西藏墨脫地區枇杷新擬盤多毛孢菌培養特征及致病力分析

2024-01-01 00:00:00甘林姜帆蘭成忠代玉立何玉仙楊秀娟

東南園藝 2024年5期

摘要要：【目的】為探究來自西藏墨脫地區枇杷葉斑病新擬盤多毛孢菌的生物學特性，有效預防病害的發生。【方法】采用平板培養法和離體葉片接種法對病原菌進行培養和致病力測定。【結果】供試21個菌株在PDA培養基上培養12 d，依據培養基中著生的分生孢子盤數量的高、中和低，將菌落培養表型劃分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型，菌株出現頻率分別為38.10%、33.33%和28.57%。培養5 d，菌落生長速率范圍值為12.68～15.60 mm/d，平均值為14.33 mm/d。培養12 d，菌落產孢量高于和低于1×105 個孢子/cm2的菌株出現頻率分別為71.43%和28.57%，有致病力和無致病力的菌株出現頻率分別為61.90%和38.10%。菌株致病力與菌落生長速率以及產孢量之間均無相關性。【結論】西藏墨脫地區流行的新擬盤多毛孢菌培養特征及致病力出現明顯分化，大部分菌株產孢能力強，且對枇杷有致病力。

關鍵詞：枇杷；新擬盤多毛孢菌；培養特征；致病力

中圖分類號：S667.3" " " " " " " " " " "文獻標識碼：A" " " nbsp; " " " " " " " " 文章編號：2095-5774（2024）05-0396-07

Culture Characteristics and Pathogenicity of Neopestalotiopsis sp.

to Loquat in Medog Areas of Tibet

Gan Lin1，Jiang Fan2，Lan Chengzhong1，Dai Yuli1，He Yuxian1，Yang Xiujuan1*

（1 Institute of Plant Protection，Fujian Academy of Agricultural Sciences / Fujian Key Laboratory

for Monitoring and Integrated Management of Crop Pests，Fuzhou，Fujian 350013，China；

2 Fruit Research Institute，Fujian Academy of Agricultural Sciences，Fuzhou，Fujian 350013，China）

Abstract：【Objective】In order to study the biological characteristics of the population of Neopestalotiopsis sp. isolated from Loquat leaf spot in Medog areas of Tibet，which prevent effectively the occurrence of the disease.【Method】The tests of culture characteristics and pathogenicity of pathogens were determined by plate culture and leaf inoculation in vitro. 【Result】According to the high，medium and low numbers of acervulus in the culture，the colony culture phenotypes of 21 strains which cultured on PDA medium for 12 days were divided into type I，type II and type III，with 38.10%，33.33% and 28.57% of the occurrence frequency，respectively. The range value of colony growth rate of 21 strains cultured for 5 days was 12.68～15.60 mm/d，and the average value was 14.33 mm/d. The frequency of strains cultured for 12 days，with the number of colony spores higher and lower than 1×105 spores/cm2 were 71.43% and 28.57%，which the frequency of pathogenic and non-pathogenic strains were 61.90% and 38.10%，respectively. There was no correlation between strain virulence and colony growth rate and spore number.【Conclusion】Neopestalotiopsis sp. in Medog areas of Tibet had obvious differentiation in culture characteristics and pathogenicity，and the most of the strains had strong sporulation ability and pathogenicity to loquat.

Key words：Loquat；Neopestalotiopsis sp.；Culture characteristics；Pathogenicity

由類擬盤多毛孢菌侵染引起的枇杷葉斑病是枇杷生產的一種主要病害，在浙江、安徽、江蘇、福建等地方廣泛發生［1-3］，病害多發生在葉片上，后期形成圓形至不規則形灰白色病斑，病斑干燥易破裂，嚴重時可導致葉片畸形、早衰脫落，此病害不僅為害葉片影響樹勢，還侵染花和果實造成產量嚴重下降，枇杷果實采后易發生腐爛，影響商品性［4-5］。

近年來，枇杷產業在我國西藏墨脫地區迅速發展，2023年我們在該地區不同枇杷園調查發現，當地枇杷葉斑病發生普遍，部分果園發生較嚴重，急性型和慢性型病斑均有發生。通過病樣癥狀觀察、病原菌分離，并結合病原菌形態特征和分子生物學鑒定，確定該地區發生的枇杷葉斑病病原菌為新擬盤多毛孢菌Neopestalotiopsis sp.。

植物病原菌在侵染傳播過程中易發生變異分化，而病原菌的生物學特性是病原菌致病機理、病害流行及防治研究的基礎。據已有的研究報道，枇杷擬盤多毛孢菌菌絲生長適宜溫度為20～25℃，病原菌以對碳源的蔗糖、乳糖、葡萄糖利用為佳，蔗糖、葡萄糖適合病原菌產孢；以對氮源的蛋白胨、磷酸銨、硝酸銨和硝酸鉀利用為佳，硝酸鉀最適合病原菌產孢，尿素則可抑制病原菌生長［6］。分生孢子萌發的適宜溫度為20～30℃［7］，孢子在飽和濕度或水滴中萌發快，相對濕度低于90%時則不能萌發，麥芽糖、蔗糖對分生孢子萌發有促進作用，而硫酸銨、磷酸銨、硝酸銨對孢子萌發有抑制作用，分生孢子和菌絲體在50℃溫水中經15 min或55℃溫水中經2 min處理完全失去活力［8］。然而，目前對西藏墨脫地區枇杷葉斑病發生流行規律不清楚，對該病害病原菌的培養特征及致病力尚無研究報道。

本試驗在前期的工作基礎上，從該地區枇杷葉斑病病組織中分離獲得新擬盤多毛孢菌，通過研究病原菌培養表型、生長速率、產孢能力和致病力，旨在了解當地枇杷葉斑病田間發生和病原菌流行規律，為病害科學防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株

從西藏墨脫縣枇杷種植區采集病樣，病菌分離純化鑒定后保存，供試的21株枇杷新擬盤多毛孢菌菌株編號及來源信息參見表1。

1.1.2 供試枇杷葉片

從福建省農業科學院果樹研究所枇杷園中選取‘早鐘6號’新鮮健康無病成熟葉片。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株培養性狀觀察及生長速率測定

各菌株活化后，打取直徑5 mm的菌碟移至直徑為9 cm的PDA平板上，于25 ℃條件下黑暗培養，觀察和記載菌株培養5 d和12 d平板的菌落性狀，并測量培養5 d各菌株的菌落直徑，計算菌落生長速率，每個菌株重復4次。

1.2.2 菌株產孢量測定

取在平板上培養12 d的各菌株菌落，用打孔器從菌落中心點出發至邊緣連續打取直徑5 mm的菌餅6個，每皿共打取24個菌餅移至含5 mL無菌水的試管中，試管內有直徑2 mm的鋼珠3個，置于180 r/min搖床上振蕩5 min以洗脫分生孢子，用血球計數板測定產孢量，計算各菌株每平方厘米菌落的產孢量，每個菌株處理重復4次。

1.2.3 菌株致病力測定

采用離體葉片接種法，病原菌接種方式參考但雨柔等［9］方法，即用無菌水清洗葉片晾干后，在葉片正面沿葉脈兩側各選4點用滅菌接種針刺傷。在培養12 d的菌株平板中部，用打孔器打取直徑5 mm菌餅，在各針刺傷口處接種1個菌餅，菌絲面貼于葉片正面傷口處，用大小相同的無菌PDA菌餅作為對照，每個菌株接種4個點，重復3次。接種后的葉片平放置于鋪有2層滅菌濕濾紙的保濕盒內，在25℃光照/黑暗12 h交替的培養箱中培養15 d后，測量各接種點病斑直徑。以在接種點能形成典型褐色病斑視為有致病力，以病斑直徑大小評價菌株的致病力大小。

1.3 數據處理

試驗數據采用Microsoft Excel 2007和DPS 7.05進行統計分析，數值用“平均值±標準誤”采用Duncan氏新復極差法分析不同處理間的差異顯著性，采用線性回歸分析法進行相關性分析。

2 結果與分析

2.1 菌株平板培養性狀

不同菌株在PDA培養基上生長良好，培養5 d，菌落近圓形，正面棉白色，氣生菌絲發達，叢生呈絮狀或絨毛狀，菌絲層較厚，表面層狀不平，邊緣整齊，菌落背面淡草黃色。培養12 d后，不同菌株菌落表型出現分化，主要劃分為三種類型（圖1），Ⅰ型（8株）：整個培養介質著生黑色粒點（分生孢子盤）數量高而密，分別是X-2、YL2-2、B-4、DT-4、D2-2、DT-5、P-1、MA-6；Ⅱ型（7株）：培養介質著生黑色粒點數量中等，分別是Y-4-2、X-7、DT-2、P-2、H-5、X-5、Y7-1-2，粒點著生部位和密度無規律性，有的在菌落中部，有的在菌落邊緣；Ⅲ型（6株）：培養介質著生黑色粒點數量低，分別是Y1-1、X-6、YL3、YL4、MA-3、Y4-4。Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型菌株出現頻率分別為38.10%、33.33%和28.57%。

2.2 菌株生長速率

從表2可見，供試的21個菌株在PDA平板上培養5 d，不同菌株生長速率存在很大差異，菌落生長速率范圍值在12.68～15.60 mm/d之間，平均值為14.33 mm/d，最大值是最小值的1.23倍，以MA-3、H-5菌株的菌落擴展能力強，生長速率達15.00 mm/d以上，明顯高于其他菌株，而以Y4-2、P-1等6個菌株菌落擴展能力較弱，生長速率低于14.00 mm/d。Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型菌株平均生長速率無顯著性差別，菌株生長速率與其平板培養表型和地方來源無關。

2.3 菌株產孢量

從表2可見，不同菌株在PDA平板上培養12 d的產孢能力差異極大，21個菌株中菌落產孢量高于1×105個孢子/cm2的菌株有15個（占71.43%），其中高于100×105個孢子/cm2的菌株有4個（占19.05%），低于1×105個孢子/cm2的菌株有6個（占28.57%）。以YL2-2菌株產孢能力最強，DT-4菌株產孢能力次之，產孢量明顯高于其他菌株的產孢量。

三種類型群體菌株產孢量與菌株平板培養表型有一定關系，產孢量較高的菌株均屬于Ⅰ型，以Ⅰ型菌株群體平均產孢量顯著高于Ⅱ型、Ⅲ型。相關性分析結果表明，菌株產孢量與其菌落生長速率無相關性（r =0.0159，P =0.9456 gt; 0.05）。菌株產孢量與菌株地方來源無關。

2.4 菌株致病力

從表3可見，不同菌株致病力差異極大，有致病力的菌株13個，占61.90%（分屬Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型），無致病力的菌株8個，占38.10%（分屬Ⅱ型、Ⅲ型）；無菌PDA對照未見病斑（圖2）。在有致病力的菌株中，以P-1（Ⅰ型）和YL3（Ⅲ型）菌株致病力最強，接種點產生的病斑直徑分別為12.96 mm和12.50 mm，明顯高于其他菌株接種點的病斑直徑。在表型Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型三種類型群體中，有致病力菌株分別占100%、42.86%和33.33%，病斑直徑平均值以Ⅰ型最高，但與Ⅱ型和Ⅲ型相比無顯著性差異。

相關性分析結果表明，菌株致病力（接種病斑直徑）與其菌落生長速率以及產孢量之間無顯著相關，相關系數值分別為r=0.2638（P=0.2480gt;0.05）和 r=0.2850（P=0.2105gt;0.05）。菌株致病力與菌株地方來源無關。

3 小結與討論

本研究結果表明，來自西藏墨脫地區不同地方的21個枇杷新擬盤多毛孢菌在菌落生長速率、培養表型特征、產孢量和致病力上出現了明顯的分化。在PDA平板上培養5 d，菌株生長速率最大值和最小值相差1.23倍。培養12 d，培養基中黑色粒點（分生孢子盤）著生數量出現高（Ⅰ型）、中（Ⅱ型）和低（Ⅲ型）三種菌落表型。供試菌株群體中大多數菌株產孢能力較強，以Ⅰ型菌株產孢量最高、Ⅱ型次之，表明通過菌株在培養基上著生黑色分生孢子盤的密度可大致判別菌株的產孢能力，而后期研究發現各菌株在PDA平板上培養的菌落表型特征及其產孢能力，在繼代培養多代后仍可穩定遺傳。

致病力測定發現，有致病力菌株占多數，在產孢量最高的Ⅰ型群體中，各菌株均有致病力，但其致病力存在較大差異。相關性分析發現，菌株致病力與其菌落生長速率、產孢量無顯著相關，如致病力較強的菌株P-1、YL3產孢量處于中等和低水平，而產孢量高的菌株YL2-2和DT-4則致病力中等，病菌致病過程中菌絲可能起著重要的侵染作用。病菌致病力與菌株來源的不同地方、果園新舊類型無關。綜上而言該病菌群體流行的生物學特性復雜多樣。

當前生產上種植的枇杷品種對葉斑病抗性較差，隨著枇杷種植面積的擴大和種植年限的延長，枇杷葉斑病的發生有加重的趨勢［10］。參照2014年以來類擬盤多毛孢菌新的國際統一鑒定分類標準［11］，我們發現西藏墨脫地區流行的枇杷葉斑病病原菌為新擬盤多毛孢菌Neopestalotiopsis sp.。目前由該病原菌引起的枇杷葉斑病在當地雖尚未造成大面積嚴重危害，但在病菌群體中出現了致病力、產孢能力強的菌株，病害具有潛在暴發流行風險性，生產上應密切關注該地區枇杷葉斑病的發生情況，加強病害發生規律的研究，在適當條件下采取必要措施（如農業和生物防治等）以延緩病害的發生和為害。

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