有多態性，其表達水平與矮象草差異顯著[24]，這些重要基因的多態性及差異表達可能是導致紫色象草葉片花青素高積累的重要原因。

3.2 紫色象草和矮象草葉表面附生細菌群落存在差異

植物的次生代謝物可影響其葉際微生物群落結構[15-18]。為探究不同花青素含量植物葉際微生物群落的差異性，本研究選取2 個不同花青素含量的象草品種（紫色象草和綠色葉片的矮象草），通過對2 個品種葉際細菌進行α 多樣性分析、β多樣性分析、OTU 相對豐度分析以及細菌群落組成分析，比較紫色象草和矮象草葉際細菌結構。2種象草葉際細菌高通量測序結果表明，紫色象草與矮象草葉際細菌群落的優勢菌門及其相對豐度均存在差異。PCoA 分析、樣本聚類分析以及PERMANOVA 分析結果表明，紫色象草和矮象草表面的附生細菌群落出現顯著分離，提示葉片表面附生細菌群落可能與花青素含量及種類相關。此外，花青素可改變葉片對光的吸收[39]。因此，推測紫色象草葉片中的花青素可能通過影響葉片中光線的透過率，改變葉片背部的光線強度，進而影響葉面附生細菌的群落結構。

3.3 紫色象草葉片表面甲基桿菌和異常球菌富集

本研究在葉片附生細菌中發現3 個OTUs 的相對豐度差異顯著，這些OTUs 分別來自甲基桿菌屬（Methylobacterium）、異常球菌屬（Deinococcus）和Unclassified_Methylobacteriaceae，其中甲基桿菌屬從屬于甲基桿菌科。研究發現，紫色象草葉表面甲基桿菌屬的相對豐度較矮象草顯著提升，進一步分析發現，甲基桿菌屬的相對豐度與花青素含量呈正相關。研究表明，根際和葉際的甲基桿菌可以提高作物的產量、增強植物的抗逆性[40-41]。紫色象草適應性強，產草量高[26]，其葉表面附生的甲基桿菌相對豐度的增加，可能促進紫色象草的生長，進一步提高紫色象草的產量和抗逆性，這也為植物與葉際微生物的相互作用提供一定的證據。異常球菌屬具有抗輻射、抗氧化等特性[42]。已有研究報道，銀杏葉片中異常球菌屬的相對豐度與葉片中類黃酮物質的濃度具有正相關效應，體外培養異常球菌屬細菌時添加黃酮類化合物可提高其增殖速度[17]。異常球菌屬的細菌具有蔗糖-4-葡糖基轉移酶（amylosucrase），以槲皮素（quercetin，一種黃酮類化合物）為底物，可以生成多種槲皮素糖苷（quercetin glucosides），提示異常球菌屬細菌可有效利用黃酮類化合物[43]。本研究中，異常球菌屬的相對豐度在富含花青素的紫色象草葉片表面上更高，表明其相對豐度與花青素濃度相關，為黃酮類化合物促進異常球菌屬細菌增殖提供了新證據。

3.4 花青素對微生物與宿主相互關系的影響

研究表明，與綠色象草相比，使用高花青素含量的紫色象草喂養動物可提高動物的產量[25]。此外，在飼料中添加紅酒多酚物質可改變動物的腸道菌群結構[44]，腸道內菌群結構會影響宿主的健康狀況[45]。本研究發現，葉際細菌群落結構與葉片花青素含量存在聯系，提示多酚物質可能對細菌產生影響，改變其群落結構，為解析紫色象草對動物生長的促進作用提供了新的研究方向。

4 結論

研究表明，紫色象草葉際細菌群落結構與矮象草存在顯著差異，表明象草葉片中的花青素含量和象草葉際細菌群落結構相關。在紫色象草葉片表面，能促進植物生長的甲基桿菌屬以及抗輻射、抗氧化的異常球菌屬的相對豐度更高，表明花青素含量的提升可能促進這類對宿主有積極作用的細菌的生長，進而輔助植物的抗逆反應。本研究從細菌菌落結構的角度解析了象草葉片中的花青素與葉際細菌菌落結構的相關性，為解析紫色象草的優良生產性能及飼用價值提供了新思路。