肝細胞癌鐵死亡特征基因的ceRNA調控網絡構建及分析

摘要：通過構建肝細胞癌（HCC）鐵死亡特征基因的ceRNA調控網絡，探討特征基因在HCC中的預后價值。篩選差異表達鐵死亡相關基因（DE-FRGs），構建DE-FRGs的預后風險模型。采用生存分析、獨立預后分析、ROC曲線及C指數分析評價模型的準確性。比較高、低風險組間免疫細胞浸潤、腫瘤微環境及免疫治療反應的差異。構建并分析鐵死亡特征基因的ceRNA調控網絡。結果表明：高風險組HCC患者總生存期和無進展生存期顯著低于低風險組；風險評分和腫瘤分期為HCC患者的獨立預后因素；與其他臨床特征相比，預后風險模型具有更好的預測能力；高、低風險組HCC患者在免疫細胞浸潤、腫瘤微環境及免疫治療反應等方面的差異具有統計學意義；ceRNA調控網絡中，SLC7A11的高表達與HCC患者預后不良密切相關。

關鍵詞：

肝細胞癌； 鐵死亡； ceRNA； 預后； 免疫細胞浸潤

中圖分類號： R 735.7文獻標志碼： A"" 文章編號： 1000-5013（2024）06-0746-10

Construction and Analysis of ceRNA Regulatory Network of Ferroptosis Feature Genes in Hepatocellular Carcinoma

ZHU Yaling， FANG Shanshan， LI Yijie， XU Xianxiang， DIAO Yong

（School of Medicine， Huaqiao University， Quanzhou 362021， China）

Abstract： By constructing a ceRNA regulatory network of ferroptosis feature genes in hepatocellular carcinoma （HCC）， the prognostic value of feature genes in HCC was explored. The differential expression of ferroptosis-related genes （DE-FRGs） was screened and a prognostic risk model of DE-FRGs was constructed. The accuracy of the model was evaluated using survival analysis， independent prognostic analysis， ROC curve and C index analysis. The differences of immune cell infiltration， tumor microenvironment and immunotherapy response were compared between high-risk and low-risk groups. The ceRNA regulatory network of ferroptosis feature genes was constructed and analyzed. The results showed that the overall survival and progression free survival of HCC patients in the high-risk group were significantly lower than those of the low-risk group. Risk score and tumor stage were independent prognostic factors for HCC patients. Compared with other clinical features， prognostic risk model had better predictive power. There were significant differences in immune cell infiltration， tumor microenvironment and immunotherapy response between high-risk and low-risk groups. High expression of SLC7A11 in the ceRNA network was closely associated with poor prognosis in HCC patients.

Keywords：hepatocellular carcinoma； ferroptosis； ceRNA； prognosis； immune cell infiltration

肝細胞癌（HCC）是肝臟惡性腫瘤的主要形式，占原發性肝癌病例的75%～85%［1-2］。雖然手術切除、肝移植、介入治療、靶向治療和免疫治療等技術不斷提升，但多數HCC患者被確診時已為晚期，且復發率和轉移率高，導致患者預后較差［3］。臨床上常用TNM分期系統［4］和巴塞羅那臨床分期系統［5］指導 HCC 患者治療和預后預測，但其對患者預后預測的效果非常有限，因此，迫切需要尋找可靠的生物標志物用于HCC早期診斷、治療和預后預測。

鐵死亡是一種鐵依賴性的調節性細胞死亡方式，由細胞內鐵離子超載、活性氧積累、脂質過氧化和各種細胞死亡效應器的激活所驅動，最終導致質膜破裂和細胞死亡［6-7］。大量研究表明，鐵死亡與HCC［8］、乳腺癌［9］、卵巢癌［10］等多種癌癥的發展相關。有報道稱，CISD1和TP53基因多態性能抑制HCC細胞鐵死亡，這證明鐵死亡相關基因在HCC進展中發揮作用［11-12］。此外，還有研究發現NRF2、ABHD12和MT1G等鐵死亡相關基因對索拉非尼誘導的HCC細胞鐵死亡具有保護作用［13-15］。近年來，誘導腫瘤細胞鐵死亡已成為一種很有前景的腫瘤治療策略。

競爭性內源RNA（ceRNA）是一種復雜的轉錄后調控機制，涉及lncRNA、miRNA和mRNA等多種分子［16］。lncRNA和mRNA具有相同的miRNA應答元件（MRE），lncRNA可通過競爭性結合MRE間接調節mRNA表達水平和細胞功能［17］。有研究發現，lncRNA NEAT1可通過與miR-362-3p的競爭性結合促進MIOX的表達，從而增強erastin誘導的HCC細胞鐵死亡［18］。CeRNA網絡在HCC細胞鐵死亡過程中發揮重要的調控作用［19］，但其作用機制仍有待進一步完善。本文利用TCGA數據庫篩選HCC患者差異表達鐵死亡相關基因，并基于HCC患者的預后風險模型構建鐵死亡特征基因的ceRNA調控網絡，以期為深入研究HCC鐵死亡調控機制、探索誘導鐵死亡相關治療靶點提供參考。

1 材料與方法

1.1 數據來源

圖1為研究流程。從TCGA數據庫（https：∥portal.gdc.cancer.gov/）下載374例HCC組織樣本和50例正常組織樣本的RNA-Seq轉錄組測序數據及臨床資料。利用Perl軟件整理并提取各樣本的RNA表達矩陣和生存時間、生存狀態、年齡、性別、分級、分期等臨床特征信息，剔除信息不全的樣本。利用GENECODE網站（https：∥www.gencodegenes.org/）下載人類基因注釋GTF文件，對RNA表達矩陣進行注釋，從而區分mRNA和lncRNA。以ferroptosis為關鍵詞，分別在NCBI數據庫（https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/）和GeneCards數據庫（https：∥www.genecards.org/）檢索，得到364個鐵死亡相關基因（FRGs）。

1.2 差異表達鐵死亡相關基因的獲取及富集分析

采用R軟件的edgeR包對HCC組織和正常組織進行差異分析，以|log2 FC|＞1.5，FDR＜0.05（FC為差異倍數，FDR為錯誤發現率）為條件，篩選差異表達基因（DEGs）和差異表達lncRNAs（DElncRNAs）。將DEGs與FRGs取交集，得到差異表達鐵死亡相關基因（DE-FRGs）。利用R軟件clusterProfiler包對DE-FRGs進行基因本體（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，并通過ggplot2包對富集結果進行可視化。當Plt;0.05時，差異具有統計學意義。

1.3 預后風險模型的構建及評價

采用R軟件survival包進行單因素Cox回歸分析（過濾標準為Plt;0.05），篩選與HCC患者預后相關的DE-FRGs。為避免模型過度擬合，使用glmnet包進行最小絕對收縮并選擇算子（LASSO）回歸分析，選取平均交叉驗證誤差最小的λ 值（λ值決定了回歸系數被壓縮的程度，λ值越大，模型系數越?。?。通過多因素Cox回歸分析，構建預后風險模型并計算風險評分，根據風險評分的中位值，將HCC患者分為高風險組和低風險組。采用Kaplan-Meier生存分析評估高、低風險組間的總生存期和無進展生存期的差異。通過對風險評分和患者年齡、性別、分級、分期等臨床特征進行單因素和多因素Cox回歸分析，驗證該模型是否能作為HCC患者的獨立預后因素。使用timeROC包繪制受試者操作特征（ROC）曲線，計算曲線下面積（AUC），AUC值越大，表示模型的準確性越好。運用rms包計算模型的C指數，以評價模型的預測能力。

1.4 腫瘤免疫浸潤分析及免疫治療的評價

使用GSVA、GSEABase包進行ssGSEA富集分析，評估高、低風險組HCC患者間腫瘤免疫細胞浸潤及免疫功能的差異。通過estimate包計算每個腫瘤組織的基質評分、免疫評分、ESTIMATE評分和腫瘤純度，并分析腫瘤微環境在高、低風險組間是否存在差異。采用TIDE算法計算每位患者的TIDE評分，以預測高、低風險組HCC患者對免疫治療的反應。

1.5 鐵死亡特征基因ceRNA調控網絡的構建

將鐵死亡特征基因與DElncRNAs進行Spearman相關性分析，以相關性系數|r|gt;0.3，Plt;0.001為篩選標準，得到鐵死亡相關差異表達lncRNAs（FR-DElncRNAs）。通過miRcode數據庫（http：∥www.mircode.org/）下載高度保守的microRNA家族文件，使用Perl軟件比對獲得FR-DElncRNAs與miRNA相互作用關系。利用TargetScan數據庫（https：∥www.targetscan.org/vert_80/）、miRTarBase數據庫（https：∥mirtarbase.cuhk.edu.cn/～miRTarBase/miRTarBase_2022/php/index.php）和miRDB數據庫（https：∥mirdb.org/）預測 miRNA 調控的mRNA，并與鐵死亡特征基因取交集，得到miRNA與mRNA的關系對。采用Cytoscape軟件構建鐵死亡特征基因的ceRNA調控網絡。

1.6 ceRNA調控網絡中特征基因的分析

首先，利用HCCDB數據庫（http：∥lifeome.net/database/hccdb/home.html）中15個公開的HCC表達數據集驗證特征基因在HCC中的表達情況。采用Kaplan-Meier Plotter數據庫（http：∥kmplot.com/analysis/index.php？p=background）進行生存分析，以評估特征基因的表達與HCC患者生存率之間的相關性。隨后，通過GSEA富集分析，預測特征基因在HCC發生發展中的作用機制。最后，運用TIMER數據庫（https：∥cistrome.shinyapps.io/timer/）可視化特征基因在泛癌中的表達情況，并分析其表達與HCC免疫細胞浸潤的相關性。

2 實驗結果與分析

2.1 差異表達鐵死亡相關基因的獲取

差異表達分析結果，如圖2所示。分析TCGA數據庫中HCC組織和正常組織的轉錄組數據，共得到1 788個DEGs，其中，上調基因1 400個，下調基因388個（圖2（a））；得到DElncRNAs 552個，其中，表達上調463個，表達下調89個（圖2（b））；DEGs與FRGs取交集，得到57個DE-FRGs（圖2（c））。

2.2 DE-FRGs的富集分析

利用R軟件對57個DE-FRGs進行富集分析，如圖3所示。由圖3（a）可知：DE-FRGs主要參與細胞對氧化應激的反應、鐵離子輸運、鐵離子穩態、細胞對活性氧的反應、炎癥反應的調節等生物過程。由圖3（b）可知：DE-FRGs參與調控鐵死亡、IL17信號通路、VEGF信號通路、PPAR信號通路、TNF信號通路等，這些通路在肝癌的發生發展過程中發揮重要作用。

2.3 預后風險模型的構建

構建預后風險模型，結果如圖4所示。圖4中：HR為風險比；95%CI為95%置信區間。通過單因素Cox回歸分析篩選出25個與HCC患者預后相關的DE-FRGs（圖4（a））；經LASSO回歸進一步分析得到7個與HCC患者預后相關的DE-FRGs（圖4（b），（c））；通過多因素Cox回歸分析，得到5個用于構建預后風險模型的DE-FRGs，其中，SOCS2為HCC患者預后的保護因素，EZH2，SLC7A11，NQO1，MYCN為HCC患者預后的風險因素（圖4（d））。

基于這5個DE-FRGs構建預后風險模型的風險評分方程，即風險評分=0.422×EZH2+0.211×SLC7A11+0.052×NQO1+0.158×MYCN-0.273×SOCS2。以風險評分的中位值（0.971）為界，將HCC患者分為高風險組和低風險組。

2.4 預后風險模型的評價

預后風險模型的評價結果，如圖5所示。圖5中：t為時間。Kaplan-Meier生存分析結果顯示，高風險組HCC患者的總生存期和無進展生存期顯著低于低風險組（Plt;0.001）（圖5（a），（b））。單因素和多因素Cox回歸分析結果顯示，風險評分和分期可作為HCC患者的獨立預后因素（Plt;0.001）（圖5（c），（d））。ROC曲線分析結果顯示，風險模型預測HCC患者1 a，3 a和5 a生存期的AUC值分別為0.802，0.742和0.693（圖5（e））。參與風險模型構建的5個DE-FRGs的AUC值均大于0.740，提示這5個DE-FRGs為HCC鐵死亡特征基因（圖5（g））。與其他臨床特征的AUC值相比，風險評分的AUC值最大（圖5（f）），且C指數分析發現風險評分的敏感性和1-特異性明顯優于其他臨床特征（圖5（h）），表明預后風險模型比其他臨床特征更能準確地預測HCC患者的預后情況。

2.5 腫瘤免疫細胞浸潤及免疫治療反應分析

高、低風險組患者腫瘤免疫細胞浸潤及免疫治療反應分析，如圖6所示。圖6中：“*”表示Plt;0.05；“**”表示Plt;0.01；“***”表示Plt;0.001。通過ssGSEA免疫細胞浸潤分析發現，與低風險組患者相比，高風險組患者B細胞、肥大細胞、中性粒細胞等細胞的比例較低，而活化的樹突狀細胞的比例較高（Plt;0.05）（圖6（a））。免疫功能方面，高風險組患者細胞溶解活性、Ⅰ型干擾素應答、Ⅱ型干擾素應答顯著降低（Plt;0.05）（圖6（b）），說明高風險組患者存在免疫抑制的狀態。腫瘤微環境差異分析顯示，高風險組具有較低的基質評分和ESTIMATE評分（Plt;0.05）（圖6（c）），且腫瘤純度較高（Plt;0.05）（圖6（d））。此外，TIDE算法結果顯示，高風險組TIDE評分顯著低于低風險組（Plt;0.05）（圖6（e）），說明高風險組患者對免疫治療的反應更好。以上結果提示，高風險組HCC患者腫瘤免疫抑制程度較高，對免疫治療更敏感，有望從免疫治療中獲益。

2.6 鐵死亡特征基因ceRNA調控網絡的構建

經Spearman 相關性分析得到50個FR-DElncRNA，其中46個表達上調，4個表達下調（圖7（a） ）。借助miRcode數據庫比對得到183個miRNA，再經TargetScan，miRTarBase，miRDB數據庫共同預測得到1 786個mRNA，將mRNA與構建風險模型的5個鐵死亡特征基因取交集得到1個交集基因SLC7A11。根據分析得到的lncRNA-miRNA關系對和miRNA-mRNA關系對構建ceRNA調控網絡（圖7（b）），網絡中SLC7A11為特征基因，潛在競爭性結合的miRNA 為hsa-miR-363-3p，hsa-miR-142-3p，hsa-miR-27a-3p，競爭性的FR-DElncRNA有RUSC1-AS1，CRNDE，HOTTIP。

2.7 ceRNA調控網絡中特征基因的分析

SLC7A11在HCCDB數據集中的差異表達分析，如表1所示。CeRNA調控網絡的特征基因SLC7A11在HCCDB數據庫的11個肝癌與癌旁組織數據集中表達量均顯著升高（Plt;0.05）。CeRNA調控網絡中特征基因的分析，如圖8所示。表1，圖8中：n為樣本數量。

SLC7A11在BRCA，CHOL，COAD，UCEC等20多種腫瘤組織中的表達量均顯著升高（Plt;0.05）（圖8（a）），說明高表達SLC7A11與多種腫瘤的發生發展密切相關。通過Kaplan-Meier生存分析發現，SLC7A11高表達能顯著降低患者生存率（Plt;0.05），是預后相關的風險因素，該結果與前面的分析結果一致（圖8（b））。GSEA 富集分析結果發現，活化的SLC7A11在抗原加工與提呈、壞死性凋亡、鐵死亡等通路中顯著富集（Plt;0.05）（圖8（c））。免疫細胞浸潤結果顯示，SLC7A11在HCC中的表達水平與B細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和樹突細胞的浸潤水平顯著正相關（Plt;0.05），提示SLC7A11在調節HCC免疫細胞浸潤過程中起重要作用（圖8（d））。

3 討論

細胞內鐵代謝失衡和活性氧積累導致的脂質過氧化是參與鐵死亡過程的主要因素，并受到多個基因的調控［20］。隨著鐵死亡研究的不斷深入，越來越多的鐵死亡相關基因作為鐵死亡相關途徑的介質參與HCC的進展［21］。因此，探索HCC中鐵死亡相關基因的調控機制，對于尋找更有效的HCC治療靶點、改善HCC患者預后具有重要意義。

利用TCGA數據庫分析得到57個DE-FRGs，經LASSO-Cox回歸分析篩選出5個DE-FRGs用于構建預后風險模型，包括SOCS2，EZH2，SLC7A11，NQO1和MYCN。SOCS2表達異常參與了HCC的發生、發展、轉移和預后［22］。有研究證實，高表達的SOCS2是預測HCC放射敏感性的生物標志物之一，其可通過促進SLC7A11的泛素化降解，進一步誘導鐵死亡，提示靶向SOCS2可提高HCC放療的效率，改善患者的預后［23］。EZH2的過表達促進了HCC的發生、進展和轉移［24］。研究發現，EZH2通過表觀遺傳沉默P21、染色質解旋酶DNA結合蛋白5、Cdkn2a等多種腫瘤抑制基因，促進肝癌細胞的增殖和轉移［25］。SLC7A11作為Xc系統的關鍵氨基酸轉運蛋白，參與胱氨酸的胞外攝取，促進主要抗氧化劑谷胱甘肽的合成，保護細胞免受氧化應激的損傷［26］。大量實驗證明，SLC7A11的高表達與多種腫瘤的生長、侵襲、轉移及不良預后密切相關［27］。有研究發現，circ0097009直接結合并阻斷miR-1261，從而誘導SLC7A11表達上調和鐵死亡抑制，最終導致HCC細胞增殖和侵襲［28］。NQO1高表達與腫瘤轉移、血管生成和預后不良相關。HCC細胞中高表達的NQO1通過激活PI3K/AKT和MAPK/ERK信號通路促進HCC細胞增殖并介導腫瘤生長［29］。MYCN是HCC復發的生物標志物，也是肝癌治療的重要靶點［30］。MYCN基因的敲除可抑制HCC細胞的增殖和侵襲［31］。利用生存分析和ROC曲線分析對預后風險模型進行評價，結果顯示，構建的風險模型可較準確地評估HCC患者的預后情況，具有良好的預測能力，可作為HCC患者預后風險評估的有力工具。此外，高、低風險組HCC患者在腫瘤免疫細胞浸潤、免疫功能、腫瘤微環境及免疫治療反應方面的差異均具有統計學意義，說明風險模型能較準確地反映HCC患者的免疫狀態，在HCC患者免疫治療方法的選擇中具有一定的參考價值。

構建了1個由3個FR-DElncRNAs、3個miRNA和1個DE-FRGs組成的ceRNA調控網絡，網絡中差異表達上調的RUSC1-AS1，CRNDE和HOTTIP通過競爭性結合hsa-miR-363-3p，hsa-miR-142-3p和hsa-miR-27a-3p調節SLC7A11的表達。有報道稱，過表達的RUSC1-AS1可通過調節miR-340-5p/CREB1誘導HCC細胞的增殖、侵襲和遷移，從而促進HCC的進展［32］。CRNDE通過吸附miR-539-5p促進POU2F1的表達，從而促進HCC細胞增殖和轉移［33］。HOTTIP作為一種預后標志物，可促進肝癌和胰腺癌等腫瘤發生和發展［34］。然而，上述lncRNAs競爭性結合miRNA調節SLC7A11表達進而影響HCC細胞鐵死亡的研究鮮有報道。因此，文中構建的ceRNA調控網絡有望為HCC細胞鐵死亡機制的研究提供新思路。此外，研究還利用外部數據庫進一步驗證了SLC7A11在泛癌、生存及免疫細胞浸潤方面的作用，說明SLC7A11可作為HCC治療和預后評估的可靠靶點。

綜上所述，研究成功構建了基于鐵死亡特征基因的預后風險模型和ceRNA調控網絡，為深入研究鐵死亡相關基因在肝細胞癌中的作用機制提供參考。由于研究是基于TCGA數據庫進行的回顧性分析，仍存在一定的局限性，需進一步在臨床病例中進行驗證。

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（責任編輯： "黃曉楠" 英文審校： 劉源崗）

通信作者： 刁勇（1967-），男，教授，博士，博士生導師，主要從事基因治療藥物的研究。E-mail：diaoyong@hqu.edu.cn。

基金項目： 福建省泉州市高層次人才項目（2022C006R）https：//hdxb.hqu.edu.cn/