基于rbcL葉綠體序列解析金線蘭及其近緣種親緣關系

摘要要：【目的】應用rbcL葉綠體序列解析金線蘭及其近緣種親緣關系。【方法】以血葉蘭屬及開唇蘭屬rbcL葉綠體序列設計引物，擴增福建主栽金線蘭及其近緣種的 DNA序列，并進行系統進化樹及序列分析。【結果】從7種金線蘭及其近緣種中獲得1 221 bp rbcL序列，編碼406個氨基酸。對來自19種23條金線蘭及近緣種rbcL序列的進化樹及序列分析結果表明，金線蘭與峨眉金線蘭、長裂片金線蘭及浙江開唇蘭有較近的遺傳距離，其次為臺灣銀線蘭，血葉蘭與開唇蘭屬存在較大的遺傳距離。23條序列共存在24個多態性位點，及109個變異位點，定義14個單倍型；其中，金線蘭與峨眉金線蘭、長裂片金線蘭及浙江開唇蘭共享單倍型，而麗蕾金線蘭、滇南開唇蘭、滇越金線蘭、白線金線蘭、鐘山金線蘭共享單倍型。【結論】rbcL序列可用于金線蘭與近緣種的鑒別。

關鍵詞：開唇蘭屬；金線蘭；rbcL序列；葉綠體

中圖分類號：S567.239；R282" " " " " " " "文獻標識碼：A" " " " " " " " 文章編號：2095-5774（2024）05-0341-09

Phylogenetic Analysis between Anoectochilus roxborghil and Its Related SpeciesBased on rbcL Chloroplast Sequence

Ye Wei1，Yan Peipei1，Wang Peiyu1，Li Zunwen1，Wu Mingjun2，Li Hansheng3，Lin Minshui4，Jiang Jinlan1*

（1 Sanming Academy of Agricultural Sciences/ Fujian Key Laboratory of Crop Genetic Improvement and Innovative Utilization for Mountainous Areas，Sanming，Fujian 365509，China;

2 Shaxian Agriculture and Rural Bureau，Sanming， Fujian 365509，China;

3 Sanming University， Sanming，Fujian 365504，China;

4 Yongan Forestry Bureau， Sanming，Fujian 366038，China）

Abstract：【Objective】Based on rbcL chloroplast sequence analysis to determine the phylogenetic relationships between Anoectochilus roxborghil and its related species.【Method】Primers were designed based on the rbcL chloroplast sequences of Ludisia and Anoectochilus genera. Sequences were amplified from the DNA of the main cultivated A.roxborghil and its related species in Fujian，followed by phylogeneticand sequence analysis. 【Result】 rbcL sequences with 1 221 bp and coding 406 amino acids were amplified from 7 A.roxborghil and its related species. Total 19 species and 23 rbcL sequences were using for phylogenetic analysis. Results revealed that A.roxborghil was closely related to A. emeiensis，A. longilobus，and A. zhejiangensis，followed by A. formosanus. And there is a significant genetic distance between Ludisia and Anoectochilus genera. Those 23 sequences generated a total of 24 polymorphic sites and 109 variant sites，defined 14 haplotypes. Among them，A.roxborghil shared same haplotype with A. emeiensis，A. longilobus，and A. zhejiangensis，while A. lylei，A. burmannicus，A. chapaensis，A. albolineatus，A. zhongshanensis shared same haplotype. 【Conclusion】rbcL sequences could be used to distinguish between A.roxborghil and its related species.

Key words：Anoectochilus；Anoectochilus roxborghil；RbcL；Chloroplast

金線蘭（Anoectochilus roxborghil）為蘭科（Orchid）花葉開唇蘭屬植物，金線蘭及其近緣種植物統稱為金線蓮。金線蘭含有黃酮、多糖、生物堿、甾體化合物等多種活性成分，具有保護血管［1］、降血糖［2-3］、降血脂［4-5］、抗腫瘤［6-7］等功效，為我國南方地區的珍稀藥材。近年來，福建省已發展出規模化的金線蘭種苗生產與生態化種植模式，是南靖、永安等地的重要新興產業［8-9］。

開唇蘭屬種質資源豐富，廣泛分布于我國南部、東南亞及大洋洲地區；開唇蘭屬植物共有40余種，我國有20種2變種［10］。本屬傳統用作民間藥用植物至少5種以上，部分地區亦將其近緣種血葉蘭、斑葉蘭用作藥用［11］。近年來，金線蘭的活性成分金線蓮苷因具有抗肝纖維化、抗肝損傷等多種作用而使金線蘭成為藥用植物的熱點［6，12-14］。金線蓮苷（kinsenoside）于2000年在臺灣銀線蘭（A. formosanus）中被發現［15］，其在植株中的含量除受不同生理時期與環境條件影響外，還在不同開唇蘭屬及其近緣種植物中存在顯著差異［16-18］。Wu等［19］在對15份包括開唇蘭屬、斑葉蘭屬（Goodyera）及血葉蘭屬（Ludisia）植物的植物成分分析中發現，以金線蓮苷為主要活性成分的為金線蘭、臺灣銀線蘭、興仁金線蘭（A. xingrenensis）、南丹金線蘭（A. nandanensis），短唇金線蘭（A. brevilabris）及滇南開唇蘭（A. burmannicus），而麗蕾金線蘭（A. lylei）、長裂片金線蘭（A. longilobus）、高金線蘭（A. elatus）、浙江開唇蘭（A. zhejiangensis）、斑葉蘭（G. schlechtendaliana）、大花斑葉（G. biflora）、小小斑葉蘭（G. yangmeishanensi）、小斑葉蘭（G. repens）及血葉蘭（L. discolor）的主要成分則為斑葉蘭苷（goodyeroside A）。斑葉蘭苷是金線蓮苷手性異構體，其生理活性亦與金線蓮苷存在較大差異［15］。鑒于此，建立快速、準確的鑒定金線蘭及近緣種植物技術具有重要的現實意義。

金線蘭及其近緣種的株葉形態多樣，金線蘭種內就有葉脈色金紅的“有線”類型與葉脈色不明顯的“無線”類型，而不同種間的區分常常依賴于花器官形態的差異，更加大了不同種材料的辨認難度。利用分子標記及葉綠體序列測序技術可以不受環境與生長期和局限，具有快速、準確的特點，是鑒定金線蘭及近緣種植物的重要技術方法［20-22］。葉綠體rbcL序列編碼植物核糖體中的1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/氧化酶大亞基，具有保守度高、易擴增、進化速率快等優點，可用于植物物種間分類鑒定及系統發育的研究［23-25］。目前，已有研究對金線蘭及近緣種葉綠體psbA-trnH序列進行分析［21］，但還未見利用葉綠體rbcL序列對金線蘭及近緣種進行親緣關系分析報道。本研究以福建市場較為常見的7份金線蘭及近緣種資源為材料，擴增葉綠體rbcL序列，合并與來自NCBI GenBank的共19種23條金線蘭及近緣種rbcL序列進行序列分析，構建分子系統發育樹，為金線蘭及近緣種的分子鑒定提供理論基礎和依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

4份金線蘭分別為滇南開唇蘭（資源保存編號A043）、金線蘭（尖葉，資源保存編號A040）、金線蘭（圓葉，資源保存編號A008）、臺灣銀線蘭（資源保存編號A009）及其3份近緣種資源血葉蘭（資源保存編號L1～L3），所有材料均以組培苗形式保存于三明市農業科學研究院藥用植物研究所，相關組織培養方法見文獻［26］。7份試驗材料相關信息與外觀見表1、圖1。

1.2基因組DNA提取

參照葉煒等［20］利用CTAB法提取金線蘭及近緣種基因組DNA。

1.3 葉綠體rbcL序列擴增與測序

根據GenBank中開唇蘭及血葉蘭葉綠體rbcL序列保守序列區段，設計上游引物Lud-rbcL F：5'-GTTTTCTTTTTTACGAACCT -3'，下游引物Lud-rbcL R：5'-GATTTCTACATTTCCGACAA -3'，引物序列由華大基因合成。序列擴增參照曹奕鴦等［27］方法，采用20 μL體系，反應條件為94℃預變性4 min，94℃變性40 s，52℃退火40 s，72℃延伸1 min，共40個循環，72℃延伸6 min，于伯樂MyCycler PCR擴增儀擴增，1%瓊脂糖電泳回收1 200 bp左右帶，送福州博尚股份有限公司進行雙向測序。

1.4 序列分析

采用DNAMAN 6進行序列拼接。利用Blastn在NCBI進行數據比對。獲取已公布的金線蘭及近緣種葉綠體rbcL序列為參比序列，在MEGA11中構建Neighbor-Joining系統進化樹。利用 DnaSP 6.12.03 軟件分析單倍型多樣性指數（Haplotypediversity，Hd）、核苷酸多樣性（Nucleotidediversity，π）、核苷酸平均差異數（Averagenumber of nucleotide difference，k）。通過DNAMAN 6預測氨基酸序列，并進行多序列比對，分析同義突變及非同義突變位點信息。

2 結果與分析

2.1 金線蘭及近緣種葉綠體rbcL序列克隆與測序

利用所設計的引物擴增金線蘭及近緣基因組DNA，回收1 200 bp左右條帶，測序拼接后，獲得1 221 bp序列，該序列位于rbcL序列開放閱讀框，編碼406個氨基酸。將序列登錄GenBank，獲得登錄號（PQ213006- PQ213012），詳見表1。

2.2序列系統發育樹分析

將獲得的7條序列合并其他19種的23條金線蘭及近緣種rbcL序列進行Neighbor-Joining進化樹分析（圖2）。結果可見，來自漳州平和編號為5、6與7的3個血葉蘭與其他血葉蘭 rbcL序列（PP873195）聚在同一分支，并與西南齒唇蘭（Odontochilus elwesii）、擬線柱蘭（Zeuxinella vietnamica）有較近的親緣關系。來自開唇蘭屬植株rbcL序列具有較高的保守性，均與上述序列有較遠的遺傳距離，其中編號為3號的臺灣銀線蘭亦與同種序列（NC061756）聚在同一分支，而編號為2和4號的金線蘭與金線蘭、峨眉金線蘭（A. emeiensis）、長裂片金線蘭（A. longilobus）、浙江開唇蘭聚在同一分支。編號為1的滇越金線蘭（A. chapaensis）則與滇南開唇蘭、保亭金線蘭（A. baotingensis）具有較近的親緣關系，但與金線蘭及臺灣銀線蘭有較遠的遺傳距離。

2.3序列多態性位點分析

通過DNAMAN多序列比對（見表2），在所分析的1 221 bp的序列中，共產生24個多態性位點，核苷酸多樣性指數0.003 99，核苷酸平均差異數4.846。多態性位點占全長1.97%，24個多態性位點共產生10種堿基變異類型，出現最多的分別為6個G變A、5個C變T、4個 T變C和3個C變A，其余的A變C、G變C、A變G、G變T、A變T、T變A均只出現1個。在多態性位點中，334、771、892、921、996位點可能是金線蘭及臺灣銀線蘭與其他開唇蘭屬產生分化的重要位點，而血葉蘭與開唇蘭屬植物的差異性多態性位點有7個，占總多態性的29.1%，表明血葉蘭與開唇蘭屬植物存在較大遺傳距離。

參與分析的23條序列共產生109個變異位點，定義出14個單倍型，單倍型多樣性指數0.892。14個單倍型中5個為共享單倍型，分別為3號（包含2個臺灣銀線蘭）、5號（包含2個血葉蘭）、8號（包含滇南開唇蘭、滇越金線蘭、白線金線蘭、鐘山金線蘭）、10號（包含金線蘭、峨眉金線蘭、長裂片金線蘭）及14號（滇越金線蘭、保亭金線蘭、石灰金線蘭、屏邊金線蘭、海南金線蘭），其余9個均為獨享單倍型，其中來自組織培養的7份材料獨享單倍型為5個，占71.4%。

在蛋白序列分析中，發現同義突變多態位點為17個，占總多態性位點的70.83%，同義突變位點56個，占總突變位點的51.38%；而非同義突變多態性位點6個，占29.17%，非同義突變位點53個，占總突變位點的48.62%。

3 討論

本研究基于葉綠體rbcL基因序列對金線蘭及其近緣種親緣關系進行了分析。依據開唇蘭及血葉蘭葉綠體rbcL序列保守序列區段設計引物，以福建市場較為常見的7份金線蘭及近緣種資源為材料，獲得1 221 bp 的rbcL序列，登錄號分別為PQ213006- PQ213012，結果表明所設計引物可適用于血葉蘭、臺灣銀線蘭、金線蘭及滇南開唇蘭。rbcL序列屬于進化速率較快的基因［23-25］，并已證實用它進行蘭科種間鑒定優于psbA-trnH和ITS2序列［28-30］。雖然開唇蘭屬植物葉綠體基因組已完成測序［31-33］，但目前有關金線蘭葉綠體序列親緣關系的報道僅見于psbA-trnH序列［21］。

將來自19種23條金線蘭及近緣種rbcL序列進行Neighbor-Joining進化樹及序列分析發現，血葉蘭與開唇蘭屬存在較大的遺傳距離，而與西南齒唇蘭較為接近，本結果與吳巖斌等［21］基于ITS序列分析結果一致。血葉蘭在福建被稱為“公石松”，亦作為“公金線蓮”于市面流通［34-35］，然而，血葉蘭的主要成分為斑葉蘭苷［19］，其rbcL序列具有獨有的單倍體分型，與金線蓮在遺傳上有顯著區別，不宜直接作為“金線蓮”進行開發。臺灣銀線蘭與金線蘭并稱為“金線蓮”，在福建亦作為“金線蓮”的主要品種進行規模化產業化開發，由于其產量大，抗莖腐病能力強［36］，再加上金線蓮苷最早便是發現于臺灣銀線蘭［15］，因此臺灣銀線蘭種苗廣受種植業者的青睞。本研究表明，臺灣銀線蘭與金線蘭有較近遺傳距離，僅次于峨眉金線蘭、長裂片金線蘭及浙江開唇蘭。單倍體分型中臺灣銀線蘭與此分型僅有1個堿基的差異，再次表明臺灣銀線蘭與金線蘭在遺傳關系上較為接近，此結果與葉煒等［20］利用ISSR標記分析結果較為一致。在基于psbA-trnH序列分析中，臺灣銀線蘭與金線蘭遺傳距離大于麗蕾金線蘭［21］，而麗蕾金線蘭主要成分則為斑葉蘭苷［19］，在單倍體分型中與滇南開唇蘭、滇越金線蘭、白線金線蘭、鐘山金線蘭、滇越金線蘭共享。同樣的是，浙江開唇蘭雖享有獨自的單倍型，但與金線蘭、峨眉金線蘭、長裂片金線蘭聚在同一分支，其主要的活性成分卻為斑葉蘭苷［19］，目前有關浙江開唇蘭的報道較少。本研究結果表明，rbcL序列可用于部分開唇蘭屬種間的鑒定，但單一的葉綠體序列尚難明確開唇蘭屬種質資源與有效成分之間的關系，其真實的的遺傳距離仍有待于進一步研究。

在本研究中，來自廣東惠州及福建沙縣的金線蘭雖與已公布的金線蘭rbcL序列具有較近遺傳距離，但未能與其共享1個單倍型，二者均在896、907、913 bp處存在G到T，G到A和C到A的突變點。雖然廣東與福建分布豐富的金線蘭資源，但組培過程可能加速金線蘭的變異［37］，此類型突變源自野生金線蘭的自然變異還是組培過程加快了基因的突變仍有待進一步研究。

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（責任編輯：馮" " 新）

收稿日期：2024-09-06

基金項目：福建省科技計劃項目（2023S0018、2023N0047、2024N5008）；福建省省級財政林業專項資金（閩財資環指［2020］10號）；三明市科技計劃項目（2023-N-6、2023-N-19）

作者簡介：*為通訊作者，江金蘭（1973-），女，高級農藝師，主要從事園藝植物生物技術研究，E-mail：jjl75@qq.com。

葉煒（1980-），男，副研究員，博士，主要從事園藝植物生物技術研究，E-mail：yewei922@qq.com