“PCR擴(kuò)增DNA片段及凝膠電泳鑒定”實(shí)驗(yàn)改進(jìn)與優(yōu)化

摘要：本文通過(guò)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)步驟、精簡(jiǎn)操作環(huán)節(jié)、巧用實(shí)驗(yàn)裝置、可視實(shí)驗(yàn)結(jié)果、創(chuàng)新數(shù)據(jù)分析等對(duì)PCR擴(kuò)增DNA片段及凝膠電泳鑒定實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)改進(jìn)能更好地優(yōu)化課堂教學(xué)結(jié)構(gòu)，幫助學(xué)生建立科學(xué)探究的基本方法，提升實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析能力，從而有效提升學(xué)生的生物學(xué)學(xué)科核心素養(yǎng)。

關(guān)鍵詞：PCR;凝膠電泳；內(nèi)參照；人類SRY基因

文章編號(hào)：1003-7586（2024）02-0062-03 中圖分類號(hào)：G633.91 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

“PCR擴(kuò)增DNA片段及凝膠電泳鑒定”實(shí)驗(yàn)是浙科版普通高中教科書(shū)《生物學(xué)·選擇性必修3·生物技術(shù)與工程》（以下簡(jiǎn)稱“教材”）第4章第1節(jié)內(nèi)容，本實(shí)驗(yàn)是基于學(xué)生對(duì)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)及半保留復(fù)制過(guò)程等模塊知識(shí)的延伸和實(shí)踐應(yīng)用。實(shí)際教學(xué)中常因?qū)嶒?yàn)步驟繁瑣、實(shí)驗(yàn)耗時(shí)長(zhǎng)、對(duì)教師操作要求高等原因，使得實(shí)驗(yàn)“開(kāi)展率”較低。為了突破教學(xué)難點(diǎn)，對(duì)本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行改進(jìn)和優(yōu)化，通過(guò)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)步驟、精簡(jiǎn)操作環(huán)節(jié)、創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)裝置、可視實(shí)驗(yàn)結(jié)果、巧用數(shù)據(jù)分析等，讓學(xué)生更好地體會(huì)生物學(xué)學(xué)科的實(shí)用性，在解決實(shí)際問(wèn)題的過(guò)程中激發(fā)學(xué)生對(duì)生命科學(xué)的熱愛(ài)。

1 教材實(shí)驗(yàn)問(wèn)題

本活動(dòng)包含“PCR擴(kuò)增DNA片段”和“瓊脂糖凝膠電泳與鑒定”兩個(gè)實(shí)驗(yàn)。在實(shí)際操作過(guò)程中存在以下問(wèn)題：實(shí)驗(yàn)耗時(shí)長(zhǎng)，PCR擴(kuò)增、制膠、電泳、染色和脫色等步驟至少需3h；實(shí)驗(yàn)缺少對(duì)照導(dǎo)致結(jié)果不夠嚴(yán)謹(jǐn)；條帶大小判斷較主觀，對(duì)DNA Marker條帶利用不充分；靜置脫色較慢，實(shí)驗(yàn)效率較低；凝膠背景模糊。同時(shí)，教材中實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)的形式呈現(xiàn)，留給學(xué)生主動(dòng)思考和探究的內(nèi)容較少?；谝陨显?，對(duì)本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行改進(jìn)和優(yōu)化，以提升實(shí)驗(yàn)的可操作性和科學(xué)性。

2 實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程

2.1 實(shí)驗(yàn)原理

SRY基因是啟動(dòng)男性睪丸發(fā)育的主要基因。人類SRY基因位于Y染色體短臂Yp11.3，僅含一個(gè)外顯子，無(wú)內(nèi)含子。本實(shí)驗(yàn)選擇人類基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）基因?yàn)閮?nèi)參照。結(jié)果同時(shí)擴(kuò)增出SRY和GAPDH基因條帶，為男性樣品，僅有GAPDH基因條帶，則為女性樣品。

2.2 實(shí)驗(yàn)器材

PCR儀、無(wú)菌PCR管、移液槍、電泳儀、電泳槽、凝膠槽、離心機(jī)、EP管、細(xì)胞裂解液、瓊脂粉、電泳緩沖液、無(wú)水酒精、亞甲基藍(lán)、上樣緩沖液、DNA Marker5000、蛋白酶K緩沖液、TE緩沖液，引物如表1所示。

2.3 口腔上皮細(xì)胞基因組粗提取

實(shí)驗(yàn)前選取興趣小組男女生志愿者各一名，用生理鹽水漱口1 min。將漱口水轉(zhuǎn)移至離心管中，13 000轉(zhuǎn)離心1 min，棄上清液。每個(gè)離心管內(nèi)分別加入200 μL細(xì)胞裂解液和50 μL蛋白酶K吹打混勻。13 000轉(zhuǎn)離心1 min，上清液轉(zhuǎn)移至無(wú)菌離心管，加入400 μL無(wú)菌水放人-20℃冰箱保存。

2.4 PCR擴(kuò)增DNA片段

實(shí)驗(yàn)前隱去基因組性別標(biāo)記，用“甲”和“乙”代替。學(xué)生四人一組，每人取兩支無(wú)菌PCR管，分別用于擴(kuò)增SRY和GAPDH基因片段，每人擴(kuò)增模板需取自同一性別樣品。為方便結(jié)果對(duì)比，組內(nèi)兩人取“甲”為模板，另兩人取“乙”為模板。向無(wú)菌PCR管中依次加入模板、引物、Taq酶等試劑，最后將全班的PCR管放人PCR儀中，按圖1設(shè)定反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增。

2.5 凝膠電泳及染色觀察

制膠：稱取瓊脂粉1.0 g，加到盛有100 mL電泳緩沖液的三角瓶中。用封口膜封緊，微波爐加熱至充分溶解，倒入凝膠槽并立即插上膠梳。冷凝后輕拔膠梳，取出凝膠置于電泳槽內(nèi)，上樣孔靠近負(fù)極側(cè)，往電泳槽內(nèi)加入電泳緩沖液，使之剛好沒(méi)過(guò)凝膠。

上樣：PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)完成后取出PCR反應(yīng)管，每管加入10 μL上樣緩沖液，吹打混勻。每塊凝膠的第一個(gè)上樣孔內(nèi)加入20 μL DNA Marker 5000，其余上樣孔依次加入20 μL樣品。

電泳：連接好電泳儀電極，蓋好電泳槽蓋，恒壓150V條件下電泳18 min。

染色：電泳結(jié)束后，將凝膠轉(zhuǎn)移至濃度0.1%亞甲基藍(lán)染液中，染液沒(méi)過(guò)凝膠，染色8 min。

脫色：取出凝膠，加入75%酒精脫色1.5 min;倒去酒精；加入蒸餾水放置搖床中脫色至出現(xiàn)藍(lán)色條帶，觀察并分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并在組內(nèi)、組間交流討論。

3 實(shí)驗(yàn)改進(jìn)與優(yōu)化

3.1 縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間，提高實(shí)驗(yàn)效率

本實(shí)驗(yàn)開(kāi)出率較低，主要是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)耗時(shí)較長(zhǎng)。浙科版新版教材選擇擴(kuò)增酵母菌的某基因片段，其長(zhǎng)度長(zhǎng)達(dá)841 bp，整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程下來(lái)至少需4個(gè)課時(shí)，課程安排較為困難。實(shí)驗(yàn)改進(jìn)后選擇擴(kuò)增人類SRY和GAPDH部分基因，長(zhǎng)度分別為239 bp和554bp。變性、退火、延伸時(shí)長(zhǎng)均從1min縮短至30 s，預(yù)熱和終延伸時(shí)長(zhǎng)縮短至3 min。興趣小組在預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)對(duì)比30輪和33輪循環(huán)擴(kuò)增結(jié)果發(fā)現(xiàn)無(wú)明顯差異，故循環(huán)減少至30輪。以上改進(jìn)從整體上縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，同時(shí)也提升了實(shí)驗(yàn)的可操作性。

3.2 引入內(nèi)參照，確保實(shí)驗(yàn)科學(xué)性

對(duì)照原則是中學(xué)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中最常用的原則，引入對(duì)照組能使實(shí)驗(yàn)更為科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)。實(shí)驗(yàn)前，教師布置相關(guān)問(wèn)題：為何還要同時(shí)擴(kuò)增GAPDH基因片段？能否僅根據(jù)SRY基因片段進(jìn)行性別判定？學(xué)生討論得知人為操作因素會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，不能僅參照SRY基因片段，所以引入內(nèi)參照對(duì)實(shí)驗(yàn)來(lái)說(shuō)至關(guān)重要。本次實(shí)驗(yàn)引入GAPDH基因作為內(nèi)參照，GAPDH基因男女性均有，為管家基因（Housekeeping），序列高度保守，幾乎在所有組織中呈高水平、恒定表達(dá)，常用作蛋白質(zhì)、RNA、DNA等分子生物學(xué)相關(guān)實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)參照。實(shí)驗(yàn)中每個(gè)學(xué)生都完成兩個(gè)PCR反應(yīng)體系，從某小組實(shí)驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)圖2A）明顯能看出“A1號(hào)”和“A4號(hào)”為“男性”樣品；“A2號(hào)”和“A3號(hào)”為“女性”樣品，該小組成員都擴(kuò)增出GAPDH基因片段，說(shuō)明本組操作較為規(guī)范。

3.3 合并樣品上樣，增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象

預(yù)實(shí)驗(yàn)中學(xué)生常因移液槍使用不夠熟悉，易將上樣孔戳穿導(dǎo)致樣品外溢，再次上樣時(shí)發(fā)現(xiàn)上樣孔“不夠用”，重新制膠又需較長(zhǎng)時(shí)間。如果SRY和GAPDH基因擴(kuò)增產(chǎn)物上樣到不同泳道，則會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象不夠直觀。針對(duì)以上問(wèn)題，教師提問(wèn)：能否將不同基因片段合并混勻后加入到同一上樣孔中？電泳時(shí)不同基因片段是否會(huì)相互干擾？學(xué)生根據(jù)所學(xué)知識(shí)討論得出：影響電泳的主要因素是基因片段長(zhǎng)度、形狀和所帶電荷數(shù)，不同基因片段混合后電泳不會(huì)相互影響，電泳是分離基因片段的常用方法。本次改進(jìn)既節(jié)約上樣孔，又使得實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象更直觀，能直接對(duì)同一泳道中兩個(gè)條帶進(jìn)行觀察比較（見(jiàn)圖2B）。

3.4 建構(gòu)數(shù)學(xué)模型，表征實(shí)驗(yàn)結(jié)果

觀察條帶時(shí)，學(xué)生主要通過(guò)比對(duì)臨近Marker條帶的大小，粗略估算出條帶長(zhǎng)度。教師提問(wèn)：①如果DNA條帶位于兩條Marker條帶中間，如何準(zhǔn)確計(jì)算其長(zhǎng)度？②實(shí)驗(yàn)中有8個(gè)Marker條帶，多數(shù)學(xué)生僅用到兩條條帶，其他條帶是否蘊(yùn)含有重要信息？③已知DNA片段長(zhǎng)度的對(duì)數(shù)值與電泳遷移距離呈負(fù)相關(guān)，能否利用構(gòu)建數(shù)學(xué)模型的方法準(zhǔn)確計(jì)算片段長(zhǎng)度？在分析討論以上問(wèn)題后，組內(nèi)學(xué)生測(cè)量上樣孔與各Marker條帶的距離，即遷移距離，計(jì)算全班的數(shù)值平均值計(jì)入表2。

運(yùn)用Excel軟件對(duì)Marker遷移距離和片段長(zhǎng)度的對(duì)數(shù)值進(jìn)行散點(diǎn)圖繪制，選中“散點(diǎn)”并添加“趨勢(shì)線”獲得如圖3所示曲線。結(jié)果顯示R2值達(dá)到0．9939，說(shuō)明趨勢(shì)線與數(shù)據(jù)的擬合度較好。將目的條帶遷移距離代入公式換算，得出片段長(zhǎng)度分別約為250bp和549 bp，與實(shí)際長(zhǎng)度239 bp和554 bp較為接近。以上改進(jìn)既克服了片段估算的盲目性，使實(shí)驗(yàn)更加嚴(yán)謹(jǐn)，又提升了學(xué)生構(gòu)建數(shù)學(xué)模型的能力。

3.5 巧用實(shí)驗(yàn)器材，提升實(shí)驗(yàn)效果

因儀器設(shè)備限制，鼓勵(lì)學(xué)生充分利用現(xiàn)有設(shè)備提升實(shí)驗(yàn)效果。如在觀察染色結(jié)果時(shí)，凝膠中殘留亞甲基藍(lán)且凝膠厚度不均導(dǎo)致背景較深，從而影響觀察和拍照效果。學(xué)生提議將凝膠放置于更為平整的臺(tái)燈面上方，手動(dòng)調(diào)整臺(tái)燈亮度，使得條帶更為清晰干凈（見(jiàn)圖4）。脫色處理時(shí)，教材建議將凝膠放入蒸餾水中靜置脫色。預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)對(duì)比靜置脫色和搖床轉(zhuǎn)動(dòng)脫色的效果，結(jié)果顯示搖床中脫色使得條帶更加清晰，并且可通過(guò)調(diào)節(jié)搖床轉(zhuǎn)速和溫度提升脫色效率。

4 實(shí)驗(yàn)小結(jié)

通過(guò)優(yōu)化和改進(jìn)實(shí)驗(yàn)步驟，有效解決了教材中實(shí)驗(yàn)操作耗時(shí)長(zhǎng)、實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象不明顯、實(shí)驗(yàn)結(jié)果不理想等問(wèn)題，避免了因?qū)嶒?yàn)不成功而降低學(xué)生學(xué)習(xí)積極性的情況。根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況及時(shí)調(diào)整實(shí)驗(yàn)步驟，如“口腔上皮細(xì)胞基因組粗提取”實(shí)驗(yàn)可在課前完成，將基因組凍存于-20℃冰箱，PCR擴(kuò)增和凝膠電泳及觀察可在“連堂課”完成，其中PCR擴(kuò)增時(shí)長(zhǎng)約45 min。在等待PCR擴(kuò)增的過(guò)程中，可配制電泳緩沖液、亞甲基藍(lán)染液和凝膠等。此外，由于本活動(dòng)中需手動(dòng)測(cè)量DNA遷移距離，導(dǎo)致測(cè)距誤差較大，可以匯總?cè)鄶?shù)據(jù)取平均值以減小實(shí)驗(yàn)誤差。

實(shí)驗(yàn)教學(xué)不僅是生物學(xué)課程的特點(diǎn)，更是促成學(xué)生達(dá)成生物學(xué)學(xué)科核心素養(yǎng)的重要支撐，本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中教師需要有效組織學(xué)生合作交流，發(fā)展科學(xué)思維，培養(yǎng)質(zhì)疑精神，提升創(chuàng)新能力。

基金項(xiàng)目：2022年度浙江省教師教育規(guī)劃課題“基于課程綜合化的高中生物學(xué)情景教學(xué)與實(shí)踐”（ZX2022041）。