注射用米卡芬凈鈉中雜蛋白檢測方法研究

摘要：目的 建立注射用米卡芬凈鈉中雜蛋白的檢測方法。方法 采用雙抗體夾心ELISA法分別檢測注射用米卡芬凈鈉中α-乳清蛋白（α-LA）和β-乳球蛋白的含量，并對上述兩種檢測方法的線性、定量限和檢測限、專屬性和加標回收率等進行方法學研究。結果 采用α-乳清蛋白檢測試劑盒檢測制劑中的α-乳清蛋白含量，因制劑中活性成分米卡芬凈鈉對檢測有干擾，加標回收率最高僅為11.8%，導致均未檢出。采用AgraQuant? β-乳球蛋白試劑盒檢測制劑中的β-乳球蛋白，方法的線性和專屬性良好，加標回收率在90.9%～114.9%，方法可行。結論 制劑中的β-乳球蛋白建議采用雙抗體夾心ELISA方法進行檢測，本方法準確可靠，但制劑中的α-乳清蛋白含量建議通過輔料乳糖中α-乳清蛋白的含量進行控制。

關鍵詞：注射用米卡芬凈鈉；雜蛋白；α-乳清蛋白；β-乳球蛋白；雙抗體夾心ELISA法

中圖分類號：R978.5" " " " "文獻標志碼：A" " " " "文章編號：1001-8751（2024）04-0284-05

Study on the Detection Methods of Heteroprotein In Micafungin Sodium for Injection

Jin Yang-qiao， Zhao Yan， Gao hua， Li Ze-nan

（Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co. Ltd.， Hangzhou" 311400）

Abstract： Objective To establish a method for the detection of heteroprotein in micafungin sodium for injection.. Methods The double antibody sandwich ELISA method was utilized to detect the contents of alpha-lactalbumin and beta-lactoglobulin in micafungin sodium for injection， respectively. Methodological analysis was conducted to examine the linearity， quantitation and detection limits， specificity， and standard recovery rate of these two heteroprotein detection techniques. Results The alpha-lactalbumin detection kit was used to detect the content of alpha-lactalbumin. As micafingin sodium in the preparation interferes with the detection of alpha-lactalbumin， the added recovery rate of alpha-lactalbumin is only 11.8%， resulting in the non-detection of alpha-lactalbumin in the preparation. The AgraQuant? β-lactoglobulin kit was used to detect beta-lactoglobulin in the preparation， and the method was good in linearity and exclusivity， and the standard recovery rate was 90.9% to 114.9%， which was feasible. Conclusion Beta-lactoglobulin in the formulation is recommended to be detected by the double antibody sandwich ELISA method， which is accurate and reliable， but the content of alpha-lactalbumin in the formulation is recommended to be controlled by controlling the content of alpha-lactalbumin in the excipient lactose.

Key words： micafungin modium for injection; heteroprotein; alpha-lactalbumin; beta-lactoglobulin; double antibody andwhich elisa method

注射用米卡芬凈鈉是由日本安斯泰來公司研制的新型棘白菌素類抗真菌藥物，用于由曲霉菌和念珠菌引起的系列感染：如真菌血癥、呼吸道真菌病和胃腸道真菌病等。2002年10月8日注射用米卡芬凈鈉首次在日本上市（商品名：Mycamine?），并于2005年3月16日、2008年4月25日分別獲得美國食品藥品監督管理局（FDA）、歐盟EMA批準上市。2006年原國家食品藥品監督管理總局（CFDA）批準注射用米卡芬凈鈉（商品名：Mycamine?、米開民?）的進口藥品許可。目前該藥已在多個國家和地區獲準上市，該藥具有較好的抗真菌作用，且安全性和耐受性良好。

原研進口的注射用米卡芬凈鈉（商品名：米開民?，規格50 mg）說明書中明確列明其主要輔料為乳糖。近年來，有報道稱一些以乳糖為輔料的注射制劑在臨床應用中發現存在過敏反應[1-2]，過敏原明確為乳糖中殘留的乳清蛋白。

乳糖來源于動物乳清，因此可能會殘留有微量乳清蛋白[3]，而乳清蛋白主要中含有α-乳清蛋白（α-LA）和β-乳球蛋白。針對注射劑乳糖中雜蛋白含量，Eda等[4]研究表明市售的甲潑尼龍琥珀酸鈉注射劑（40 mg，輝瑞）每瓶含有112.5 ng β-乳球蛋白，并在臨床使用過程中導致了兩例嚴重的過敏反應病例，然而迄今中國藥典和各國藥典均無注射用乳糖檢測標準，也對雜蛋白限度沒有法定要求。截至2023年6月，也尚無文獻報道注射用米卡芬凈鈉乳糖中雜蛋白導致過敏反應的相關研究。為了保證用藥安全，需要嚴格控制注射用米卡芬凈鈉中的α-LA和β-乳球蛋白的含量。因此本文以此為出發點，對比了本實驗自制注射用米卡芬凈鈉和市售原研制劑中雜蛋白含量。因α-LA和β-乳球蛋白限度較低，本文設計采用靈敏度較高的α-LA檢測試劑盒和Agra Quant? β-乳球蛋白試劑盒來分別進行α-LA和β-乳球蛋白含量檢測方法學研究。

1 材料與儀器

酶標儀Spectra Max M5（美國Molecular Devices公司），恒溫箱 MB100-2A（杭州博日科技股份有限公司），純化水（自制）。

注射用米卡芬凈鈉，50 mg（浙江海正藥業有限公司自制3批，批號A、B、C），乳糖（浙江海正藥業有限公司自制1批，批號D），米卡芬凈鈉標準品（浙江海正藥業股份有限公司自制，批號P2001），注射用米卡芬凈鈉（商品名：米開民?、規格50 mg，批號028010、028020），α-LA檢測試劑盒（廠家Cloud-Clone-Corp，批號：L200702337，L200811649），Agra Quant? β-乳球蛋白試劑盒（Beta-Lactoglobulin" ELISA test kit，廠家Agra Quant Romer Labs，批號：100004358）。

2 方法和結果

2.1 檢測原理

2.1.1 α-LA檢測試劑盒原理

將α-LA抗體包被于96孔微板中，制成固相載體，向微孔中分別加入標準品或標本，其中α-LA與連接于固相載體上的抗體結合，然后加入生物素化的α-LA抗體，在將未結合的生物素化抗體洗凈后，加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的親和素，再次徹底洗滌后加入四甲基聯苯胺（TMB）底物顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化為最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的α-LA濃度呈正相關。用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。

2.1.2 Agra Quant? β-乳球蛋白試劑盒原理

Agra Quant? β-乳球蛋白試劑是一種夾心酶聯免疫吸收劑（ELISA）。抗體能物理性吸附于固相載體表面。將樣品或標準品加入到孔中，β-乳球蛋白就會與抗體結合。在沖洗步驟之后，酶結合物與β-乳球蛋白特異性結合的產物殘留在孔壁，并進行培養。在第二次的沖洗之后，加入酶底物，溶液顏色變成藍色。顏色變化的強烈程度與樣品或標準品中β-乳球蛋白的濃度成一定比例。然后再加入終止液，溶液顏色將從藍色變成黃色。將酶標板放在450 nm和630 nm波長的酶標儀中讀取光密度，計算樣品濃度。

2.2 α-LA檢測方法和結果

2.2.1 檢測方法

（1）將100 μL標準品系列溶液（乳糖1.56～50 ng/mL，其他0.39～25 ng/mL）、空白溶液（標準品稀釋液，濃度為0 pg/mL）和樣品溶液加到相應的微孔中，均做2個復孔，覆膜密封，在37 ℃下培養1 h。

（2）棄去孔內液體，每孔加檢測溶液A（生物素化的αLA抗體）工作液100 μL（臨用前配制，檢測稀釋液A稀釋100倍），酶標板覆膜，37 ℃溫育1 h。

（3）棄去孔內液體，每孔加入350 μL已稀釋后的洗滌液（超純水稀釋30倍）洗滌，浸泡1～2 min，在吸水紙上輕拍酶標板來移除孔內所有液體。重復洗板3次。

（4）每孔加檢測溶液B（HRP標記的親和素）工作液100 μL（臨用前配制，檢測稀釋液B稀釋100倍），酶標板覆膜，37 ℃溫育30 min。

（5）棄去孔內液體，甩干，洗板5次，方法步驟等同2.2.1項下（3）。

（6）每孔加TMB底物90 μL，酶標板覆膜，37 ℃避光顯色約20 min。

（7）每孔加終止液50 μL，終止反應，充分混合后，立即用酶標儀在450 nm波長測量各孔的OD值。

2.2.2 標準曲線

取一瓶標準品，加入標準品稀釋液1 mL，蓋好后室溫靜置大約10 min，同時反復顛倒/搓動以助溶解，得到濃度為200 ng/mL的標準品儲備液1。先用適量標準品稀釋液將標準品儲備液1稀釋為50 ng/mL標準品儲備液2后，再準備7個稀釋標準品的EP管，每個EP管中加入400 μL的標準品稀釋液，依次倍比稀釋成25 ng/mL（標準曲線最高濃度），12.5 ng/mL，6.25 ng/mL，3.12 ng/mL，1.56 ng/mL， 0.78 ng/mL，0.39 ng/mL系列標準品溶液。按照試劑盒的操作方法測定，用酶標儀于450 nm波長測量各孔的OD值，以相應濃度為X，光密度值為Y，求得標準曲線，見圖1。線性方程為Y=2.051X2+3.927X+0.430，R2=0.998。結果表明標準檢測液在0.39～25 ng/mL范圍內，濃度與吸光度值具有良好線性關系。

2.2.3 定量限和檢測限

根據試劑盒說明書，檢測限為0.35 ng/mL。根據純化水加標實驗（即α-LA溶液濃度0.39 ng/mL，純化水加溶液中α-LA濃度：0.44 ng/mL，回收率112.8%），確認定量限為0.39 ng/mL。

2.2.4 專屬性和回收率

取乳糖、注射用米卡芬凈鈉適量，精密稱定，分別配制乳糖加α-LA溶液，注射用米卡芬凈鈉加α-LA溶液，照2.2.1項下方法進行檢測。結果見表1。

結果提示，乳糖溶液加標回收率均在86.9%～114.5%，但注射用米卡芬凈鈉溶液加標回收率0.0%～11.8%，回收率較低。為了調查干擾檢測的主要因素，后期采用米卡芬凈鈉標準品和純化水分別配制米卡芬凈鈉標準品加α-LA溶液和純化水加α-LA溶液，照2.2.1項下方法進行檢測，結果純化水的加標回收率在112.8%，但米卡芬凈鈉加標溶液均未檢出α-LA，由此說明活性成分米卡芬凈鈉是干擾注射用米卡芬凈鈉中α-LA檢測的主要因素。此方法專屬性和回收率均不行，方法不適用。

2.3 β-乳球蛋白檢測方法和結果

2.3.1 檢測方法

（1）將100 μL標準品溶液（400 ppb、100 ppb、40 ppb、10 ppb、0 ppb，均為試劑盒自帶）和樣品溶液加到相應的微孔中，均作2個復孔，室溫（25 ℃）溫育20 min。

（2）棄去孔內液體，每孔加入300 μL已稀釋后的（超純水稀釋10倍）洗滌液，浸泡1～2 min，在吸水紙上輕拍酶標板來移除孔內所有液體。重復以上步驟4次，共沖洗5次。

（3）每孔加結合物100 μL，室溫25 ℃溫育20 min。

（4）棄去孔內液體，甩干，洗板5次，方法步驟等同2.3.1項下（2）。

（5）每孔加底物100 μL，避光，室溫25 ℃溫育20 min。

（6）每孔加終止液100 μL，終止反應，10 min內將酶標板放在酶標儀中，選擇450 nm和630 nm波長讀取光密度，記錄每個孔中的OD值。

2.3.2 標準曲線

按照2.3.1檢測方法進行標準品溶液，以標準品濃度為橫坐標，標曲校正值（標準品450 nm處OD值減去630 nm處OD值）為縱坐標，做四參數方程。結果見圖2，線性方程見表2，相關系數R2=1.000。結果表明標準檢測液在0～400 ppb范圍內，濃度與吸光度值具有良好線性關系。

2.3.3 定量限和檢測限

按照試劑盒說明書，定量限為10 ppb。

檢測限：分別設標準孔、樣品孔。在標準孔中依次加入100 μL標準品（400 ppb、100 ppb、40 ppb、10 ppb、0 ppb ），平行兩孔。樣品孔加樣品提取緩沖液，共10孔。按照2.3.1項下方法進行檢測。結果見表3，標準曲線見表2。結果：空白溶液10個復孔的平均OD值為0.053，CV為16.8%，小于20%，符合要求，故檢測限為0.094 ppb。

2.3.4 專屬性和回收率

取注射用米卡芬凈鈉適量，精密稱定，配制不同濃度的注射用米卡芬凈鈉加β-乳球蛋白溶液，照2.3.1項下方法進行檢測。結果見表4。

結果提示，注射用米卡芬凈鈉加標準樣品回收率均在90.0%～114.9%，說明該方法的專屬性和回收率均良好。

2.3.5 樣品檢測

取3批自研和2批參比制劑適量，精密稱定，配制成一定濃度的樣品溶液，平行配制兩份，照2.3.1項下方法進行檢測。結果見表5。

結果提示，浙江海正藥業自制的3批注射用米卡芬凈鈉均未檢出β-乳球蛋白，參比制劑β-乳球蛋白含量約0.891～0.952 ppm。

3 結果與討論

3.1 α-LA含量結果與討論

米卡芬凈鈉干擾注射用米卡芬凈鈉中α-LA含量的檢測，故α-LA檢測試劑盒方法不適用于該制劑中α-LA含量的檢測。但采用此法檢測輔料乳糖中的α-LA含量方法的專屬性、線性和回收率均較好，故制劑中的α-LA含量建議通過控制輔料乳糖中α-LA的含量來進行控制。

3.2 β-乳球蛋白含量結果與討論

本次實驗自制的3批注射用米卡芬凈鈉均未檢出β-乳球蛋白，參比制劑檢出β-乳球蛋白含量約0.891～0.952 ppm。根據FDA已批準的說明書，可知該產品的處方為每瓶含米卡芬凈50 mg（相當于米卡芬凈鈉50.86 mg、乳糖200 mg等）。相關研究表明[4]，112.5 ng/d的β-乳球蛋白攝入量會導致嚴重的過敏反應，本品的每日最大使用量為6瓶，由此可計算出β-乳球蛋白在注射用米卡芬凈鈉中的限值約為0.07 ppm。從理論上分析，控制使用量，在靜脈注射后不會產生由該雜蛋白所產生的過敏反應。

3.3 總結

米卡芬凈鈉等棘白菌素類藥物能抑制細胞壁葡聚糖生物合成，是治療念珠病菌的首選藥物[5-6]，在國內外市場上得到了廣泛的應用。注射用米卡芬凈鈉中α-LA和β-乳球蛋白全部來源于乳糖，研究結果表明采用α-LA試劑盒檢測輔料乳糖的α-LA的方法具有良好的專屬性、靈敏度和回收率，輔料中嚴格控制乳糖中α-LA后，那么制劑中再檢測α-LA的意義不大，況且原料藥米卡芬凈鈉對檢測存在干擾；制劑采用Agra Quant? β-乳球蛋白試劑盒檢測β-乳球蛋白方法具有良好的專屬性、靈敏度和回收率，可直接用于控制制劑中β-乳球蛋白含量。

本研究通過對比研究，表明本次實驗中注射用米卡芬凈鈉中雜蛋白含量較低，對那些乳糖有過敏反應，需使用注射用米卡芬凈鈉的患者，可作為備選制劑，但具體用藥效果還需后續臨床數據證實。由于以乳糖為輔料的注射制劑在臨床使用中會出現過敏反應，建議后續醫藥研究者可更深入研究注射制劑中乳糖中雜蛋白可能引起過敏反應的限量。

參 考 文 獻

張立娜. 藥物中痕量大分子蛋白檢測方法的研究與應用[D]. 石家莊：河北醫科大學，2017.

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陳嘉璐， 金鑫， 伏龍， 等. 注射用替加環素中輔料乳糖雜蛋白研究[J]. 中國處方藥， 2021， 19（10）： 35-37.

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