酵母雙雜交技術在植物研究中的應用

摘要要：本文對酵母雙雜交技術在植物基因功能研究以及抗逆性等方面的應用進行了綜述。首先，我們闡述了酵母雙雜交技術的工作原理以及實驗流程。其次，我們詳細描述了利用該技術所取得的一系列重要研究結果，涉及到不同作物品種間特定基因互作關系、新型抗逆基因篩選等方面。最后，針對酵母雙雜交技術的局限性問題找到新的解決方法，并對酵母雙雜交技術在植物領域的應用進行了展望。

關鍵詞：酵母雙雜交；植物；蛋白互作

中圖分類號：S188" " " " " " " " " " " "文獻標識碼：A" " " " " " " " " " " " 文章編號：2095-5774（2024）05-0438-07

Application of Yeast Two-hybrid Technology in Plant Research

Guo Jin，Nie Zhuxin，Wang Jing*

（College of" Biological Science and Engineering，North Minzu University，Yinchuan，Ningxia 750021，China）

Abstract：This review provides an overview of the application of yeast two-hybrid technology in plant gene function research and stress resistance. Firstly，it outlines the working principle and experimental procedures of yeast two-hybrid technology. Secondly，it details a series of significant research findings using this technology，including specific gene interactions among different crop species and the identification of novel stress resistance genes. Finally，a new approach to address the limitations of yeast two-hybrid technology is proposed，along with a prospective outlook on its application in plant research.

Key words：Yeast two-hybrid；Plants；Protein interaction

生命的基本過程就是不同功能蛋白質在時空上有序和協同作用的結果，探索蛋白質之間的相互作用是理解蛋白質功能的基礎。在生物學研究中，有多種研究蛋白質相互作用的方法，包括體外檢測法：熒光偏振免疫分析法（Fluorescence polarization immunoassay，FPIA）、等溫量熱滴定儀（Isothermal titration calorimetry，ITC）、表面離子體共振（Surface plasmon resonance，SPR）、微量熱泳動技術（Microscale thermophoresis，MST）；體內檢測法：下拉實驗（Pull-down assay）、免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）、蛋白質相互作用交聯分析（Protein interaction crosslinking analysis）、酵母雙雜交（Yeast Two-Hybrid）篩選體系。酵母雙雜交是在體內研究蛋白質與蛋白質之間相互作用的一種分子生物學方法，該方法高效、簡潔，能夠檢測蛋白質之間極微弱或瞬時的相互作用。在植物研究中具有重要應用價值，該技術能夠揭示植物中不同蛋白質之間復雜而精細的相互作用關系，為深入理解蛋白質在植物生長發育、抗逆性等方面的功能提供了重要依據。

1工作原理

酵母雙雜交的基礎成分依賴于轉錄激活因子GAL4［1］，GAL4轉錄激活因子是一種內源性表達蛋白［2］，含有DNA結合域（DNA binding domain，DNA-BD；GAL41-147aa） ［3］和激活結構域（ Activation domain，AD；GAL4771-881aa） ［4］。Keegan［3］發現了酵母GAL4蛋白與靶基因上游特定的DNA位點結合并激活轉錄。Fields 和 Song［5］建立了酵母雙雜交體系，在酵母細胞中發現GAL4轉錄因子通常具有兩個相對獨立的結構域：BD和AD，這兩個結構域在空間上彼此分離，各具功能。BD和AD相互獨立時不能激活轉錄反應，只有當這兩個結構域共同作用時轉錄才能正常進行。利用這一特性，可以分別將BD與AD同目標蛋白結合形成融合蛋白，如果待測的兩個目標蛋白之間發生相互作用，BD與AD在空間上相互接近從而啟動轉錄，使下游的報告基因表達，就可以產生可觀測表型。如果待測蛋白質之間沒有相互作用，則轉錄不會發生（如圖1所示）。

2組成

酵母雙雜交系統的組成部分，①Gal4 BD ：識別上游激活序列 （UAS） + 誘餌蛋白X（Bait protein）（通常為已知蛋白）；②Gal4 AD ：轉錄激活作用+ 獵物蛋白Y（Prey protein）（通常為未知蛋白）；③帶有報告基因的宿主菌株：常用報告基因分為營養缺陷篩選型、抗性篩選型和藍白斑篩選型報告基因，營養缺陷篩選型、抗性篩選型報告基因根據宿主菌能否在選擇培養基上生長，判斷蛋白質之間是否相互作用；藍白斑篩選型報告基因通過顯色反應篩選陽性克隆。

3實驗流程

酵母雙雜交技術是檢測蛋白質互作的一種非常有效的方法，其大致的實驗流程為：①構建酵母表達載體，將誘餌蛋白的編碼序列連接到pGBKT7，獵物蛋白的編碼序列連接到pGADT7 ；②酵母遺傳轉化，將構建好的酵母表達載體轉化到酵母菌株中；③自激活和自毒檢測；④酵母雙雜交，將正常轉化的酵母菌株在選擇培養基上進行適時培養；⑤檢測，如果蛋白質之間存在相互作用，在SD/-Ade-His-Trp-Leu+X-α-Gal+AbA培養基上，呈現藍色（如圖2所示）。

4酵母雙雜交技術在植物研究中的應用

酵母雙雜交技術在植物研究中的應用主要包括三個方面。首先，利用該技術可以在cDNA文庫中檢測已知蛋白和確認未知蛋白之間的相互作用［6］。其次，可以通過該技術探索新基因的生物學功能［7］。最后，酵母雙雜交技術還可用于確定蛋白質之間相互作用所必須的結構域［7］。

4.1 檢測蛋白質之間相互作用

通過酵母雙雜交技術研究蛋白質之間相互作用是探索蛋白質功能的關鍵，植物的生長發育，細胞間信號轉導、響應生物及非生物脅迫以及細胞周期調控等過程，都是蛋白質之間相互作用，共同調控的結果。在植物生長發育過程中，可以利用酵母雙雜交技術研究蛋白質之間的相互作用。

在花的生長發育中，衰老由不可逆的程序性細胞死亡（Programmed cell death，PCD）過程調控［8］。Wang等［9］克隆了黃花菜花朵中特異表達的轉錄因子HfNAC090和HfNAP1，兩個基因均在黃花菜花的PCD過程中發揮主導作用，通過酵母雙雜交技術證明HfNAC090和HfNAP1之間存在相互作用，該結果為構建黃花菜花朵中PCD調控網絡提供了重要依據，同時，為延緩黃花菜花朵的衰老提供了新的策略。Chen等［10］在棗樹的研究中，利用酵母文庫篩選技術，檢測到對棗樹芽增殖起正調控作用的植原體效應蛋白Zaofeng6的互作蛋白ZjTCP7，進一步研究發現Zaofeng6通過抑制ZjTCP7的表達，促進棗樹芽的增殖。這項研究結果為理解植物病原體效應蛋白與植物生長之間的相互作用機制提供了新的視角。Shan等［11］在研究NAC轉錄因子調控香蕉果實成熟中的作用機制時，通過酵母雙雜交技術，檢測到MaNAC1/2與MaEIN5蛋白相互作用，結合實驗得出MaNAC1和MaNAC2通過與乙烯信號通路相互作用參與香蕉果實的成熟。在山藥中，通過酵母文庫篩選技術，獲得能夠與調控山藥塊莖膨大的DoWRKY40相互作用的四種蛋白（內切葡聚糖酶蛋白、DNA結合蛋白BIN4、蛋白磷酸蛋白和BAG家族分子伴侶蛋白），這一研究為解析山藥莖塊膨大及其信號轉導調控過程奠定了基礎［12］。

植物作為環境的一部分，與外界的光、溫、水、氣、熱及其他生命體相互影響，相互作用。酵母雙雜交技術是研究植物響應逆境脅迫過程中蛋白質與蛋白質相互作用的重要方法。TIFY基因家族對植物的生長、發育和抗逆性起著重要的調控作用［15］。Wang等［16］利用酵母雙雜交技術，證明兩個正調控辣椒植株耐寒性的轉錄因子CaTIFY7、CaTIFY10b能夠相互作用，并發現CaTIFY7與CaTIFY10b可能形成異源二聚體或同源二聚體，正調控辣椒的冷脅迫反應。這項研究成果，為深入理解TIFY基因家族的功能和分子機制奠定了基礎，也為未來開展耐寒辣椒的品種選育提供了依據。Wang等［15］和王秋月等［16］分別在小葉楊和玉米中，利用酵母文庫篩選技術，篩選出參與小葉楊響應鹽脅迫的乙烯信號通路相關因子及能夠調控玉米大斑病菌黑色素合成相關的因子，為深入研究小葉楊的鹽脅迫響應機制及玉米大斑病菌的致病機理奠定了基礎。光脅迫是限制大豆產量的重要因素，Zhang等［17］，利用酵母雙雜交技術確定了大豆中GmPLP1和GmVTC2（GmVTC2a，GmVTC2b和GmVTC2c）家族蛋白能夠相互作用，并通過提高大豆內源抗壞血酸含量，增強其對強光脅迫的耐受能力。Lynch等［18］利用酵母文庫篩選，檢測到組蛋白去乙酰化酶與ABA-INSENSITIVE5結合蛋白（AFPs）能夠相互作用［19］，進一步發現AFPs可以通過TOPLESS依賴性和非依賴性染色質修飾機制調節植物基因對ABA的響應過程，調節植物抗旱過程。

4.2 發現新的蛋白質及蛋白質的功能

利用酵母雙雜交技術，篩選植物不同發育時期、不同生長條件的cDNA文庫，可為獲得參與植物某一生命活動的新的蛋白質或已知蛋白質的新功能提供思路，這是酵母雙雜交技術目前最受矚目的應用之一。Lin等［20］在研究MPK4介導的煙草抗煙草青霉素桿菌的實驗中，通過篩選煙草葉片mRNA文庫，獲得能夠與MPK4相互作用的肌醇-3-磷酸合成酶同工酶1（MIPS1）蛋白，兩者協同作用參與了植株與多種壓力相關ROS的產生，影響氣孔運動，進而增強了植株抗病性。此外，通過篩庫，還獲得與葉綠體發育相關的兩個伴侶蛋白60亞單位α1（CPN60A）和DNA J蛋白A7 （DJA7）及與Ras信號轉導相關的RAB GTPASE同源物A1G（RABA1G），這些蛋白的發現，為深入理解MPK4激酶的新功能開辟了新的方向。Wang等［21］利用菌核菌的真菌效應物Sspg1d篩選油菜的cDNA文庫，鑒定出一個含有C2結構域的小蛋白（IPG-1），IPG-1可被菌核菌高度誘導表達，這為解析菌核菌與油菜的作用機制提供了新的候選基因。Cao等［22］構建了高質量的小麥春化過程酵母cDNA文庫，以TaVRN-A1為誘餌，篩選得到兩個互作蛋白TaSOC1和TaSVP1，為理解小麥春化途徑的調控提供了重要的線索。Guo等［23］以GhZFP1為誘餌蛋白，篩選陸地棉的cDNA文庫，檢測到GhZFP1蛋白可與參與棉花響應缺水脅迫的GZIRD21A蛋白和抗病相關的GZIPR5相互作用，揭示GhZFP1很可能是一個陸地棉響應鹽脅迫和真菌病害的調控因子。

4.3 檢測蛋白質相互作用的特定區域

大多數功能蛋白具有多個結構域，蛋白與蛋白相互作用時，往往依賴于特定的結構域結合，進而發揮功能。研究蛋白質與蛋白質相互作用的結構域時，可以將蛋白質按照結構域劃分，分別構建載體，研究其相互作用。Ferna?ndez-Calvo等［24］發現MYC2蛋白與茉莉酸信號通路調控因子JAZs（Jasmonate ZIM-domain）結合過程中，N端序列是必須的結構域，將MYC2蛋白N端序列截斷為MYC2-D55-99和MYC2-D93-160，分別構建載體，通過酵母雙雜交實驗，證明MYC2-D93-160結構域可與大多數JAZs蛋白互作，通過生物信息學分析，發現MYC2-D93-160結構域在與JAZs互作的MYC蛋白中高度保守。這項研究成果為篩選能夠在茉莉酸信號通路中發揮作用的蛋白提供了數據支撐。Kang等［25］，利用酵母雙雜交技術從蘋果中篩選出與MdCOP1互作的MdBT2蛋白，并證明兩個蛋白相互作用的結構域為MdBT2的back-like結構域和MdCOP1的coil-coil結構域，這為理解蘋果花色苷生物合成的分子調控機制提供了新的視角。Guo等［26］構建了無機磷酸鹽（Pi）處理的水稻幼苗cDNA文庫，并通過酵母雙雜交技術，篩選獲得與OsSPX-MFS3相互作用的蛋白OsSYP22，并進一步證明OsSYP22全長、OsSYP22SynN、OsSYP22SynN+t-SNARE 可與OsSPX-MFS3的SPX的結構域相互作用，在水稻感知磷酸鹽穩態過程中發揮作用。

5 酵母雙雜交技術的局限性

在植物研究領域，酵母雙雜交技術雖然被廣泛應用，但仍存在一些不足之處。其中主要表現為：①假陽性，即靶蛋白或誘餌蛋白具有自激活性，在無需相互結合的情況下就能激活轉錄功能并產生可觀測的表型。為避免這種情況的發生，需要進行空白試驗來消除影響。 ②假陰性［27］，即不能在細胞內折疊的蛋白質或不能進入細胞核的蛋白質無法通過酵母雙雜交技術進行檢測，并且所有表達的蛋白質都不能具有毒性［28］。目前，為了克服酵母雙雜交技術的限制，已經開發和應用了多種新興技術和方法。例如，分裂泛素化細胞質酵母雙雜交系統以及基因編輯技術優化酵母雙雜交系統等。分裂泛素化細胞質酵母雙雜交系統通過將目標蛋白分為兩部分，并在不同的細胞中表達，從而實現蛋白質在細胞質中的正確折疊和功能表達。這一方法有助于研究那些可能無法在傳統酵母雙雜交系統中正確表達或折疊的蛋白質［29］。此外，利用基因編輯技術優化酵母雙雜交系統也是一個可行的途徑，通過CRISPR-Cas9等基因編輯技術，在酵母細胞中精確修改特定基因的表達，以增強或抑制某些蛋白質的功能，從而優化酵母雙雜交實驗系統［30］。

6 展望

除了在基礎科學研究中的應用外，酵母雙雜交技術的研究成果也被廣泛運用于作物的遺傳改良。利用該技術可以篩選出與特定性狀相關聯的蛋白質，并進一步進行功能分析和基因編輯，從而為生物育種提供新思路和方法。

總之，酵母雙雜交技術不僅在揭示植物細胞內蛋白相互作用網絡方面具有重要意義，在農業領域也有著廣闊的應用前景。隨著該技術不斷完善和深入應用，必將在生命科學研究中做出更大貢獻。

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（責任編輯：馮" "新）

收稿日期：2024-05-06

項目基金：北方民族大學研究生創新項目（YCX24405）

作者簡介：*為通訊作者，王靜（1984-），女，副教授，主要從事植物此生代謝產物調控的研究，E-mail：wangjing_imu2@163.com 。

郭瑾（1994-），女，碩士研究生，主要從事植物次生代謝產物調控研究，E-mail：1282524504@qq.com