鐵皮石斛DobHLH51基因克隆及表達特性分析

關鍵詞：鐵皮石斛；bHLH轉錄因子；DobHLH51基因；生物信息學分析；非生物脅迫；表達特性分析

鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Mi-go）是蘭科（Orchidaceae）石斛屬（Dendrobium）多年生附生草本植物，是一種重要的藥用資源，在我國已有兩千多年的藥用歷史，早在東漢末年《神農本草經》中就有記載并被奉為“上品”。因具有“滋陰清熱、益胃生津”之功效，鐵皮石斛歷來被視為石斛中的瑰寶。現代藥理學分析表明，鐵皮石斛具有調節免疫力、降血糖、抗氧化、抗腫瘤、降血脂、抗衰老、對胃腸道炎癥有療效等較高的藥用和保健價值。鐵皮石斛的野生資源多分布于東亞、東南亞、澳大利亞等氣候溫暖濕潤的國家或地區，在我國則主要分布在浙江、云南、貴州、廣東等地。野生鐵皮石斛繁育率低，加之過度采挖和生態環境的惡化，野生資源受到嚴重破壞：人工種植雖然解決了野生石斛資源稀缺的問題，但由于盲目引種導致的種苗混雜以及種植技術不規范等，其品質難以保證。因此，培育鐵皮石斛優良種質對保障中藥材原料及品質、確保臨床療效和用藥安全至關重要。

bHLH （basic/helix-loop-helix）家族是植物中第二大類轉錄因子家族，其結構域均由60個氨基酸組成，包含兩個高度保守且功能不同的保守區域，分別位于N端和C端。其中，N端的由13～17個親水性堿性氨基酸組成的堿性區域可以特異地與DNA序列結合，進而參與調控很多重要的轉錄過程：C端的疏水性堿性氨基酸組成螺旋一環一螺旋（HLH）區域，并通過與其他蛋白的疏水性氨基酸結合形成同源或異源二聚體調控下游基因表達。另外，這兩個結構域之間還存在著相互聯系和相互作用，共同調節細胞中許多重要基因的表達，如植物開花、種子休眠和根毛發育等的調控基因。

bHLH家族成員的作用廣泛而復雜，在植物次生代謝調節過程中也起到非常重要的作用。例如，水仙花（Chinese narcLssus）NtbHLH1與Nt-MYB6相互作用能夠直接促進花青素的生物合成：Aa6119和Aa7162作為典型的黃花蒿（Ar-temzsza annual）bHLH轉錄因子，通過兩種機制協同并正向調控青蒿素在黃花蒿中的生物合成，一種是通過Aa6119與ADS啟動子的直接結合來促進ADS基因的轉錄激活，另一種是通過Aa6119與Aa7162形成異源二聚體協同激活青蒿素生物合成基因和毛狀體發育基因的表達。此外，bHLH家族成員與植物響應非生物脅迫（如低溫、干旱等）有關，當植物感受到外界環境變化時，會將這種變化通過信號通路向下游傳導，從而激發非生物脅迫響應相關基因的表達，提高對環境的適應能力。如花生（Arachis hypogaea）Ah-bHLH112基因的過表達提高了同源轉基因植株幼苗期和成株期的抗旱能力，推測AhbHLH112可能通過增強活性氧的清除能力，調控過氧化物酶（POD）介導的H202穩態，進而參與ABA依賴的應激反應途徑，在干旱脅迫響應中起積極作用；三葉橙（Trifoliate orange）的PtrbHLH66基因在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中的過表達促進了轉基因植株的種子萌發和根系生長，提高了脯氨酸和ABA含量以及抗氧化酶活性，降低了丙二醛（MDA）和活性氧（ROS）的積累，進而增強了轉基因擬南芥的抗旱性；水稻（Oryza sativa）的OsbHLH57基因通過正向調控海藻糖合成、ROS代謝和CBFs/DREBs -依賴性途徑提高水稻的耐寒性；在擬南芥中過表達仙人掌（FagopyrumtatarLcum）的FtbHLH2基因，能夠顯著增強轉基因擬南芥的抗寒能力。可見，bHLH轉錄因子在植物非生物脅迫應答中發揮重要作用，深入研究bHLH基因功能及其表達調控機制對于提高植物的抗逆性、選育優良種質、提高作物產量等方面具有重要意義。

目前，有關鐵皮石斛bHLH轉錄因子的研究報道相對較少。Wang等于2020年從鐵皮石斛基因組中鑒定出98個bHLH基因家族成員，并將其分成18個分支。Yu等克隆了茉莉酸甲酯響應轉錄因子DobHLH4基因，研究發現該轉錄因子能夠調控DoTPS10基因表達進而促進鐵皮石斛花發育過程中芳樟醇的生物合成。張紅瑞和理雅等分別克隆了鐵皮石斛DobHLH96和DcbHLH14基因，并對這兩個基因在非生物脅迫下的表達模式進行了分析，推測這兩個基因可能通過依賴于ABA信號轉導途徑響應低溫和干旱脅迫，但響應機制尚不明確。本研究從鐵皮石斛中克隆了DobHLH51基因編碼區（CDS）序列，并對其進行生物信息學和組織表達特異性分析，明確該基因在低溫、干旱和ABA處理下的表達特性，為深入研究DobHLH51基因功能及其在非生物脅迫應答中的表達調控機制奠定理論基礎，也為通過現代育種技術培育優質抗逆的藥用鐵皮石斛優良品種提供基因資源。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試植物材料為廣東丹霞鐵皮石斛，取樣于韶關市石斛工程開發中心。2x Taq PCR Mix、All-in-One First-Strand Synthesis MasterMix、Fast-Pure Gel DNA Extraction Mini Kit購自北京蘭博利德生物技術有限公司、T4 DNA連接酶、pMD18-T載體、Real Time PCR試劑盒均購自寶生物工程（大連）有限公司；PCR引物合成委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2試驗方法

試驗于2021-2022年在廣東省韶關市韶關學院生物與農業學院分子生物學與基因工程研究室進行。

1.2.1樣品采集與處理鐵皮石斛蒴果消毒后接種于培養基中無菌培養6個月，選取生長狀態良好且長勢一致的幼苗（株高約5～6cm）用于脅迫處理。設低溫處理組（4℃恒溫恒濕培養箱中培養）、模擬干旱處理組（20%PEG-6000澆灌）和ABA處理組（100umol/L ABA澆灌），以未經任何處理的正常條件下的無菌幼苗為對照組。各組均在處理第1、3、6、9、12、24 h取葉組織樣品，經液氮速凍后，保存于-80℃超低溫冰箱，用于脅迫下的基因表達分析。分別采集處于花期的一年生鐵皮石斛的根、莖、葉和花器官，經液氮速凍后超低溫保存，用于基因組織表達分析。每個樣品3次生物學重復。

1.2.2總RNA提取與cDNA合成采用改良的CTAB法分別提取上述樣品總RNA，利用Nan-odrop微量分光光度計檢測其濃度。參照All-in-One First-Strand Synthesis MasterMix劑盒說明書反轉錄合成單鏈cDNA。

1.2.3基因克隆與陽性茵斑鑒定根據NCBI（https：//www.ncbi. nlm. nih. gov）數據庫已知的云南鐵皮石斛bHLH51同源序列（基因ID：LOC110107930）設計DobHLH51基因特異性擴增弓I物（F：5＇-ATGAAGAACTCTTCAAATTTCT -3';R：5'-CTAAACAGACATATTGAAATAG-3'）.PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后，膠回收連接至pMD18-T線性載體，并轉化大腸桿菌（Escherichia coli） DH5a感受態細胞，篩選單克隆菌液進行PCR鑒定后，選取陽性克隆送至委托公司測序驗證。

1.2.4生物信息學分析在NCBI數據庫提交克隆的DobHLH51基因的氨基酸編碼序列，通過Blastp比對篩選相似性高的其他物種同源序列，利用MEGA11軟件的鄰接法（neighbor-joining，NJ）構建系統發育進化樹。利用DNAMAN軟件對DobHLH51及其同源蛋白進行氨基酸多序列比對：利用NCBI-CDD在線預測DobHLH51蛋白結構域；運用ExPASy ProtParam預測蛋白理化性質；使用SOPMA進行蛋白二級結構分析，采用ProtScale進行親疏水性分析：采用SWISS -MOD-EL預測分析蛋白三級結構，采用PDBsum對蛋白三級結構合理性評估；使用TMHMM和SignalP5.0預測蛋白跨膜區和信號肽，利用NetPhos 3.1在線軟件預測蛋白磷酸化位點。通過PlantCARE網站預測啟動子順式作用元件。

1.2.5組織表達特性分析從NCBI數據庫中下載未經任何處理的8個鐵皮石斛組織的表達數據，分別是花蕾、花柱、唇瓣、萼片、葉、莖、灰白根和綠根尖。基因表達量用FPKM（fragments perkilobase per million mapped reads）表示，并用TBtools軟件進行可視化處理，分析DobHLH51基因在不同組織器官中的表達情況。

1.2.6不同脅迫處理下的轉錄組分析將經低溫、干旱或ABA處理不同時間的鐵皮石斛樣品的cDNA模板送至深圳華大基因科技有限公司完成高通量測序。去除所得原始測序序列中的接頭和低質量Rawreads．以保證信息分析質量，最終得到Cleanreads；利用Qubit 2.0將Clean reads與鐵皮石斛基因組參考序列進行比對，并使用Cufflinks進行組裝從而獲得轉錄組數據，基因表達量以FPKM表示，分析鐵皮石斛DobHLH51基因在低溫、干旱和外源ABA處理下的表達模式。

1.3數據處理與分析

采用WPS 2019軟件對數據進行處理，使用SPSS21.0進行統計分析，用Duncan's法進行多重比較，使用GraphPad Prism 9.5軟件作圖。

2結果與分析

2.1DobHLH51基因克隆與序列分析

由圖1、圖2可見，以廣東丹霞鐵皮石斛葉組織cDNA為模板，利用特異性引物進行PCR擴增，克隆到目的條帶。測序獲得DobHLH51基因CDS序列全長為768bp，編碼255個氨基酸。與參考序列對比，共有13個堿基差異，包括5個同義替換、5個非同義替換和3個堿基缺失。基因結構和染色體定位結果顯示．DobHLH51基因定位于2號染色體，含有2個外顯子和1個內含子。

2.2DobHLH51蛋白生物信息學分析

蛋白結構分析結果顯示，DobHLH51蛋白含有bHLH家族保守結構域（cl00081）和ACT結構域（cd04873），屬于bHLH轉錄因子亞家族（圖3A）；DobHLH51分子式為相對分子量為28.03kDa，理論等電點為9.71，不穩定指數達58.01，在第27位亮氨酸（Leu）處具有親水性最大值（1.567），在第74位精氨酸（Arg）處具有親水性最小值（-3.033），親水性平均值為-0.334（圖3B），說明DobHLH51屬于親水性不穩定蛋白。DobHLH51蛋白二級結構由41.57%a-螺旋、1.96%折疊、11.76%延伸鏈和44.71%無規則卷曲組成（圖3C），主要以a-螺旋和無規則卷曲為主；其三級結構（圖3D）與墨蘭bHLH30轉錄因子相似度高達81.82%，且該模型符合立體化學的規則，蛋白構象合理可靠（圖3E）。此外，DobHLH51蛋白無信號肽和跨膜結構區；但含有52個蛋白磷酸化位點，其中包括38個絲氨酸（Ser）、12個蘇氨酸（Thr）及2個酪氨酸（Tyr）位點（圖4）。

2.3DobHLH51蛋白的同源性和系統發育分析

以DobHLH51蛋白為目的序列，在NCBI數據庫中篩選出9個不同物種的同源性較高的序列進行比對分析，其中同源性最高的是黃石斛（Den-drobium catenaturn）bHLH蛋白，相似度為97.66%；其次是金釵石斛（Dendrobium nobile）和鼓槌石斛（Dendrobium chrysotoxum）的bHLH蛋白，相似度分別為96.47%和94.12%。多重序列比對結果（圖5）顯示，DobHLH51氨基酸序列與其他物種bHLH蛋白的氨基酸序列同源性較高，均在N端第56～114個氨基酸殘基位置含有bHLH蛋白結構域。進化樹分析結果（圖6）顯示，DobHLH51與黃石斛和金釵石斛bHLH的聚類關系最近，與同源序列比對分析結果一致。

2.4DobHLH51基因組織表達特性分析

轉錄組分析結果（圖7A）表明，DobHLH51基因在鐵皮石斛不同組織器官中的相對表達量存在明顯差異，在莖中的相對表達量最高，在根組織（綠根尖和灰白根）中的表達量次之，在葉中的表達量最低。qRT-PCR分析結果（圖7B）進一步驗證了DobHLH51基因在鐵皮石斛不同組織中的表達存在差異，同樣以莖中的表達量最高，是葉的3.45倍：其次是根中的，相對表達量是葉的1.6倍；在花中的表達量最低。推測該基因可能在鐵皮石斛莖的生長發育中發揮著重要的調控作用。

2.5DobHLH51在低溫、干旱及ABA處理下的表達特性分析

PlantCARE分析顯示，DobHLH51基因起始密碼子上游2kb啟動子中含有脫水、干旱、低溫及ABA響應等順式作用元件（表1），因此，對DobHLH51基因在低溫、干旱和ABA處理下的表達特性進行分析。轉錄組分析結果（圖8）顯示，DobHLH51基因表達量對3種處理的響應整體上均隨著時間的延長呈現先升高后下降趨勢，其中低溫和干旱處理12h表達量達到最高，而ABA處理6h表達量就達到峰值，表明DobHLH51基因明顯受到低溫、干旱和ABA誘導，提示該基因可能在非生物脅迫響應過程中發揮重要功能。qRT-PCR分析結果（圖9）進一步驗證了DobHLH51基因在低溫、干旱和ABA處理下均可被誘導上調表達，其中低溫處理后DobHLH51表達量先下降后升高，處理24h達到峰值，是處理前的43倍：干旱處理后DobHLH51表達量持續升高，處理12h達到最高值，是處理前的5.3倍：ABA處理6h DobHLH51表達量最高，是處理前的19.4倍。

3討論與結論

bHLH家族作為植物第二大類轉錄因子，已在多種植物中被鑒定和克隆出來，并借助擬南芥、水稻等模式植物進行了功能研究，發現bHLH轉錄因子在植物生長發育和非生物脅迫響應過程中發揮著重要的調控作用。鐵皮石斛中共鑒定出98個bHLH基因家族成員，但對其響應非生物脅迫方面的作用及機制鮮少報道。本研究克隆了鐵皮石斛DobHLH51基因，其CDS全長768bp，編碼255個氨基酸，除含有bHLH保守結構域外，還具有ACT結構域，該結構域能夠結合特定的小分子配體來提供變構調節，以發揮傳感器蛋白功能。DobHLH51為親水性不穩定蛋白，其三級結構與墨蘭bHLH30同源性高達81.82%，且在進化上與黃石斛和金釵石斛bHLH親緣關系最近，表明DobHLH51蛋白序列和結構在蘭科植物中進化相對保守。此外，DobHLH51肽鏈中含有52個磷酸化位點，其中38個Ser位點，推測該蛋白發生磷酸化時可能以Ser磷酸化為主，從而在多種生物學進程和分子功能上發揮著重要的調控作用。

以往的研究顯示，bHLH轉錄因子在植物不同發育日寸期和不同組織器官中的表達具有日寸空特性，對植物的形態建成和生長發育起著重要作用。本研究克隆的DobHLH51基因在鐵皮石斛不同組織器官中的表達水平也存在明顯差異，在莖中的表達量最高，提示該基因在鐵皮石斛營養器官形成、養分吸收和運輸等過程中發揮重要功能。此外，bHLH基因及其參與的信號通路在植物響應低溫、干旱、高鹽等脅迫時發揮重要調控作用。如葡萄（Vitis vinifera）VvbHLH1通過增加轉基因擬南芥中黃酮類化合物的積累并增強其ABA信號傳導，提高了轉基因植株對非生物脅迫的耐受性；密羅木（Myrothamnus flabellifolia）MfbHLH38基因通過依賴于ABA的信號途徑提高保水能力、調節滲透平衡、減輕脅迫引起的氧化損傷等以增強轉基因擬南芥植株對干旱和鹽脅迫的耐受性。本研究發現，DobHLH51基因啟動子區含有低溫、干旱和脫水響應以及ABA應答元件，且可被低溫、干旱和ABA處理誘導顯著上調表達：但其在低溫和干旱脅迫下的表達模式一致，與ABA誘導下表達模式不同，提示該基因響應低溫和干旱脅迫可能通過不依賴于ABA的信號轉導途徑，但具體的調控機制尚需進一步研究。

值得關注的是．有研究發現bHLH轉錄因子主要通過ICE-CBF途徑結合并激活靶基因的表達，提高活性氧清除能力及聯合光信號、激素信號等機制來增強植物的抗寒能力。本研究克隆的DobHLH51啟動子中含有能夠被CBFs特異結合的LTR元件，該元件是植物低溫響應過程中的關鍵因子，推測DobHLH51基因可能通過CBFs介導的ICE-CBF信號途徑參與低溫應答過程，但具體響應機制尚未可知。因此，需要對DobHLH51基因響應干旱和低溫脅迫的分子調控機制進行深入研究。今后本課題組將通過基因過表達和基因敲除實驗對DobHLH51基因的功能做進一步分析和驗證，以期為闡明該基因在鐵皮石斛抗逆中的作用機制奠定基礎。