激素對銀杏葉愈傷組織狀態的影響及懸浮培養體系的建立

摘"要：以銀杏葉片為材料，研究生長素萘乙酸（NAA）與2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D），以及細胞分裂素6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）和激動素（KT）的不同組合、不同配比，以及培養基類型對愈傷組織狀態的影響，以此篩選出適合銀杏葉愈傷組織誘導的最佳激素組合和培養基，優良的愈傷組織經繼代培養后，能夠建立銀杏懸浮細胞培養體系.結果表明，NAA和6-BA組合、NAA和KT組合的誘導率均高于2，4-D和6-BA組合、2，4-D和KT組合，且誘導出的愈傷組織狀態較優良；不同激素組合誘導的愈傷組織褐變程度不同，NAA和6-BA組合、NAA和KT組合誘導的愈傷組織不發生褐變，2，4-D和6-BA組合、2，4-D和KT組合誘導的愈傷組織褐變程度較嚴重;NAA和KT組合時，NAA濃度為1.5 mg/L，KT濃度為1.0～1.5 mg/L時，誘導率高，愈傷組織的狀態優良；NAA和6-BA組合時，NAA濃度為1.5 mg/L，6-BA濃度為0.5～1.0 mg/L時，愈傷組織的誘導率高；誘導銀杏葉愈傷組織適合的培養基是N6和MS.結果顯示，NAA與KT、NAA與6-BA這2種激素組合在N6或MS培養基上均能誘導出優良的愈傷組織（疏松、顆粒狀、黃綠色、無褐變與無水漬狀），經繼代培養后，可建立起銀杏懸浮細胞培養體系.

關鍵詞：銀杏葉；愈傷組織；狀態；懸浮培養；褐變

中圖分類號：R284.2

文獻標志碼：A

0"引"言

銀杏葉中含有類黃酮和萜內酯類化合物等多種可藥用的生理活性物質^［1］，具有擴張血管、增加血流量、改善血液循環、降低腦血管阻力、抑制血栓形成及改善腦細胞代謝水平等作用^［2-3］.由于銀杏資源有限，且銀杏葉的生長及其次生代謝產物的含量受到自然環境的影響^［4］，從天然銀杏葉中提取次生代謝產物遠遠不能滿足市場需求.因此，銀杏懸浮細胞培養生產次生代謝產物已經成為近年來發展起來的替代應用新領域^［5-6］，而懸浮細胞培養的關鍵是獲得優良的愈傷組織.

目前，多位研究者從不同方面探索了外植體類型、激素種類和濃度、培養基類型對銀杏愈傷組織誘導難易程度和誘導率的影響.以銀杏植株不同部位為外植體的研究中，劉建軍等^［7］以銀杏葉片、葉柄和莖段誘導愈傷組織時，發現最佳外植體為莖段；王霞霞等^［8］以銀杏葉片、葉柄和樹皮誘導愈傷組織，發現最適合的外植體為葉片；杜希華等^［9］以銀杏胚的不同部位為外植體，發現子葉最易誘導愈傷組織，其最理想的培養基為MS+1.0 mg/L NAA+0.005 mg/L KT.朱紅威等^［1］發現，NAA和KT組合有利于葉片愈傷組織誘導；張威威等^［10］以銀杏嫩葉為外植體，發現MS+2 mg/L NAA+0.1 mg/L KT誘導的愈傷組織效果較好.而以銀杏胚為外植體誘導愈傷組織，朱紅威^［11］和胡選萍等^［12］得出最佳的誘導條件分別為DCR培養基+1.0 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 6-BA+完全黑暗條件和1.0 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L NAA+0.1 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT；秦公偉等^［13］在添加2.0 mg/L NAA和1.0 mg/L 6-BA的MS培養基中，誘導的愈傷組織生長最好；任鵬斌等^［14］采用MS +1.0 mg/L NAA+0.3 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT+2.0 mg/L 2，4-D的組合誘導銀杏葉片愈傷組織效果較佳.在不同培養基誘導銀杏愈傷組織的研究中，崔剛等^［15］發現，MS、WS和White等幾種培養基中，MS培養基誘導銀杏胚愈傷組織的效果最好；王德強等^［16］發現，SH、MS、B5和N6 這4種培養基均可以誘導出銀杏愈傷組織，其中N6和MS培養基誘導率最高，愈傷組織生長最好；楊林^［17］研究結果表明，MS和DCR兩種培養基均適合銀杏幼苗葉片及葉柄愈傷組織的誘導，兩者之間不存在顯著性差異.

然而，迄今卻很少有關于激素（如生長素和細胞分裂素等）對銀杏愈傷組織生長狀態影響的報道.本研究擬以初夏4月和5月份樹齡約20年的銀杏嫩葉為外植體，研究生長素（NAA和2，4-D）與細胞分裂素（6-BA和KT）的不同組合、不同配比及不同培養基類型對銀杏葉片愈傷組織狀態和誘導率的影響.旨在尋求銀杏葉優良愈傷組織的誘導方法，并在此基礎上建立銀杏懸浮細胞培養體系.

1"材料與方法

1.1"材"料

4月和5月份20年樹齡銀杏枝條尖端幼嫩的葉片.

1.2"培養基

以MS、N6、B5和NN為基本培養基（所有培養基中蔗糖濃度均為30 g/L，瓊脂質量濃度為0.7%，pH值為5.8），加入不同配比與不同組合的生長素（NAA和2，4-D）與細胞分裂素（6-BA和KT）.

1.3"葉片的消毒

先將葉片用流水沖洗1 h，剪掉葉柄，移入超凈工作臺，加入體積分數為75%的乙醇浸泡20 s，倒掉乙醇，用滅菌超純水沖洗2次；倒入質量分數為0.2%的升汞溶液消毒10 min，倒掉升汞溶液，用滅菌超純水沖洗5次，最后用無菌濾紙吸干水分.

1.4"接種和培養

將消毒后的葉片放入培養皿中，剪掉葉片邊緣，用滅菌剪刀將葉片剪成5 mm×5 mm的小塊.

用滅菌鑷子夾起剪好的葉片，正面朝上放在相應的培養基上，每個培養瓶中放3片，每個處理接種15瓶，接種完畢后放入光照培養箱中進行培養，控制溫度25 ℃，光照12 h/黑暗12 h，光照強度2 000 lux，定期觀察外植體的變化和愈傷組織的生長狀態.將出現污染的培養瓶及時清理出去.

1.5"愈傷組織誘導情況統計

培養至30 d時，統計愈傷組織的生長情況.出愈率和全愈率的計算公式為，

出愈率=形成愈傷組織的外植體個數/接種的外植體個數×100%（1）

全愈率=完全愈傷化的外植體個數/接種的外植體個數×100%（2）

1.6"愈傷組織的繼代培養

將誘導出的優良愈傷組織切割成5 mm×5 mm的小塊，接種于繼代培養基上，繼代培養基的類型、激素組合和配比，以及培養時的溫度和光照條件均與其初代誘導培養基相同，每隔30 d傳代1次.

1.7"懸浮細胞培養體系的建立

繼代幾次后，選擇生長旺盛及結構疏松的愈傷組織，按照1 g/10 mL的接種量投入裝有30 mL滅菌液體培養基（與初代誘導培養基類型、激素組合和配比均相同）的250 mL三角瓶中，用鑷子處理成愈傷組織碎塊，放入搖床進行震蕩培養，溫度25 ℃，轉速100 r/min.15 d后進行繼代，棄去上清液的2/3，補充等量的新鮮培養基.如此進行2次后，將細胞懸浮培養物用100目的細胞篩過濾，濾液作為起始細胞懸浮培養液，分裝后按照1∶3的體積比補充新鮮培養液，繼續培養，每隔15 d進行繼代.

2"結果與分析

2.1"生長素和細胞分裂素對愈傷組織誘導的影響

將消毒處理好的銀杏葉片，分別接種在不同生長素和細胞分裂素組合的MS培養基中，培養至第7 d時，葉片周圍卷曲，邊緣開始增厚；第10 d時，葉片邊緣開始出現顆粒狀凸起；第18 d時，有明顯的愈傷組織形成；之后隨著培養時間延長，愈傷組織不斷擴大.培養至第30 d時進行統計，結果見表1.

由表1可知，不同組合誘導愈傷組織的出愈率都很高.但從全愈率來看，NK（NAA與KT）組合和NB（NAA與6-BA）組合的出愈率比DK（2，4-D與KT）組合和DB（2，4-D與6-BA）組合高.NB組合中，隨著6-BA濃度的增加，愈傷組織的出愈率逐漸下降，出愈率最高的配比是N_1.5B_0.5；NK、DK和DB組合中，隨著細胞分裂素KT和6-BA濃度的增加，出愈率均呈現先增加后下降的趨勢，誘導率最高的組合分別是N_1.5K_1.5、D_1.5K_1.5和D_1.5B_1.5.

不同生長素和細胞分裂素組合引起愈傷組織的褐變程度不同.NK組合和NB組合誘導的愈傷組織不發生褐變；DK組合和DB組合誘導的愈傷組織褐變程度較嚴重，特別是DK組合誘導的愈傷組織隨KT濃度的增加，褐變程度逐漸加重.這可能是因為2，4-D的生理活性比NAA強，導致細胞分裂生長過快，過早出現老化.

不同生長素和細胞分裂素組合誘導出的愈傷組織顏色和狀態也不同.NB組合和NK組合誘導出的愈傷組織較疏松，顆?；^明顯，無褐變；DK組合和DB組合誘導出的愈傷組織顆?；幻黠@，出現了不同程度的褐化，且DB組合誘導出的愈傷組織還出現了水漬狀，如圖1所示.由于NK組合與NB組合誘導率高，且誘導出的愈傷組織狀態好，后面將繼續對NK組合與NB組合進行優化.

2.2"NAA和KT配比的優化

為了進一步探索NAA和KT組合的最佳配比，將NAA和KT以不同濃度混合，加入MS培養基中，誘導銀杏葉片愈傷組織，30 d后統計誘導情況，結果見表2.當NAA濃度為2.5 mg/L時，全愈率雖然高，但誘導出的愈傷組織基本上都呈現極度松散、無色與水漬狀的狀態，如圖2所示，不能用于繼代培養；NAA濃度為0.5～1.5 mg/L時，誘導的愈傷組織呈現黃綠色與無水漬狀的狀態，可用于繼代培養，其中NAA濃度為1.5 mg/L，KT濃度為1.0～1.5 mg/L時全愈率最高.

2.3"NAA和6-BA配比的優化

將NAA和6-BA以不同濃度混合，加入MS基

本培養基中，誘導銀杏愈傷組織，培養30 d，統計誘導情況，結果見表3.不同配比誘導出的愈傷組織狀態都較優良；當NAA濃度為1.5 mg/L，6-BA濃度為0.5～1.0 mg/L時，全愈率較高；NAA濃度太高或太低，無論6-BA的濃度高或低，全愈率都不高.

2.4"培養基類型對銀杏葉愈傷組織誘導的影響

選用4種具有代表性的培養基，即MS、N6、NN和B5，附加相同的生長素和細胞分裂素（1.5 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA），接種處理好的銀杏葉片，放入光照培養箱中進行培養.在誘導的過程中發現，誘導至第18 d時，MS、N6和B5培養基上外植體已有明顯的愈傷組織形成，NN培養基還未形成愈傷.誘導至30 d的結果見表4和圖3.

從表4和圖3可以看出，在誘導銀杏葉愈傷組織時，適合的培養基是N6和MS；其次為培養基B5，NN培養基誘導的效果最差.

2.5"繼代培養

挑選NB和NK激素組合誘導出的黃綠色、疏松易碎與顆粒狀的愈傷組織進行繼代培養.多次繼代培養后，愈傷組織仍然保持旺盛生長，且狀態優良，如圖4所示.

2.6"細胞懸浮培養體系的建立

將優良的愈傷組織接種在液體培養基中，放入搖床進行培養.第1 d愈傷組織塊為黃綠色；5 d后，接種的愈傷組織小塊變成輕微褐色，培養基仍然是清亮的；10 d后，愈傷組織小塊慢慢膨大、轉綠，培養基開始變渾濁；15 d后，愈傷組織小塊變得更綠，培養基更渾濁.此時開始進行繼代，經3次繼代后，細胞篩過濾懸浮細胞培養液，濾液繼續進行培養，經2次繼代后得到均勻的懸浮細胞系，顏色乳白色.通過顯微鏡觀察，懸浮培養物由單細胞和小細胞團組成，多為圓形細胞，如圖5所示.

3"討"論

愈傷組織的誘導受多種因素的影響，外植體的類型和取材時間不同、植物激素的種類和濃度不同，以及培養基類型不同都會影響愈傷組織的形成.本研究以銀杏嫩葉為外植體誘導愈傷組織，發現 1種生長素和1種細胞分裂素組合時，生長素NAA比2，4-D合適.NAA無論與6-BA組合，還是與KT組合均有利于銀杏葉片愈傷組織的誘導，其誘導出的愈傷組織狀態優良、褐變程度輕、誘導率高，這一結果與朱紅威^［1］、張威威^［10］和秦公偉等^［13］的研究結果相同；而生長素2，4-D與6-BA組合或與KT組合誘導出的愈傷組織狀態差（蓬松水漬狀或致密）、褐變嚴重、誘導率低，這一結果與朱紅威等^［1］的研究結果（以銀杏胚為外植體時，最佳的培養基為DCR培養基+1.0 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 6-BA）不同，這可能與采用了不同的外植體有關（本研究采用的是銀杏嫩葉），說明NAA更有利于誘導葉片愈傷組織，2，4-D更有利于誘導胚性愈傷組織^［10］.本研究也發現，NAA與6-BA或KT組合時，適合的濃度均為1.5 mg/L，這一結果與張威威^［10］和秦公偉等^［13］報道的2.0 mg/L，以及杜希華等^［9］報道的1.0 mg/L的結果是接近的.當NAA濃度過高或過低時，愈傷組織的誘導率或愈傷組織的質量均下降.因此，采用不同的銀杏外植體誘導愈傷組織時，要采取不同的激素組合和激素濃度.

培養基組分對植物細胞生長具有重要的影響，不同植物種類及同一植物的不同外植體對培養基的反應具有顯著差異，選擇最合適的基本培養基是植物體外再生的必要條件.本研究發現，誘導銀杏葉愈傷組織較適合的培養基是N6和MS.N6和MS培養基誘導出的愈傷組織誘導率和誘導量都較高；而B5和NN培養基的誘導率較低，誘導出的愈傷組織都較致密、較小，不適合進行繼代培養.表明基本培養基對銀杏葉愈傷組織誘導具有重要影響.

本研究以銀杏葉片為材料，探討了生長素和細胞分裂素的不同組合、不同配比及培養基類型對愈傷組織誘導的影響，得到了銀杏葉片愈傷組織誘導的條件：適合的激素組合為NAA與KT、NAA與6-BA；這2種激素組合中，NAA適宜的濃度均為1.5 mg/L;NAA與KT組合時，KT適合濃度為1.0～1.5 mg/L；NAA與6-BA 組合時，6-BA適宜濃度為0.5～10 mg/L.這樣的激素組合在N6或MS培養基上均能誘導出優良的愈傷組織（疏松、顆粒狀、黃綠色、無褐變與無水漬狀），經繼代培養后，可建立起銀杏懸浮細胞培養體系.

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（責任編輯：伍利華）

Effect of Hormones on Callus Status of Ginkgo Biloba Leaves and Establishment of Suspension Culture System

LI Lingling

（School of Health，Chongqing Industry and Trade Polytechnic，Chongqing 408000，China）

Abstract：

By using Ginkgo Biloba leaves as materials，the effects of different combinations and proportions of auxin （NAA，2，4-D），cytokinin （6-Ba，KT） and different culture media on callus state were studied so as to screen out the best combination of hormones and culture media suitable for callus induction of Ginkgo Biloba leaves.Excellent suspension cell culture system of Ginkgo Biloba was established after the subculture of fine callus.The results showed that the callus induction rate of NAA and 6-BA combination，NAA and KT combination was higher than that of 2，4-D and 6-BA combination，2，4-D and KT combination.And the induced callus state was better.The browning degree of callus induced by different hormone combinations was different.The callus induced by NAA and 6-BA combination，NAA and KT combination had no browning，and the browning degree of 2，4-D and 6-BAcombination，2，4-D and KT combination was more serious.When NAA and KT was combined，NAA concentration was 1.5 mg/L and KT concentration was 1.0～1.5 mg/L，the induction rate of callus was high and the callus state was excellent.When NAA and 6-BA was combined，and NAA concentration was 1.5 mg/L and 6-BA concentration was 0.5～1.0 mg/L，the callus induction rate was high.The suitable culture medium for inducing Ginkgo Biloba leaves callus were N6 and MS.In conclusion，the suitable combinations of hormones for inducing Ginkgo Biloba callus are NAA and KT，NAA and 6-BA.Excellent callus （loose，granular，yellow-green，no browning，no water stain） can be induced by the combinations on N6 or MS culture medium.After subculture，the suspension cell culture system of Ginkgo Biloba can be established.

Key words：

Ginkgo Biloba;callus;status;suspension culture;browning