蚯蚓糞與貝萊斯芽孢桿菌混合改良對土壤微生物群落結構的影響

摘" 要： 利用蚯蚓糞和貝萊斯芽孢桿菌對辰山植物園的粉砂質壤土進行了改良，結果顯示：與單獨施加蚯蚓糞相比，蚯蚓糞與貝萊斯芽孢桿菌的混合處理可以更好地提高土壤酶活性及微生物量. 特別要注意的是：在土壤的微生物群落菌種數量，以及群落的多樣性、豐富度、均勻度上，混合處理都優于兩者的單獨處理，分別提升了5.35%與13.81%，1.02%與2.35%，2.48%與16.68%，25.22%與11.99%. 實驗結果也表明：混合改良處理有利于土壤優勢菌群的形成，可以對抗相對較弱的病原菌種群，破壞或削弱病原菌，從而減少或避免作物病害. 這些研究結果為進一步探究微生物群落結構的變化對土壤肥力的影響，利用生物方法改良城市綠地土壤提供了借鑒.

關鍵詞： 蚯蚓糞； 貝萊斯芽孢桿菌； 土壤微生物； 群落結構； 生態保護

中圖分類號： Q 93""" 文獻標志碼： A""" 文章編號： 1000-5137（2024）03-0362-09

Effects of amendments vermicompost and Bacillus velezensis on soil microbial community structure

YANG Ning， HAMIGULI TUERXUNJIANG， XU Zhaofeng， XIAO Ming*

（College of Life Sciences， Shanghai Normal University， Shanghai 200234， China）

Abstract： In this paper， we improved the silty loam of Chenshan Botanical Garden with vermicompost and Bacillus velezensis. The results showed that， compared with the application of vermicompost alone， the mixed treatment of vermicompost and Bacillus velezensis could improve soil enzyme activity and microbial biomass better. In particular， the combination of vermicompost and Bacillus velezensis improved the soil microbial community more significantly. In terms of the number of bacteria and the diversity， richness and evenness of the community， the mixed treatment was superior to the two single treatments， which increased by 5.35% and 13.81%， 1.02% and 2.35%， 2.48% and 16.68%， 25.22% and 11.99%， respectively. The experimental results also show that the mixed improvement is conducive to the formation of soil beneficial microbial community， and the formation of soil dominant bacterial community can fight against relatively weak pathogen population， destroy or weaken the pathogen， so as to reduce or avoid crop diseases. These results are useful for further exploring the effects of changes in microbial community structure on soil fertility， and provide a reference for improving urban green soil by biological methods.

Key words： vermicompost； Bacillus velezensis； soil microorganism； community structure； ecological protection

0" 引 言

蚯蚓糞是蚯蚓將垃圾、秸稈等有機物質消化，和土壤混合后排泄出的天然肥料. 已有的研究結果表明，蚯蚓糞在養分供應和改善土壤理化性質等方面具有巨大優勢?［1］. 貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）是一類產芽孢的革蘭氏陽性細菌，能在土壤中定殖，具有提高土壤生物活性的能力?［1］，還有抗菌譜廣、抗逆性強等優點，能有效抑制多種植物病原菌. 據報道，貝萊斯芽孢桿菌符合添加劑授權條件?［2］. 研究發現，貝萊斯芽孢桿菌作為飼料添加劑時，能改善動物機體內的腸道微生物菌群結構，該特征是其環境安全的重要保障. 在農業中使用生物肥料和生物農藥不僅能促進植物生長，相比化學肥料，更有助于環境可持續性發展. 土壤微生物在促進土壤質量和植物健康方面發揮著重要的作用， 其群落結構和組成的多樣性及其變化在一定程度上反映了土壤質量.

目前，蚯蚓糞有機肥的研究多集中于提升作物產量與品質等方面，有關蚯蚓糞與根際微生物改良對土壤微生物的影響還鮮有報道. 本研究以典型城市土壤——上海辰山植物園土壤為代表，嘗試對蚯蚓糞和微生物改良后的土壤微生物群落進行分析，試圖為城市土壤質量的提升提供參考.

1" 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗樣地

在上海辰山植物園綜合樓前坡地上選取土壤肥力均勻、坡度一致的12個樣地，各樣地的面積約1 m2， 經測定知其土壤質地為粉砂質壤土，0～20 cm表層土中可培養細菌生物濃度為9.12×104 CFU?mL-1，可培養真菌生物濃度為3.86×103 CFU?mL-1，其余樣地生物活性與物理性質如表1所示.

1.1.2 供試菌株

貝萊斯芽孢桿菌S3-1（Bacillus velezensis strain S3-1），由上海師范大學微生物與分子生物學實驗室進行分離和純化，并保藏于中國工業微生物菌種保藏管理中心（CICC），編號為CICC：23921.

1.1.3 實驗用蚯蚓糞

蚯蚓糞選自于上海溫興生物工程有限公司，其中，有機質的質量分數大于等于40%，總養分（N，P2O5，K2O）質量分數大于等于6%，施用量為1 kg?m-2. 蚯蚓糞生物活性與物理性質如表1所示.

1.2 實驗設計

設置4個處理組， 包括單獨施用根際促生菌（BS）、單獨施用蚯蚓糞（BW）、蚯蚓糞與根際促生菌聯合施用（SW）、不施用根際促生菌與蚯蚓糞（CK）. 每隔30 d進行一次加樣、采樣處理，共處理90 d.

采用五點采樣法，分別在每個處理樣地中采集深度為10～25 cm的表層土，混合均勻. 在每次采樣后進行施肥處理， BW組單獨施加蚯蚓糞至其質量濃度為1 kg?m-2；SW組按照1 kg?m-2質量濃度的蚯蚓糞，以及5 L生物量濃度為1.190 2×107 CFU?mL-1的S3-1稀釋菌液進行處理；BS組單獨施加5 L生物量濃度為1.785×107 CFU?mL-1的S3-1稀釋菌液. 實驗樣品分別為第0天、第30天、第60天、第90天采集的土壤樣本，并進行土壤微生物量及土壤酶活性的測定. 實驗重復3次.

將第90天采得的土壤樣本取出一部分先過孔徑2.0 mm的篩，-80 ℃進行保存，用于土壤的高通量測序，相應土壤微生物擴增引物如表2所示.

1.3 實驗方法

1.3.1 土壤生物及理化性質

采用LB培養基法測定可培養細菌數量；采用孟加拉紅培養基法測定可培養真菌數量；采用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法測定土壤脲酶活性；采用3，5-二硝基水楊酸比色法測定土壤蔗糖酶活性與纖維素酶活性；采用高錳酸鉀滴定法測定過氧化氫酶活性；采用磷酸苯二鈉比色法測定磷酸酶活性；使用pH計測定土壤pH值；使用電導率儀測定土壤EC值. 實驗重復3次.

1.3.2 土壤微生物基因組測定

使用土壤基因組DNA快速抽提試劑盒（生工 Sangon Biotech）提取土壤中微生物的DNA，相應PCR擴增引物如表2所示. 利用在線Majorbio云平臺（https：//cloud.majorbio.com/）研究蚯蚓糞或貝萊斯芽孢桿菌的施入對土壤相應變量與微生物之間的關聯度，以及施入時微生物群落的變化情況.

1.4 數據統計分析

采用Excel 2021對所測數據進行統計，利用SPSS軟件進行數據對比分析，計算顯著性與差異性.

2" 結果與討論

2.1 土壤微生物與酶活性的變化

2.1.1 粉砂質壤土土壤微生物數量的變化

由圖1可知：各處理均顯著提高了粉砂質壤土中10～25 cm表層土中細菌和真菌的濃度. 由圖1（a）可知：SW，BS和BW處理組中，土壤細菌濃度逐漸增加，第90天時的增幅分別為194.1%，151.9%，56.8%. 圖1（b）顯示：在增幅變化趨勢上，隨著BS和BW處理時間的延長，土壤中的真菌數量有所增加，第90天時達到最大增幅，分別為20.0%和57.1%；SW處理組第30天即得到最大增幅為45.4%，此后增幅逐步減小. 在對土壤微生物數量的提升效果方面，本次蚯蚓糞與益生菌的聯合作用，比將化肥與解淀粉芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌聯合處理的結果好?［3］. WANG等?［4］的研究發現，長期使用有機肥可提高土壤細菌豐度和生物多樣性.

2.1.2 粉砂質壤土土壤脲酶、蔗糖酶以及過氧化氫酶活性的變化

由圖2可知：各處理均顯著提高了粉砂質壤土脲酶、轉化酶與過氧化氫酶活性. 脲酶是在土壤的氮循環中不可替代的酶之一?［5］. 這種酶可以參與羥基脲、二羥基脲和氨基脲的催化反應?［6］. 如圖2（a）所示，與CK組相比，各處理土壤樣品的脲酶活性都隨著處理時間的延長逐漸升高，其中SW處理組的增幅最大. 如圖2（b）所示，與CK相比，3種處理均可顯著提高粉砂質壤土中的蔗糖酶的活性，其中，SW處理組的增幅最大，在處理90 d后，增幅可達136.8%. 其次為BW處理組，在處理90 d后，增幅為92.67%. 而BS處理組在前期提升效果不顯著，增幅僅為56.00%，但在90 d后最為顯著，可達99.25%. 如圖2（c）所示，與CK相比， BW與BS處理組的過氧化氫酶提升效果較小，增幅僅分別為33.60%～65.16%和20.62%～55.47%，而SW處理組的提升效果最大，增幅達到了61.68%～93.66%，貝萊斯芽孢桿菌配施蚯蚓糞一方面改善了土壤的孔隙結構，有利于土壤團聚體的形成，為各種酶促反應提供了有效載體?［7］；另一方面為土壤微生物生長發育提供了充足能源，大量的根際促生菌可以與植物相互作用，從而對微生物新陳代謝以及根基分泌物的產生起到了正面影響，使得土壤酶活性增高?［8］.

2.1.3 粉砂質壤土土壤磷酸酶活性的變化

磷酸酶普遍存在于生物體、土壤等自然界中. 由圖3可知：3種處理均可顯著提高粉砂質壤土10～25 cm深的表層土中磷酸酶的活性. 由圖3（a）可知：與CK相比，BS，BW，SW處理的土壤酸性磷酸酶活性增幅分別為26.84%～103.53%，41.45%～93.90%，65.26%～127.34%，說明SW處理更有利于土壤酸性磷酸酶活性的提升，其次為BS，BW處理. 由圖3 （b）可知： BS，BW，SW處理均可顯著提高土壤堿性磷酸酶活性，增幅分別為22.84%～105.03%，67.37%～112.77%，105.95%～132.40%，且隨時間的增長，堿性磷酸酶活性增幅越大，而經BW處理后土壤堿性磷酸酶活性的增幅要大于BS組. 磷酸酶中的中性磷酸酶活性最低，由圖3（c）可知：BS，BW，SW處理均可顯著提高土壤中性磷酸酶活性，增幅分別為35.81%～60.03%，65.44%～108.05%，107.51%～152.35%. 隨時間的延長，中性酸酶活性的增長增幅越大，且SW處理更有利于中性磷酸酶活性的提升.

2.2 土壤多樣性分子

2.2.1 土壤微生物的α多樣性分析

由表4可知，土壤微生物群落的α多樣性最高的為SW處理組. 主要原因可能是蚯蚓糞的高孔隙度為施入的S3-1以及其他土壤微生物提供了棲息地，保護它們免受捕食者的侵害，并且高孔隙度意味著增加微生物多樣性的生態位［9］. 高孔隙結構的這一特性，使得蚯蚓糞擁有了更大的相對表面積，增加了蚯蚓糞對土壤養分的物理和化學吸附，使得土壤中的多種營養物質可以很好地被土壤中微生物以及施入的菌株S3-1代謝利用［10］. 其中，對于微生物群落的豐富度，SW處理組的Chao指數及OTU指數高于其他組，其與CK相比分別提高了68.4%與26.8%. 土壤均勻度指數可以很好反映土壤微生物群落中全部微生物的分布狀態. 一般來說，在土壤微生物群落中，均勻度越高，代表著其種類越多，多樣性越大. 相較于CK，BS與BW處理組在豐富度上略有提高，分別為592.5%，519.3%與18.8%、19.2%；而在所有處理組中，微生物群落豐富度最高的為蚯蚓糞和 S3-1混合處理組.

2.2.2 微生物群落間的差異分析（PCA）

眾所周知，在自然棲息地中，所有的物種都無法獨立生存，它們通過物種與物質之間的相互作用形成復雜的結構網絡?［11］. 本文從土壤微生物群落組成入手，對實驗中4個不同處理樣地的土壤樣品進行了如圖4所示的主坐標分析（PCoA），結果顯示，不同處理的樣本群落組成之間有著顯著差異. 造成這種現象的原因可能有2種：一方面是蚯蚓糞中所含的一些物質刺激了貝萊斯芽孢桿菌S3-1的生長發育；另一方面，也有學者發現，向種植作物的土壤中施用一定量有機肥會提高微生物群落的復雜性［12］，因此，蚯蚓糞和S3-1的聯合施入增加了微生物群落的復雜性，從而共同影響了實驗樣地中微生物群落的組成.

2.2.3 微生物群落組成與結構

從土壤微生物群落組成來看，在各處理組中相對豐度最高的5個門為：放線菌門（Actinobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）.

變形菌門（Proteobacteria）的成員在有機質充足的環境中主導著土壤養分的循環［13］. 在BW與BS處理組中，蚯蚓糞的引入帶來了豐富有機質，這些有機質可在有機磷的溶解和土壤固氮中發揮主導作用［14］. 放線菌門（Actinobacteria）的成員適合管理多種碳源，在土壤碳的生物地球化學循環中發揮了重要作用［15］. 這可能是BS，BW，SW三個處理組的指示菌都含有放線菌門的成員的原因. 厚壁菌門（Firmicutes）的一些成員可產生某些抗生素和酶，常用于生物肥料、生產抗生素和乳制品［15］. 厚壁菌門（Firmicutes）中的芽孢桿菌因其具有改善土壤微環境和加速細菌群落的組裝的特點，常被用于制作農業肥料［16］. KALAM等［17］提到，酸桿菌門（Acidobacteria）可參與各種代謝途徑，起著調節生物聚合物的分解、細胞外多糖的分泌，以及植物促生等方面的作用，預計酸桿菌門具有能助于根際生存和競爭性定殖的基因.

除CK外，在BS，BW，SW三個處理中，變形菌門是相對豐度最高的門，其次是放線菌門（圖5）；而在CK中，放線菌門是最有優勢的門，其次是變形菌門. 放線菌門與變形菌門在處理組中的占比為：BW（31.69%、28.56%），SW（26.09%、26.04%），BS（23.87%、23.04%）和CK（14.87%、44.53）. 關于這種變形菌門的相對豐度得到顯著提高，而放線菌門的相對豐度顯著下降的現象，推測可能與微生物代謝產物的分泌，從而促進或抑制其他微生物的生長有關［18］.

2.2.4 微生物群落與土壤變量之間的相關性分析

有研究提出，微生物群落多樣性和豐富性與土壤生態系統養分的循環息息相關?［19］. 由RDA結果（圖6）可知，土壤生物活性與理化性質跟微生物群落呈正相關關系，這表明這些土壤環境因子在構建微生物群落結構中起著重要作用. 這一結果被ZHANG等［20］及GUO等?［21］分別在2016年和2019年證明. 根據Pearson相關性分析（圖7）可知，土壤中脲酶活性、磷酸酶活性等幾個土壤變量與優勢微生物群落呈正相關. 且良好的微生物群落組成能將土壤理化性質（pH值與EC值等）調整到理想標準. 這些優勢微生物組成的群落負責土壤碳的富集與養分循環?［22］.

放線菌門、變形菌門和綠彎菌門與脲酶活性、磷酸酶活性、蔗糖酶活性、EC值呈正相關關系（圖7），這可能與放線菌屬門及變形菌門都參與了土壤有機質分解、氮循環和磷循環有關?［23］. 此外，厚壁菌門在土壤有機質分解中發揮著主導作用，與土壤C，N，P組分的關系較強（圖7），說明厚壁菌門在土壤C，N，P循環中起著不可或缺的作用.

3" 結 論

本文研究了蚯蚓糞與貝萊斯芽孢桿菌及其混合改良處理對土壤微生物群落結構的影響. 進一步驗證了添加一定量的蚯蚓糞可以顯著提高粉砂質壤土的土壤肥力，貝萊斯芽孢桿菌S3-1的添加可擴大這一積極影響. 進一步的研究發現，在菌種數量以及群落的多樣性、豐富度、均勻度上，蚯蚓糞和S3-1混合處理都優于單獨施加蚯蚓糞或S3-1菌液. 因此，添加根際促生菌或蚯蚓糞改善了土壤養分狀況，而施加蚯蚓糞和 S3-1混合處理更有利于土壤有益微生物群體的形成，這些土壤有益菌優勢菌群可以對抗相對較弱的病原菌種群，破壞或削弱病原菌，從而減少或避免作物病害. 本實驗還發現，優勢微生物群落與幾種土壤養分呈正相關關系，合理的微生物群落組成能將土壤理化性質調整到理想標準. 本研究中，蚯蚓糞與芽孢桿菌的混合改良處理，除了增強土壤的生物活性，還能改善土壤微生物的群落結構，增加了有益微生物群體的形成，這使得本研究更深入、廣泛，也更具有實際意義.

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（責任編輯：顧浩然）