不同種植區白木香結香前后根際土壤真菌群落結構與理化因子相關性分析

關鍵詞：白木香；根際土壤；真菌多樣性；理化性質；相關性

中圖分類號：S31 文獻標志碼：A

根際土壤微生物與植物生長關系極為密切，其數量和種類對植物養分循環非常重要。一方面，土壤微生物能夠促進植物生長，影響植物根系發育，抑制和減輕植物病蟲害的發生；另一方面，土壤微生物也是陸地生態系統的重要生物驅動力之一[1]，在促進土壤生態平衡發展中發揮重要作用[2]。諸多研究發現，土壤特性、植被類型和土壤微生物有顯著相關性[3-4]，而真菌是土壤微生物的主要成員，是土壤中的分解者，能夠分解土壤中的有機物，提供植物所需要的養分，降解土壤中的植物殘體[5]。部分土壤真菌還可以提高植物的抗逆性，維持植物的正常生長，改善土壤的結構[6]。

白木香[Aquilaria sinensis （Lour.） Spreng.]為熱帶及亞熱帶常綠喬木，是我國珍稀藥用植物也是我國唯一沉香基源植物[7]。白木香是海南省珍貴的鄉土樹種之一，該植物喜光，適宜較濕潤的環境[8-11]。沉香是白木香受傷后形成的含有樹脂的木材，其形成的過程非常復雜。國內外對沉香樹的結香做了很多研究，認為沉香的形成是樹干受到傷害被真菌侵染，真菌的代謝產物使木材薄壁細胞的淀粉粒發生生物化學變化，形成脂類，不斷沉積而形成沉香[12-13]。王東光等[14]檢測20種真菌對白木香樹體揮發油成分的影響結果發現，龍眼焦腐病菌（Lasiodiplodia theobromae）、斑點青霉（Penicillium melengrinum）、青霉病病原菌（P. italicum）、黑綠木霉（Trichoderma atrowiride）、擬康木霉（T. koningiopsis）、腐皮鐮孢（Fusarium solani）、葡萄座腔菌（Botryosphaerianhodina）共7 種真菌菌液處理的白木香樹乙醇浸出物的質量分數超過10%，其他13 種真菌效果不明顯。韓曉敏等[15]采用氣質聯用儀（GC-MS）對可可毛色二孢菌PDA 發酵液進行檢測，發酵液中檢測到茉莉酸類化合物（JAS）并能誘導白木香愈傷產生沉香倍半萜。有國外研究者對沉香樹的結香部位進行分離，發現分離到的真菌種類較多，包括色二孢菌（Diplodia spp.）、曲霉（Aspergillusspp.）、磚紅鐮孢（Fusarium laseritum）、可球二孢菌（Botryodiplodia theobromae）等，并認為它們與沉香的形成有顯著的關系[16-20]。在國內，也有學者[21]分離出黃綠墨耳菌（Melanotus flavolivens）。鄒欣濤等[22]對白木香結香前后內生真菌的多樣性研究發現，在白木香結香過程中，結香后內生真菌種群顯著增加，但優勢種群不明顯，并推測，白木香結香與宿主具共生關系的內生菌也隨之發生動態變化。張苗苗[23]研究發現白木香結香過程中內生真菌可能有復雜的規律性，而不是簡單的線性關系，其結香部位的菌群非常豐富且結構復雜。因此在生態系統的恢復中，真菌群落的變化是一個關鍵性指標。LIU 等[24]基于全球土壤調查的研究表明，關鍵真菌群的多樣性增加了全球范圍內生態系統的穩定性，以及植物生產力對極端干旱事件的抵抗力和恢復力。CHEN 等[25]對土壤真菌和細菌的多樣性進行分析，結果表明土壤真菌在調控植物群落結構和功能中具有重要的作用。

目前，國內外對沉香樹內生真菌多樣性及微生物多樣性的研究報道較多，而關于沉香樹根際土壤真菌研究極少。CHAIYASEN 等[26]對泰國種植地沉香根部及土壤中分布了叢枝菌根（Arbuscular mycorrhiza fungi，AM）真菌群，對其研究后發現該真菌群同時也出現在了珍貴樹種柚木（Tectona grandis L.f.）中。孫靜怡[27]對廣州蟲漏沉香進行分析，結果發現不同生境蟲漏沉香土壤中的真菌分布有顯著差異，跟沉香中倍半萜類化合物與優勢菌種中的青霉屬（Penicillium spp.）菌呈極顯著正相關，色酮類含量與真菌Alpha（α）指數均呈顯著正相關，提示土壤真菌物種越豐富，可能越有利于蟲漏沉香中色酮類成分的形成。NIMNOI 等[28]對沉香樹根際放線菌群落研究表明，放線菌群落與采樣點相對應，表明土壤特征和當地氣候條件是決定沉香樹根際放線菌群落的主要因素。通過上述對土壤微生物真菌群落的研究表明，不同的地理環境對沉香樹的結香質量具有一定的影響，但目前關于不同種植地白木香結香前后根際土壤真菌群落多樣性和理化性質，及其相關性的研究尚無系統全面的論述。

因此，發掘不同產地白木香生長與根際土壤微生物群落結構和土壤理化性狀的差異及相關關系，促進其良好生長，并比較結香前后的差異非常必要。本研究以海南3 個不同種植區的白木香結香前后根際土壤為研究對象，采用高通量測序技術對不同種植區白木香根際土壤真菌群落結構進行分析，并比較不同種植地白木香結香前后根際微生物的差異；測定根際土壤理化指標（pH、有機質、全氮、全磷、有效氮、有效磷、速效鉀），并比較不同種植區之間的差異；將不同種植區的白木香根際土壤微生物與土壤理化指標進行相關性分析，并對比結香前后的差異。本研究將為白木香根際微生物互作、土壤理化性狀、結香、水肥管理等研究提供科學數據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗區概況 3個白木香試驗樣地分別位于海南省海口文山村、臨高東光農場、樂東抱倫農場，均采用微創結香技術造香，采樣點具體概況如表1所示。

1.1.2 根際土壤樣品采集 采用“S”路線采樣方法，在3 個種植區內隨機選取18 棵白木香樹，即每個種植區隨機選取9 棵已結香和9 棵未結香的樹，均采集10～20 cm 范圍內耕作層土壤，將各種植區結香的和未結香土壤樣品分別充分混勻。每3 株土壤樣品混合為1 份，每個處理3 個重復，每個重復隨機采集3 個點，共采集18 份白木香根際土壤，過2 mm 篩后陰干備用，用作土壤理化性質的分析。另外一部分土壤，輕輕抖落附著在根系上的土壤裝入在無菌袋中，采樣記錄后立即放入低溫保溫冰盒，于–80℃低溫冰箱保存，用于土壤真菌群落高通量測序分析。

1.2 方法

1.2.1 土壤理化性質測定 土壤養分含量測定方法參照《土壤農化分析》[29]，其中，采用pH 計（DELTA 320）測定pH；采用重鉻酸鉀容量法測定有機質；采用凱氏定氮法測定全氮；堿解擴散法測定堿解氮；采用高氯酸-硫酸法測定土壤全磷；采用碳酸氫鈉-浸提-鉬銻抗比色法測定有效磷；采用原子吸收分光光度計測定速效鉀。

1.2.2 土壤真菌群落結構的高通量測序 采用十六烷基三甲基溴化銨法（CTAB 法）對各地區白木香根際土壤微生物組樣本進行總DNA 提取，并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 提取質量，同時采用紫外分光光度計對DNA 進行定量分析[30]。PCR 反應體系：12.5 μL Phusion Hot start flex 2XMaster Mix，正反引物2.5 μL，基因組總DNA 50 ng，加入ddH2O 至反應體系為25 μL[31]。PCR 擴增引物為擴增真菌ITS1 區的特異性引物（ITS86F：5′-GTGAATCATCGAATCTTT-GAA-3′）和（ITS4R：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。PCR 反應條件：98 ℃ 40 s，98 ℃ 10 s，54 ℃ 30 s，35 個循環；72 ℃ 10 min。接著進行35 個循環，54 ℃退火30 s，循環結束后72 ℃最終延伸10 min，每個樣本重復3 次，PCR 擴增產物通過2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，采用AMPure XT beads 回收試劑盒。對純化后的PCR 產物使用Agilent Bioanalyzer2100（Agilent， CA， USA）和Illumina（KapaBiosciences， Woburn， MA， USA）的文庫定量試劑盒進行評估，合格的文庫濃度應在2 nmol/L 以上。將合格的樣品上機測序，根據所需測序量按相應比例混合，并經NaOH 變性為單鏈進行上機測序；使用NovaSeq 6000 測序儀進行2×150 bp 的雙端測序，使用的試劑為NovaSeq 6000 SP Reagent Kit（500 cycles）。

1.3 數據處理

使用Cutadapt v1.9 軟件對測序得到的RawReads 進行過濾；使用fqtrim 軟件進行引物序列的識別與去除，得到不包含引物序列的高質量Reads；通過Vsearch v2.3.4 軟件重疊對每個樣品高質量的Reads 進行拼接，得到的拼接序列即CleanReads；基于得到的ASV（feature）特征序列和豐度表格進行alpha 多樣性分析和beta 多樣性分析。采用Excel、DPS 軟件進行數據分析和SPSS 20.0軟件進行多重比較和相關性分析，利用Canoco 5軟件冗余分析研究土壤理化指標，并對真菌群落進行相關性分析。

2 結果與分析

2.1 不同種植區白木香結香前后根際土壤真菌群落結構組成分析

2.1.1 不同種植區白木香結香前后根際土壤真菌OTU 比較通過對18 個土壤樣品進行高通量測序獲得序列經過數據的優化、拼接、過濾和質控后，共獲得優質ITS 序列3 697 288 條，平均每個樣品205 404 條，平均長度約為255 bp。從圖1可知，Rishness 稀釋趨于平緩，表明數據能夠準確反映樣本真菌群落結構的組成。

2.1.2 不同種植區白木香結香前后根際土壤真菌OTU 聚類分析 從圖2 可知，3 個種植區結香和未結香共有54 個OTU。樂東結香和未結香、文山結香和未結香、臨高結香和未結香特有的OTU分別為588、866、198、190、168、392。從高至低依次為：LDWJXgt;LDJXgt;LGWJXgt;WSJXgt;WSWJXgt;LGJX。

2.1.3 不同種植區白木香結香前后根際土壤真菌群落豐度和多樣性差異 通過對3 個種植區白木香結香前后根際土真菌群落的豐富度和多樣性進行分析，得到物種豐度指數（Chaol index）、辛普森指數（Simpson index）、香農-威納多樣性指數（Shannnon-wiener index）、譜系多樣性指數（PD_ whole_tree index），共4 個指數見表2，其中Chao1 指數常用來估計物種總數；辛普森指數和香農-威納多樣性指數用于衡量物種多樣性，指數值越大，說明樣品的物種豐度和多樣性越高。譜系多樣性指數則基于OTU 序列進化樹的系統發育特征，評估多樣性程度，即譜系多樣性。Chao1指數和譜系多樣性指數從高到低順序為：LDWJXgt;LDJXgt;LGWJXgt;WSJXgt;WSWJXgt;LGJX。3個種植區中，辛普森指數和香農-威納多樣性指數從高到低順序為：LDWJXgt;LDJXgt;LGJXgt;LGWJXgt;WSWJXgt;WSJX。以上結果均表明，樂東樣地結香前和結香后的真菌群落多樣性最大，文山樣地白木香根際土壤真菌群落最小。

2.1.4 不同種植區白木香結香前后門和綱水平群落結構分析 通過對不同種植區白木香結香前后土壤真菌群落門和綱水平分析發現，其群落組成和優勢分類單位相對豐度存在差異（圖3）。同一種植區白木香結香前后優勢種群差異不顯著，但是優勢種群豐度存在差異。在門水平上，3 個不同種植區的主要優勢門為子囊菌亞門（Ascomycota45.93%，49.02%）和擔子菌亞門（BasiBasidiomycota4.07%，0.98%）。在綱水平上（圖4），海口文山優勢綱依次為座囊菌綱（Dothideomycetes9.22%，9.05%）、糞殼菌綱（Sordariomycetes4.57%，5.01%）、子囊菌綱（Ascomycetes 1.87%，1.61%）、酵母綱（Saccharomycetes 0.49%，0.64%）、傘菌綱（Agaricomycetes 0.22%，0.11%）、p__Basidiomycota，c_unclassfied（0.17%，0.10%）等。臨高優勢綱依次為糞殼菌綱（Sordariomycetes7.24%，9.57%）、子囊菌綱（Ascomycetes 5.75%，3.28%）、座囊菌綱（Dothideomycetes 3.25%，3.50%）、p__Basidiomycota，c_unclassfied（0.24%，0.13%）、散囊菌綱（Eurotiomycetes 0.09%，0.14%）、酵母綱（Saccharomycetes 0.04%，0.02%）等。樂東優勢綱依次為子囊菌綱（Ascomycetes 6.54%，8.18%）、座囊菌綱（Dothideomycetes 3.84%，5.87%）、糞殼菌綱（Sordariomycetes 2.66%，1.96%）、傘菌綱（ Agaricomycetes 2.00% ， 0.28% ） 、p__Basidiomycota，c_unclassfied（1.36%，0.24%）、散囊菌綱（Eurotiomycetes 0.19%，0.06%）等。

2.1.5 不同種植區白木香結香前后根際土壤優勢真菌屬組成不同種植區白木香結香前后土壤真菌群落組成在屬水平上，其群落組成和優勢分類單位的相對豐度存在差異（圖5），相同種植區優勢群落的相對豐度存在差異。海南文山優勢屬依次為子囊菌屬（p__Ascomycota 9.22%，9.05%）、漆斑菌屬（Myrothecium 4.57%，5.01%）、座囊菌屬（ c__Dothideomycetes 1.87% ， 1.61% ） 、f__Didymellaceae （0.49% ， 0.64% ） 、枝孢屬（Cladosporium 0.22%，0.11%）、小不整球殼屬（Plectosphaerella 0.17%，0.10%）。臨高優勢屬依次為漆斑菌屬（Myrothecium 7.24%，9.57%）、座囊菌屬（c__Dothideomycetes 3.25%，3.50%）、子囊菌屬（p__Ascomycota 5.75%，3.28%）、小不整球殼屬（Plectosphaerella 0.24%，0.13%）、球腔菌屬（f__ Mycosphaerellaceae 0.12%，0.14%）、f__Didymellaceae（0.04%，0.02%）等。樂東優勢屬依次為座囊菌屬（c__Dothideomycetes 6.54%，8.18%） 、子囊菌屬（ p__Ascomycota 3.84%，5.87%）、漆斑菌屬（Myrothecium 2.66%，1.96%）、枝孢屬（Cladosporium 2.00%，0.28%）、小不整球殼屬（Plectosphaerella 1.36%，0.24%）等。

2.1.6 不同種植區真菌的bata 多樣性分析圖 6為PCoA 分析結果，其中PCoA1 和PCoA2 分別為41.44%和34.67%。同一種植區白木香結香前后真菌群差異性不大，但不同種植區間菌群具有顯著性差異；樣地間存在顯著差異，WSJX 和WSWJX，LDJX 和LDWJX，LGJX 和LGWJX 之間距離最近，距離越近說明物種組成結構越接近，表明同一種植區菌群相似性特別高，菌群組成差異小。3 個不同種植區的真菌群落形成了各自獨立的區域，菌群結構存在可區分的差異。

2.2 不同種植區白木香結香前后根際土壤理化性質

對3 個不同種植區的白木香結香前后根際土壤研究發現（表3），3 個采樣點的土壤大量元素含量存在差異。不同種植區之間，臨高種植區全氮、有效氮、有效磷、有機質的含量顯著高于樂東和文山；文山種植區全磷、速效鉀含量最高。樂東種植pH 高于文山和臨高。同一種植區內，樂東樣地結香速效鉀含量高于未結香，文山樣地結香有機質、有效氮含量高于未結香，樂東未結香中的有效磷含量高于結香，同一區域的同一元素含量變化趨勢相似。3 個樣地土壤均為酸性，土壤pH 的范圍為4.12～5.48，由高到低依次為LDJXgt;LDWJXgt;LGJXgt; WSJXgt;LGWJXgt; gt;WSWJX。

2.3 不同種植區白木香土壤理化性質與真菌相關性分析

2.3.1 不同種植區白木香根際土壤真菌豐度、多樣性與土壤理化性質相關性分析 由表4 可知，pH 與香農-威納指數、辛普森指數、物種豐度指數、譜系多樣性呈顯著或極顯著正相關；全磷與香農- 威納指數和辛普森指數呈顯著負相關（Plt;0.05）與物種豐度指數呈極顯著負相關（Plt;0.01）；有效磷與譜系多樣性呈顯著負相關（Plt;0.05）。表明pH、全磷等土壤理化指標對白木香根際土壤主要真菌種群豐度和多樣性的影響比較顯著。

2.3.2 不同種植區白木香根際土壤優勢真菌屬與土壤理化性質相關性分析 對3 個種植區白木香根際土壤理化性質與根際真菌的主要菌門屬進行相關性分析（表5）表明，pH、有機質、堿解氮、全氮、全磷、有效磷含量對根際土壤中主要真菌屬有影響。pH 與子囊菌屬呈顯著正相關；有機質與座囊菌屬呈顯著負相關，與小不整球殼屬、肉座菌屬呈正相關；全氮與座囊菌屬呈負相關，與小不整球殼屬、f__Didymellaceae、糞殼菌屬、肉座菌屬呈正相關；堿解氮與座囊菌屬、球腔菌屬呈負相關，與f__Didymellaceae、糞殼菌屬呈正相關； 全磷與枝孢屬、球腔菌屬呈正相關， 與f__Didymellaceae 呈負相關；有效磷與座囊菌屬呈負相關，與糞殼菌屬呈正相關。

3 討論

3.1 白木香不同種植區根際土壤理化性質差異

通過比較白木香不同種植區之間的土壤理化性質研究發現，不同種植區之間存在顯著差異，而結香前后并無明顯差異。白木香喜歡偏酸性的土壤，3 個種植地pH 均在4.21～5.58，含量從高至低依次為：樂東gt;文山gt;臨高。其中有機質的含量從高至低依次為：臨高gt;樂東gt;文山。臨高種植區全氮、有效氮、有效磷、有機質的含量顯著高于樂東和文山；文山種植區全磷、速效鉀含量最高，顯著高于樂東和臨高樣地。樂東種植區pH、速效鉀高于文山和臨高。王龍仁等[32]探討了人工結香初期營養代謝變化規律，分析了結香前后白木香葉片和土壤中大量元素氮、磷、鉀和微量元素含量變化，結果表明，環境因子與結香關系密切，其中土壤因子交換性鈣、交換性鎂與沉香特征性成分呈不同程度負相關。馬惠芬等[33]對白木香結香質量與環境因子的關系進行了研究，結果表明結香質量相關性較高的因子為pH、交換性鈣和鎂。本次研究表明不同種植地的環境因子對白木香根際土壤理化性質影響較大。

3.2 白木香不同種植區根際土壤真菌群落多樣性差異

本研究中，白木香根際土壤樣品真菌物種組成豐富，不同種植區白木香根際土壤真菌群落組成、分類單元的相對豐度及優勢分類單元受環境條件的影響均存在不同程度差異。在門水平上，擔子菌門（Basidiomycota）和子囊菌門（Ascomyota）為優勢真菌菌群，其中子囊菌門占比為94.95%，擔子菌門為5.05%。潘爭艷等[34]對遼寧省14 種藥用植物根際土壤真菌研究也發現，子囊菌門在藥用植物根際真菌中的種類和豐度較高，說明子囊菌門真菌適應性廣泛，在不同的生境條件下均有分布。也有研究者發現子囊菌門能夠產生大量的分生孢子，無性繁殖能力強，增長迅速，所以在數量上占有明顯的優勢，其次子囊菌門群落主要由腐生菌構成，而腐生菌可以為土壤中的植物提供養分，是土壤養分循環過程中的重要真菌[35]。擔子菌門可與植物共生形成菌根[36]，可增強植株抗性。在屬水平上，3 個種植區優勢屬和豐度之間存在差異，文山優勢屬為子囊菌屬（p__Ascomycota） ， 臨高優勢屬為漆斑菌屬（ Myrothecium），樂東優勢屬為座囊菌屬（c__Dothideomycetes）。

3.3 白木香不同種植區根際土壤理化性質與微生物相關性

本研究結果表明pH、有機質、堿解氮、全氮、全磷、有效磷含量對根際土壤中大多數主要真菌屬有影響。其中，全磷與根際土壤豐富度指數和多樣性指數均呈顯著負相關，這可能是由于磷是微生物細胞結構的重要組成元素，從而導致微生物表現出對磷養分的依賴。CLEVELAND 等[37]在熱帶雨林里也發現土壤磷含量是影響土壤微生物群落結構的主要因子。但?MILAUER[38]認為土壤磷與真菌群落結構或多樣性并無顯著相關性是相互矛盾的，可能與試驗地土壤條件和管理等因素有關，具體因素有待進一步探究。土壤pH 也是影響真菌群落結構組成的重要環境因子，對土壤真菌的生長繁殖具有顯著影響[39]；pH 能夠影響土壤中化合物形態，進而影響土壤微生物對養分的吸收利用，最終影響土壤真菌群落[40]。本研究的6組土樣的pH 在4.0～5.5 之間，呈酸性，pH 與小不整球殼屬呈負相關，與紅耳屬呈正相關。因此，作為植物與土壤的溝通橋梁，真菌群落結構必然會受到植物和土壤環境因子的直接或間接的影響。其中C/N 是影響真菌群落的重要因素。有機質與座囊菌屬呈顯著負相關，與小不整球殼屬、肉座菌屬呈正相關；全氮與座囊菌屬呈負相關，與小不整球殼屬、f__Didymellaceae、糞殼菌屬、肉座菌屬呈正相關；堿解氮與座囊菌屬和球腔菌屬呈負相關，與f__Didymellaceae、糞殼菌屬呈正相關。研究發現，臨高樣地的有機質和氮元素更豐富，從調查也發現，臨高樣地白木香的生長狀況比其他2 個種植地更好，表明C/N 比值可能是影響白木香生長的一個關鍵因素。SRIVASTAVA等[41]研究也發現土壤C/N 比值是影響真菌生長的主要因素，因為真菌的有機底物利用率較高，因此C/N 比值高的土壤更有利于真菌的生長。因此，真菌群落結構作為連接植物和土壤的橋梁，必然受到植物和土壤環境因子的直接或間接影響。

3.4 白木香相同種植地土壤根際土壤理化性質與真菌、微生物差異的影響因素

通過對同一產地白木香結香前后研究發現，同一區域的土壤元素含量和真菌群落的變化趨勢相似，表現出同增或同減的趨勢，但在屬水平上，結香后樣品在屬水平上分類單位的相對豐度均小于未結香，推測在結香過程中樹木受到了一定的創傷和激素的影響，降低了其土壤真菌的多樣性與豐富度；有研究表明，植物受到傷害后病原菌大量積累，有益菌群數量逐漸降低，最終導致群落整體水平降低[42]。宋杰等[43]的研究結果發現，不同生境條件下，相同品種結香部位真菌群落結構存在顯著差異，而相同生境條件下，同種白木香結香部位非常相似，表明不同環境因子會對真菌群落造成一定的影響。王冉等[44]對我國野生土沉香的4 個分布區（海南屯昌、廣東陸河、廣東東莞、海南臨高）的土壤特性及營養進行分析，結果表明，不同種植區的同一土層土壤理化性質有顯著差異（Plt;0.05），而相同種植區之間土壤差異不大。