秋石斛胚性愈傷組織誘導及再生體系的建立

摘""要：秋石斛（Phalaenopsis-hybrid"Dendrobium）花姿優美、花色豐富，是熱區重要觀賞植物，具有極高的產業價值。本研究以秋石斛雜交種迷你（Den."Yaya"Victoria）、水蜜桃（Den."Swirl）、三亞陽光（Den."Sonia"Hiasakul）原球莖和無菌苗幼嫩莖段為外植體，探討不同植物生長調節劑組合對不同品種秋石斛胚性愈傷誘導、不定芽分化及植株再生的影響。結果表明：在胚性愈傷組織誘導階段，原球莖和生長2個月的幼苗莖段作為外植體誘導效果最佳，暗培養30"d即可獲得胚性愈傷。3個品種的愈傷組織誘導最佳培養基是以MSD（MS+30"g/L葡萄糖+1"g/L花寶1號+8"g/L瓊脂）為基本培養基，添加0.5"mg/L"KT和0.2～0.5"mg/L"2，4-D。迷你、水蜜桃、三亞陽光的胚性愈傷誘導率最高分別為31.11%、22.78%和50%，其中迷你品種僅需15"d即可獲得胚性愈傷。最佳胚性愈傷增殖培養基為MSD+0.5"mg/L"IBA+"0.5"mg/L"KT，胚性愈傷狀態保持良好且不發生分化，增殖倍數0.9。最佳分化培養基為1/2"MS+0.5"mg/L"IBA+0.15"mg/L"KT，在光照條件下，接種后的胚性愈傷組織能夠快速誘導形成芽點，30"d內分化形成2～3片葉的幼苗，相同培養基中保持60"d能夠自行生根獲得完整再生苗。最佳生根培養基為1/2"MS+30"g/L蔗糖+0.5"mg/L"NAA+8"g/L瓊脂，生根率為100%，平均生根數5條，根長約1.3"cm。本研究所使用的胚性愈傷組織誘導、增殖和分化培養基具有一定的廣譜性，可為后續秋石斛胚再生途徑及分子育種研究奠定基礎。

關鍵詞：秋石斛；莖段；胚性愈傷；植株再生中圖分類號：S682.31"""nbsp;""文獻標志碼：A

Establishment"of"Embryogenic"Callusnbsp;Induction"and"Regeneration"System"for"Phalaenopsis-hybrid"Dendrobium

LI"Zhiqing1，2，"LI"Yamei2，3，5*，"LI"Chonghui2，3，"YIN"Junmei2，3，4*

1."School"of"Tropical"Agriculture"and"Forestry，"Hainan"University，"Haikou，"Hainan"570228，"China;"2."Tropical"Crop"Germplasm"Research"Institute，"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences"/"Key"Laboratory"of"Crop"Gene"Resources"and"Germplasm"Enhancement"in"Southern"China，"Ministry"of"Agriculture"amp;"Rural"Affairs"/"Key"Laboratory"of"Tropical"Crops"Germplasm"Resources"Genetic"Improvement"and"Innovation"of"Hainan"Province，"Haikou，"Hainan"571101，"China;"3."Engineering"Technology"Research"Center"of"Tropical"Ornamental"Plant"Germplasm"Innovation"and"Utilization，"Danzhou，"Hainan"571737，"China;"4."Sanya"Research"Institute，"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences，"Sanya，"Hainan"572330，"China;"5."Haikou"Experiment"Station，"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences，"Haikou，"Hainan"571101，"China

Abstract："Phalaenopsis-hybrid"Dendrobium"is"an"important"ornamental"plant"in"tropical"area"and"has"high"market"values，"with"beautiful"flower"appearance"and"abundant"flower"colors."In"this"study，"the"protocorms"and"young"seedling’s"stem"segments"of"commercial"varieties，"Den."Yaya"Victoria，"Den."Swirl"and"Den."Sonia"Hiasakul，"were"used"as"the"explants."The"effects"of"different"phytohormone"combination"on"embryogenic"callus"induction，"adventitious"bud"differentiation"and"plantlet"regeneration"were"investigated."During"the"embryogenic"callus"（EC）"induction"stage，"the"best"induction"explants"were"protocorms"and"2-month-old"seedling"stem"segments"and"EC"could"be"obtained"after"30"days"culture"in"dark"condition."The"best"medium"for"EC"induction"of"was"MSD"（MS+30"g/L"glucose+1"g/L"Hyponex+8"g/L"agar）"as"the"basic"medium"with"0.5"mg/L"KT"and"0.2-0.5"mg/L"2，4-D."The"highest"average"induction"rate"of"EC"was"31.11%，"22.78%，"and"50%"for"Den."Yaya"Victoria，"Den."Swirl"and"Den."Sonia"Hiasakul，"and"the"induction"time"for"Den."Yaya"Victoria"was"only"15"days"from"explants"to"EC."The"best"proliferation"medium"was"MSD+0.5"mg/L"IBA+0.5"mg/L"KT，"which"maintaining"EC"in"good"condition"without"differentiation"and"the"multiplication"rate"was"0.9."The"best"medium"for"differentiation"was"1/2"MS+0.5"mg/L"IBA+0.15"mg/L"KT"under"light"condition"of"16"h"one"day，"EC"quickly"differentiating""and"forming"2-3"leaf"adventitious"buds"within"30"days，"and"finally"regenerating"into"plantlet"after"60"days"in"the"same"medium."The"best"rooting"medium"was"1/2"MS+30"g/L"sugar+0.5"mg/L"NAA+8"g/L"agar，"with"rooting"rate"100%"and"five"roots"in"length"1.3"cm"per"plantlet."In"this"research，"the"EC"induction，"proliferation"and"differentiation"media"have"a"wide-spectrum"and"the"EC"regeneration"pathway"could"lay"a"solid"foundation"for"further"molecular"breeding"of"Phalaenopsis-hybrid"Dendrobium.

Keywords："Phalaenopsis-hybrid"Dendrobium;"stem"segments;"embryogenic"callus;"plant"regeneration

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2024.06.009

秋石斛（Phalaenopsis-type"Dendrobium）花姿優美，形似紛飛的蝴蝶，花色豐富，喜歡在高溫、多濕、陽光充足的熱帶環境中生長和開花，花期長且主要集中在秋冬季，是我國花卉市場常見的盆栽及切花植物。海南省因具有得天獨厚的地理優勢，已發展為我國秋石斛的主產區[1]。近年來，秋石斛盆花在海南的栽種面積逐年擴大，據統計，海南每年出貨量達到500萬盆以上，占廣州該類花卉市場份額的95%以上。目前，我國秋石斛新品種培育主要通過雜交育種和誘變育種實現，而建立高效的胚性愈傷組織再生體系將有利于基因工程育種研究。

秋石斛常用組織培養方法是以種子播種獲得原球莖，再以無菌苗的莖段為外植體，誘導、分化、生根獲得再生植株是進行工廠化育苗的理想手段[2]。此外，以優良株系的莖段、莖尖、葉片、花梗等為外植體，經過消毒處理，誘導類原球莖分化不定芽或誘導叢生芽進行增殖、生根，從而獲得大量組培苗，也為秋石斛種苗繁育提供了技術支持[3-9]。蘭科植物現有的遺傳轉化方法構建主要以類原球莖為外植體，即通過器官發生途徑獲得轉基因植株，由于原球莖已處于分化階段，因此該方法獲得純合轉基因植株相對困難[10-11]，相比之下，胚性愈傷再生途徑遺傳轉化產生的嵌合體較少，廣泛應用于作物基因工程育種[12]。本研究以秋石斛雜交種迷你（Den."Yaya"Victoria）、水蜜桃（Den."Swirl）和三亞陽光（Den."Sonia"Hiasakul）來源的原球莖、無菌幼苗莖段為外植體，通過不同的基本培養基、植物生長調節劑組合測試，進行胚性愈傷誘導、增殖、分化及生根研究，以期建立高效的秋石斛胚性愈傷誘導及胚發生途徑再生體系，為秋石斛多倍體育種、體細胞雜交、突變體和無性系變異株系獲得及轉基因分子育種奠定基礎。

1""材料與方法

1.1""材料

本試驗供試品種迷你、水蜜桃和三亞陽光果莢來源于中國熱帶農業科學院熱帶花卉研究中心種質圃。基本培養基MS（Murashige"and"Skoog）購于國藥集團。植物生長調節劑2，4-D、Kinetin、6-BA、NAA和IBA購于西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司。

1.2""方法

除特殊說明外，本研究所用的秋石斛組織培養基本培養基（MSD）：MS+30"g/L葡萄糖+1"g/L花寶1號+8"g/L瓊脂，pH為5.8～6.0，121"℃高溫條件下滅菌20"min。組織培養條件：溫度25～"28"℃，環境相對濕度70%～80%，光照培養的光周期16"h/d，光照強度100"μmol/（m2·s）。

1.2.1""果莢消毒及無菌苗的獲取""取秋石斛的成熟果莢置于無菌組培瓶中，2%"NaClO3消毒15"min，無菌水清洗3～5遍；轉入95%乙醇潤洗2～3"s后用酒精燈燒去多余乙醇，重復該步驟2～3次；最后將消毒后的果莢置于無菌平皿中，切開果莢，用無菌手術刀將種子接種至種子培養基（1/2"MS+3"g/L花寶1號+2"g/L蛋白胨+0.5"g/L活性炭+30"g/L蔗糖+8"g/L卡拉膠），1個月后即可獲得原球莖，2～3個月后獲得2～3葉期無菌幼苗。

1.2.2""外植體的選擇""選用迷你、水蜜桃和三亞陽光原球莖（生長1～2個月）、莖段2（2～3葉期，生長2～3個月，有2～3片葉）和莖段1（4～5葉期，生長4～5個月，有4～5片葉）的無菌苗莖段作為外植體進行胚性愈傷組織誘導。

1.2.3""胚性愈傷的誘導""用手術刀劃傷原球莖，無菌苗去除葉片取莖段幼嫩部分橫切，分別置于胚性愈傷誘導培養基CIM1～CIM7（MSD+0.5"mg/L"KT+0.1/0.2/0.3/0.4/0.5/1.0/2.0"mg/L"2，4-D）中暗培養誘導胚性愈傷組織，每個處理接種10皿，每皿9個外植體，30"d后觀察誘導效果并統計胚性愈傷誘導率，篩選出最適宜胚性愈傷誘導的培養基。以上每組實驗最少重復2次，胚性愈傷誘導率=（誘導出胚性愈傷外植體數/接種外植體數）×100%。

1.2.4""胚性愈傷增殖""將誘導獲得的胚性愈傷挑出，去除芽和多余組織，轉入胚性愈傷增殖培養基P1、P2、P3、P4中暗培養，30"d為1個繼代周期，統計胚性愈傷增殖量并觀察是否發生分化。胚性愈傷增殖倍數=培養30"d后每皿胚性愈傷的體積/接種時胚性愈傷體積。胚性愈傷增殖培養基分別為P1：MSD+0.1"mg/L"2，4-D+0.5"mg/L"KT；P2：MSD+0.1"mg/L"2，4-D+0.1"mg/L"KT；P3：MSD+"0.5"mg/L"IBA+0.15"mg/L"KT；P4：MSD+0.5"mg/L"IBA+0.5"mg/L"KT。

1.2.5""胚性愈傷分化及植株再生""挑取嫩黃致密、生長狀態一致的胚性愈傷轉入如下F1和F2分化培養基中，30"d后觀察胚性愈傷分化情況并統計分化率，60"d后統計植株再生數。分化率=（分化出不定芽胚性愈傷數/胚性愈傷數）×100%；植株再生數=（再生不定芽胚性愈傷數/胚性愈傷數）。測試用分化培養基分別為F1：1/2"MS+3"mg/L"6-BA+1"mg/L"NAA；F2：1/2"MS+0.5"mg/L"IBA+"0.15"mg/L"KT。

1.2.6""不定芽生根""將生長茁壯、體型良好的不定芽轉入R1和R2生根培養基中進行生根試驗，觀察不同生根培養基對秋石斛不定芽生根率、生根數及根長的影響。待再生植株長至4～5"cm后轉入以苔蘚為基質的培養基中煉苗。測試用生根培養基分別為R1：1/2"MS+30"g/L蔗糖+0.5"mg/L"NAA；R2：1/2"MS+30"g/L蔗糖+0.5"mg/L"NAA+"0.5"mg/L"KT。

1.3""數據處理

試驗數據采用統計學軟件SPSS"25進行顯著性分析。

2""結果與分析

2.1""外植體的選擇對胚性愈傷誘導的影響

以生長無菌苗莖段1為外植體進行胚性愈傷誘導（圖1），一個月后觀察發現，迷你、水蜜桃胚性愈傷組織平均誘導率分別為0.42%和0，且外植體容易誘導出芽，說明生長時間較長的無菌苗莖段不適于作為胚性愈傷誘導的外植體。采用原球莖和無菌苗莖段2為外植體，發現脫分化效果好，胚性愈傷誘導率高，誘導率約30%（表1）。不僅如此，迷你品種從接種到獲得胚性愈傷周期短，培養15"d后即出現胚性愈傷萌動。本研究結果發現，以原球莖和無菌苗莖段2為外植體不僅可以顯著提高胚性愈傷誘導效率，還可以縮短誘導周期。

2.2""植物生長調節劑2，4-D對胚性愈傷誘導的影響

將無菌幼苗莖段2置于不同愈傷組織誘導培養基上，1周內未觀察到胚性愈傷萌動現象，2周內開始出現白色近透明的微小顆粒，一個月內，這些微小顆粒隨著培養基中2，4-D濃度差異而發生不同的變化。在高濃度2，4-D（1、2"mg/L"2，4-D）培養基上，微小顆粒逐漸褐化或變成灰白色，小部分莖段誘導出不定芽，大部分莖段不能誘導出愈傷組織或不定芽，直接褐化或轉化為灰白色。繼續放置60"d后，觀察發現有少量新的愈傷從褐化的莖段上長出，可能是隨著培養時間延長，2，4-D的濃度降低或功能活性減弱，對外植體的毒害作用減少。該研究結果說明，高濃度2，4-D并不適合秋石斛胚性愈傷誘導，外植體容易出現褐化、死亡現象。

在低濃度2，4-D（0.1～0.5"mg/L"2，4-D）培養基上，可以誘導出不定芽、白色或淡黃色的胚性愈傷組織。30"d后觀察統計，結果顯示迷你在CIM2（MSD+0.2"mg/L"2，4-D+0.5"mg/L"Kinetin）培養基中的誘導效果最佳（圖2），胚性愈傷誘導率為31.11%（表2），但0.1"mg/L"2，4-D與0.2"mg/L"2，4-D誘導效果無顯著差異；水蜜桃在CIM3（MSD+"0.3"mg/L"2，4-D+0.5"mg/L"Kinetin）上形成顆粒狀聚集胚性愈傷組織，誘導率最高可以達到22.78%；三亞陽光在CIM5（0.5"mg/L"2，4-D+"0.5"mg/L"Kinetin）培養基中的誘導效果最佳，平均誘導率高達50%，CIM3-5中的平均誘導率均高于30%。以上結果表明，2，4-D濃度范圍在0.1～"0.5"mg/L間均有利于秋石斛胚性愈傷組織誘導。

2.3""不同植物生長調節劑組合對秋石斛胚性愈傷增殖的影響

為進一步增殖并優化胚性愈傷的狀態，將誘導30"d左右的胚性愈傷轉入P1、P2、P3、P4增殖培養基中進行增殖研究。胚性愈傷在4種培養基

中繼代1周時并無明顯生長變化，2周后胚性愈傷開始出現增殖變大，3周后一些胚性愈傷表

面出現芽點，同時愈傷顏色變得更為嫩黃。以三亞陽光為例，胚性愈傷在P4（MSD+0.5"mg/L"IBA+"0.5"mg/L"KT）中繼代獲得的胚性愈傷（ECs）顏

色嫩黃、形態致密，該狀態為胚性愈傷組織較佳狀態；在P1（MSD+0.1"mg/L"2，4-D+0.5"mg/L"KT）中出芽率較高，并伴隨出現胚性愈傷褐化現象（圖3）。從胚性愈傷形態上觀察，IBA與KT生長調節劑組合對秋石斛胚性愈傷的增殖效果雖然一般，但基本能夠保持愈傷不分化。

由表3可知，4種培養基中的胚性愈傷增殖倍數因品種不同有所差異，但整體增殖倍數均不超過1。水蜜桃胚性愈傷在P4培養基中增殖倍數顯著高于P1、P2，可見IBA與KT的組合優于2，4-D與KT；三亞陽光胚性愈傷在4種培養基上的增殖效果差異不顯著，但P4培養基中胚性愈傷的增殖倍數依舊最高。水蜜桃愈傷在P4培養基中增殖倍數顯著高于P1、P2，可見IBA與KT的組合較優于2，4-D與KT。從胚性愈傷不定芽分化情況觀察，3個品種中，IBA與KT植物生長調節劑組合不定芽分化率均顯著低于2，4-D與KT的組合。結果說明生長素IBA（吲哚丁酸）和細胞分裂素Kinetin組合有利于秋石斛胚性愈傷的增殖與保持。

2.4""植物生長調節劑組合對胚性愈傷分化不定芽的影響

研究表明培養基1/2"MS+2.0"mg/L"6-BA+"1.0"mg/L"NAA最有利于秋石斛頂芽和腋芽誘導原球莖，MS+3.0"mg/L"6-BA+1.0"mg/L"NAA適合于原球莖增殖[5]。在此基礎上，本研究將以上2種培養基進行融合改良，以1/2"MS為基本培養基，添加1"g/L花寶1號，采用3.0"mg/L"6-BA與1.0"mg/L"NAA的生長調節劑組合。在進行胚性愈傷增殖過程中發現，0.5"mg/L"IBA與0.15"mg/L"KT的組合，在光照條件下，分化狀態更佳。因此嘗試應用IBA和KT生長調節劑組合進行胚性愈傷分化研究，將嫩黃、致密且狀態一致的胚性愈傷分別接種到F1和F2培養基上，16"h/d光周期條件下比較胚性愈傷分化情況，結果顯示胚性愈傷在F1和F2培養基中均可分化出不定芽（圖4），60"d后即可分化獲得形態完整、翠綠且生根的小苗。胚性愈傷在分化成不定芽的過程中，會先轉變成類原球莖，然后迅速發展成不定芽，促進更多芽點的產生形成叢生芽。由表4可知，3種秋石斛

胚性愈傷在F2培養基上的不定芽再生率均高于F1，平均每團愈傷出苗數多1株，但2種培養基的分化效果無顯著差異。

2.5""植物生長調節劑組合對組培苗生根的影響

生長素NAA和細胞分裂素KT對3種秋石斛不定芽生根的影響進行了研究。30"d后統計發現，單獨使用NAA或NAA與KT組合使用均能使不定芽生根（表5，圖5），平均每株生根數在5根左右，根長約1.3"cm，2種生根培養基生根效果無顯著差異。由此可見，是否添加KT不是影響秋石斛生根的主要因素，而采用0.5"mg/L"NAA作為生根培養基較為合適。

2.6""秋石斛胚性愈傷再生途徑的構建

從迷你品種可以看出，將果莢消毒后接種于苗培養基（圖6A），待原球莖和幼苗形成后，手術刀處理原球莖或去除幼苗葉片與根部取幼莖為外植體（圖6B），放入胚性愈傷誘導培養基，30"d后誘導獲得嫩黃、致密胚性愈傷組織（圖6C）；然后將胚性愈傷切下，轉入繼代培養基中暗培養進行增殖，1～2個月后即可獲得嫩黃、質地均一的胚性愈傷組織（圖6D）；將胚性愈傷轉入分化培養基1個月后分化獲得幼胚（圖6E）；繼續培養2個月后獲得幼苗，或轉入生根培養基（苗培養基）30"d后獲得生長狀態良好胚性愈傷再生植株（圖6F）。因此，建立了一套較為高效的秋石斛胚性愈傷誘導及植株再生方法。

3""討論

3.1""基因型及外植體的選擇是決定胚性愈傷誘導的主要因素

秋石斛胚性愈傷再生體系構建需要綜合評價不同品種基因型、外植體類型和外植體生長階段，篩選出最適宜的品種作為實驗品系。本研究最初選取了5個品種進行胚性愈傷誘導試驗，其中原生種Dendrobium"bigibbum胚性愈傷誘導耗時長，誘導率低；粉紅女孩雜交種自交結實率雖高，但胚性愈傷誘導率低，僅在CIM3培養基中可誘導少量胚性愈傷。因此，這2個品種都不適合作為遺傳轉化研究材料。相比之下，三亞陽光雜交種胚性愈傷誘導、分化效果都非常好，但由于該品種自交不親和性，轉基因性狀無法通過有性繁殖遺傳到下一代；迷你、水蜜桃2個品種則最佳，不僅自交親和，且易于與其他品種雜交，該結果有利于后續轉基因研究中獲得純合株系并將外源基因滲入到其它品系。本研究采用生長2個月的原球莖為外植體，該外植體更為幼嫩，脫分化效果佳，更適合用于胚性愈傷誘導，應用該外植體顯著提高了胚性愈傷的誘導效率。

3.2""不同植物生長素和細胞分裂素的組合使用有利于胚性愈傷誘導及植株再生

生長素2，4-D常作為不同外植體體胚發生的主要誘導劑[13-17]，植物內源生長素IBA的分布對體細胞發生至關重要[18]。本研究胚性愈傷誘導、增殖、體胚分化及再生均為不同生長素和細胞分裂素組合使用。胚性愈傷誘導時植物生長調節劑的最佳配比是0.1～0.5"mg/L"2，4-D組合0.5"mg/L"KT；2，4-D是誘導出胚性愈傷的關鍵因素，這一結論與金青等[19]誘導霍山石斛愈傷組織相似。胚性愈傷增殖繼代時采用0.5"mg/L"IBA組合0.5"mg/L"KT具有較好的增殖與保持效果，所獲得的胚性愈傷嫩黃、致密，生長狀態均一；在分化出芽時將細胞分裂素KT"0.15"mg/L與IBA"0.5"mg/L組合，可以較好的分化獲得不定芽；最后利用0.5"mg/L"NAA實現秋石斛快速生根。不同階段使用不同生長素，也能促進胚性愈傷誘導及胚發生途徑植株再生[20]。

3.3""秋石斛類原球莖與胚性愈傷之間容易相互轉變

理論上，植物任何一部分均可以再生成完整植株，本研究中選用了不同外植體進行胚性愈傷誘導試驗，結果發現在相同植物生長調節劑下，莖段誘導胚性效果最佳，且愈幼嫩的莖段對2，4-D及KT愈敏感。分化過程中，胚性愈傷逐漸轉化為類原球莖[21]，從而形成大量不定芽。因此，在秋石斛中類原球莖與胚性愈傷相互之間是一個極易轉變的過程，這是蘭科植物中普遍存在的現象[22]。研究過程中還發現3種秋石斛胚性愈傷增殖效果一般，容易形成類原球莖，可能是抑制胚性愈傷增殖的主要原因，這一現象與大花蕙蘭黃金小神童胚性愈傷誘導過程相似[23]。

目前，關于石斛蘭胚性愈傷誘導及再生的研究已有許多報道[13-14，"17，"24-25]，但秋石斛胚性愈傷途徑再生的研究幾乎未見報道。常見的石斛蘭遺傳轉化通常以胚性愈傷或原球莖作為外植體[12]。相比原球莖，胚性愈傷作為轉基因外植體則無需經過脫分化，可直接將外源基因轉入干細胞分化為轉基因幼胚，再生形成完整植株，該轉化途徑能有效避免轉基因嵌合體植株產生，是較理想的轉化受體細胞。因此，本研究建立的秋石斛胚性愈傷再生體系將有利于后續秋石斛轉基因分子育種研究。

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