龍血樹組織誘導快速繁殖技術研究

摘要要：【目的】探究不同消毒方法和激素配比對龍血樹組培快繁技術的影響，為建立龍血樹組培快繁體系提供參考。【方法】以‘太空’和‘68#’2個龍血樹品種的外植體為試材，探討不同的滅菌時間、激素配比及濃度對龍血樹不定芽誘導、增殖和生根的影響。【結果】研究表明龍血樹無菌材料的獲得，適宜采用帶頂芽莖段，先用75%酒精消毒20 s，再用0.1%升汞溶液消毒8 min，消毒效果最佳。MS + 5.0 mg/L 6-BA + 3.0 g/L 花寶為最佳不定芽誘導培養基；MS + 2.0 mg/L 6-BA + 0.1 mg/L NAA為最佳增殖培養基，太空和68#增殖系數分別達5.35和4.87；MS + 1.0 mg/L NAA為最佳生根培養基，太空和68#的生根率均高于99%，生根數分別達到9.2和11.2條。【結論】建立以帶頂芽莖段為外植體的龍血樹組織培養快繁體系，為龍血樹工廠化生產和遺傳轉化等研究奠定良好基礎。

關鍵詞：龍血樹；植物生長調節劑；組織培養；快速繁殖

中圖分類號：S432" " " " " " " " " " " 文獻標識碼：A" " " " " " " " " " " "文章編號：2095-5774（2024）03-0177-06

Tissue Culture for Rapid Propagation of Dracaena cambodiana

Abstract：【Objective】 The objective of this study is to explore the effects of different disinfection methods and hormone ratios on rapid propagation technology of Dracaena cambodiana tissue culture，and to provide references for establishing a rapid propagation system of D. cambodiana tissue culture. 【Method】 The effects of different sterilization times，plant hormone ratios and concentrations on the induction，proliferation，and rooting of adventitious buds were explored using‘Space’and‘68 #’as materials. 【Result】 The results showed that the aseptic materials could be obtained using the stem with apical bud when it was disinfected by 75% alcohol for 20 seconds and 0.1% mercuric chloride for 8 minutes，achieving the best disinfection effect. The optimal medium for inducing adventitious buds was MS + 5.0 mg/L 6-BA + 3.0 g/L Huabao；the optimal proliferation medium was MS + 2.0 mg/L 6-BA + 0.1 mg/L NAA，and the proliferation coefficients of‘Space’and‘68 #’reached 5.35 and 4.87，respectively；the optimal rooting medium was MS + 1.0 mg/L NAA and the rooting rates of‘Space’and‘68 #’were both above 99%，with rooting numbers of 9.2 and 11.2，respectively. 【Conclusion】 The establishment of tissue culture and rapid propagation system of D. cambodiana with apical bud stem as explants will lay a good foundation for the industrial production and genetic transformation of D. cambodiana.

Key words：Dracaena cambodiana；Plant growth regulator；Tissue culture；Rapid propagation

龍血樹（Dracaena cambodiana）是百合科龍血樹屬常綠灌木至小喬木，原產大西洋的佛得角、摩洛哥、葡萄牙（馬德拉群島）、西班牙（加那利群島），全世界共有150種，我國引種栽培的有5種，分別是劍葉龍血樹、矮龍血樹、長花龍血樹、海南龍血樹、細枝龍血樹，主要分布于海南、廣西、廣東、云南及臺灣等地［1-2］。龍血樹植株挺拔、素雅、樸實、雄偉，富有熱帶風情。龍血樹極耐蔭，小型植株和水養植株適于裝飾書房、臥室等，盆栽長期放于室內仍郁郁蔥蔥，非常適合家庭用盆栽種植；大型植株可布置于庭院、大堂、客廳，在庭院綠化和園林綠化中廣泛應用［3-4］。龍血樹是提煉‘血竭’的原材料，用龍血樹的紅色樹脂加工生產的龍血竭，是一種能活血定痛、化瘀止血、生肌斂瘡的名貴中藥［5］，有“活血之圣藥”的美譽［6］。龍血樹流出的樹脂有特色的香味，可以作為油漆的原料，在古時候也可用來作防腐劑［7］。隨著人們對觀賞和藥用植物種類更高的需求，龍血樹極具商業價值和廣闊的市場發展前景。但是，隨著需求的擴大，以及人們對資源的掠奪性采伐，龍血樹野生資源已瀕危滅絕［8］，現已經被列為國家二級瀕危保護植物［9］。

龍血樹的繁殖方法有播種、壓條、扦插和組培。種子繁殖方法具有快速、簡便、量大的優點，但是用播種繁殖的植株，品種性狀會發生變化，失去原有品種的優良特性，而且由于種子一般通過雜交育種獲得，生產周期較長，結實率也較低，所以生產上龍血樹通常不采用種子繁殖［10］。壓條繁殖操作繁瑣，成苗規格很難統一，成苗時間長，而且受原材料少的因素影響，導致繁殖系數低，不能滿足大規模的生產和科研需要。扦插繁殖具有簡便、經濟、快速、大量的優點，但同樣存在成苗率低的問題［11］。為了克服龍血樹野生資源的貧乏，使野生資源得到有效保護，又為了解決育苗速度慢的問題，近年來，許多學者對龍血樹組培快繁進行了研究［12-14］。龍血樹組織培養技術的成功實施依賴于多種因素的綜合考量，傳統龍血樹組培技術往往存在外植體的處理污染率高、培養基和植物生長調節劑的配比不夠優化等問題。本文選取海南龍血樹新品種作為供試材料，通過不同消毒處理、不同激素配比等研究方法，以期達到降低污染率，提高增殖率和成活率的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料來自泉州市泉美生物科技有限公司，龍血樹品種為‘太空’和‘68#’（圖1），兩個品種均為海南龍血樹選育新品種，選擇植株生長健壯、株型緊湊、無病蟲害的成品苗。

1.2 方法

1.2.1 外植體消毒

選擇母本性狀優良、生長健壯的1年生枝條為外植體，剝去葉片，切成基部莖段、中上部莖段和帶頂芽莖段3種部位材料，長度1～2 cm，用軟毛刷沾肥皂水將枝條表面清洗干凈，反復用自來水沖洗 10 min，接著用75%酒精溶液消毒20 s，再用無菌水沖洗3次，然后用0.1%升汞溶液（加入適量吐溫-80乳化劑）進行消毒，消毒時間分為8、10、12 min，最后使用無菌水沖洗8次，每隔2～3 min換1次，瀝干水分備用。

1.2.2 不定芽誘導培養

將帶頂芽莖段接種到4個誘導培養基（1.0 mg/L

6-BA + 0.2 mg/L 2，4-D，2.0 mg/L 6-BA + 0.2 mg/L NAA，2.0 mg/L 6-BA + 13%椰子汁，5.0 mg/L 6-BA + 3.0 g/L花寶），每個處理接種30 瓶，每瓶接種1個外植體，重復3次，培養 30 d，觀察叢生芽誘導分化情況。

1.2.3 不定芽增殖培養

待誘導的龍血樹叢生芽長至 2～3 cm，分割成單芽，修剪成高約1～2 cm的芽轉接至以MS為基本培養基的繼代增殖培養基上，添加不同激素濃度：6-BA（1.0、2.0、3.0 mg/L）和 NAA（0.1、0.2 mg/L），共設置6個處理，每個處理接種15瓶，每瓶接種1個芽，重復3次。培養 30 d，轉瓶2次后，以芽團統計增殖系數，并觀察記錄再生芽的生長情況。

1.2.4 生根培養

當龍血樹叢生芽長到3～5 cm，分割成單株接種到生根培養基中。生根培養基選用1/2 MS培養基，分別添加不同濃度NAA（0.1、0.5、1.0、2.0 mg/L），附加0.2%蔗糖和0.8%瓊脂。每個處理接種10瓶，每瓶接種2～3個植株，重復3次。培養30 d后統計生根率、生根數。

1.2.5 培養方法

將消毒過的各類莖段，接種于誘導培養基中進行污染率和成活率試驗，將帶頂芽莖段添加了不同的培養基中進行不同激素配比試驗。試驗培養基以MS培養基為基本培養基，添加6%卡拉膠和3%蔗糖，用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH調節培養基pH為5.8左右。培養條件：培養溫度21～23℃，光照強度500～800 lx，光照時間14 h / d。

1.2.6 計算方法

污染率（%）=（污染的外植體數/接種的外植體數）×100%；成活率（%）=（成活的外植體數/接種的外植體數）×100%；不定芽誘導率（%）=（萌芽的外植體數/接種的外植體數）×100%；增殖系數=增殖后的總芽數/接種芽數；生根率（%）=（生根的無菌苗株數/接種的株數）×100%；平均根數=所有植株的總根數/植株數。

1.3 數據分析

試驗數據采用 Microsoft Excel 2021 和 SPSS 26.0 軟件進行處理分析，結果以平均值±標準差的方式表示。

2" 結果與分析

2.1 不同消毒處理對龍血樹外植體消毒效果的影響

表1表明，隨著0.1%升汞溶液消毒時間的增加，外植體污染率和成活率均呈現降低的變化。在莖段部位中，基部莖段在消毒8～12 min的污染率均高于50.0%，且成活率最高為49.0%；帶頂芽莖段的污染率低于1.5%，成活率最高達到68.0%。因此，龍血樹品種不定芽外植體成活率最高的消毒處理為：先用75%酒精消毒20 s，再用0.1%升汞溶液消毒8 min，該處理下外植體生長明顯，污染情況較輕。

2.2 不同激素配比對龍血樹不定芽誘導的影響

由表2可知，在所用4種培養基中，太空和68#的外植體均不同程度地發生膨大，并產生愈傷組織。隨著6-BA濃度增加，外植體產生的愈傷組織顏色逐漸變深，質地變為致密；1.0 mg/L 6-BA時產生白色疏松愈傷組織，2.0 mg/L 6-BA時產生大量淡黃色愈傷組織，5.0 mg/L 6-BA時產生少量愈傷組織。1.0 mg/L 6-BA + 0.2 mg/L 2，4-D處理的愈傷組織誘導時間最短，產生大量白色疏松水漬狀愈傷組織，隨著進一步培養未發現形態的變化，并且外植體顏色逐漸變褐色，進而失去活力。5.0 mg/L 6-BA + 3.0 g/L花寶處理的愈傷組織誘導時間較短，愈傷組織較緊密，芽明顯長高。因此，5.0 mg/L 6-BA + 3.0 g/L花寶是太空和68#愈傷組織誘導的最佳培養基。

2.3 不同激素配比對龍血樹不定芽增殖的影響

由表3可以看出，龍血樹不定芽增殖的能力表現為太空優于68#；隨著6-BA濃度的增加，太空和68#的增殖系數先升高后降低。在相同濃度 6-BA 情況下，增殖倍數隨著 NAA 濃度增加而減小，由此可見低濃度的 NAA 有利于增殖擴繁。

0.1 mg/L NAA時龍血樹不定芽基部產生一定數量小芽，0.2 mg/L NAA時不定芽基部產生愈傷組織。因此，2.0 mg/L 6-BA + 0.1 mg/L NAA最有利于龍血樹的擴繁，太空和68#增殖系數分別達5.35和4.87。

2.4 不同NAA濃度對龍血樹不定芽生根的影響

0.1～2.0 mg/L NAA對龍血樹不定芽的生根率和平均根數均有較好的促進作用（表4）。隨著NAA濃度的增加，生根率和平均根數均表現為先上升后降低的變化；NAA濃度為1.0 mg/L時的生根效果最為理想，太空和68#的生根率均高于99%，平均根數分別達到9.2和11.2條；NAA濃度為0.5 mg/L和2.0 mg/L時，生根率降低，但均高于92%。同時，NAA對不定芽生根影響存在品種間差異，68#的生根率高于太空，而生根數低于太空。太空和68#的生長情況均表現為低濃度NAA不利于不定芽生長，生長速度較慢且植株長勢較弱；高濃度NAA促進不定芽生長，生長速度較快，長勢良好。因此，1.0 mg/L NAA有利于龍血樹不定芽的生根。

3 結論與討論

綜合比較得出，以龍血樹帶頂芽莖段為外植體，75%酒精消毒20 s，再用0.1%升汞溶液消毒8 min

的太空和68#的外植體成活率最高，分別為66.5%和68.0%；MS + 5.0 mg/L 6-BA + 3.0 g/L 花寶為太空和68#的最佳芽誘導培養基，其芽飽滿、長勢好；MS + 2.0 mg/L 6-BA + 0.1 mg/L NAA為太空和68#的最佳增殖培養基，芽粗壯，增殖系數分別達5.35和4.87；MS + 1.0 mg/L NAA為太空和68#的最佳生根培養基，生根率高于99%，平均根數分別為9.2條和11.2條。

本研究發現不同部位的莖段對0.1%升汞溶液的敏感性以及消毒處理的效果不同。帶頂芽莖段由于是新抽嫩莖，且外面有葉片的包裹，病菌、病毒等感染率較低，易于消毒，但是由于新抽嫩莖組織結構較為細嫩，易受升汞的傷害，升汞處理時間不宜太長；基部莖段雖然能耐受較長時間的升汞消毒，但由于材料本身帶菌相對較多，消毒處理后污染率則明顯上升。因此，龍血樹無菌材料的獲得，適宜采用帶頂芽莖段，且0.1%升汞溶液最佳處理時間為8 min。

李克烈等［2］對海南龍血樹的組織培養與快速繁殖的研究表明2，4-D 對海南龍血樹種子形成愈傷組織不如 6-BA 明顯。本研究發現6-BA用量達到5.0 mg/L時對誘導芽萌動處理效果最好，誘導芽萌動添加NAA或2，4-D對愈傷組織形成不夠理想。芽分化及增殖階段，單純地提高6-BA用量不能有效提高增殖效果，此階段添加少量的NAA可以顯著提高增殖系數，試驗表明，添加NAA的量最佳是0.1 mg/L。生根階段則應該把NAA的量控制在1.0 mg/L，能達到較高生根率，又能促進根的生長，而且根數量多且健壯，非常有利于試管苗的出瓶移栽管理。

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