聚焦關鍵能力,優化高考復習
——以高中生物學“PCR引物”試題歸類分析為例

覃寶雄 潘 冬

(柳州高級中學 廣西柳州 545006)

PCR 技術應用廣泛,近年各省市的高考題與模擬題出現了大量以“PCR引物”為背景的試題,不僅考查PCR 實驗本身,還深入到通過PCR 技術解決基因工程操作中遇到的實際問題,如給目的基因加上限制酶識別序列或制備融合基因等。但高中生物學教材對引物的概念、利用引物的必要性、如何設計或選擇引物、如何利用引物初步判斷擴增的DNA 是目的片段、引物與退火溫度的關系等問題描述較少。下面通過對歷年高考試題、模擬試題進行歸類與分析,鞏固基礎知識,培養學生關鍵能力,為教師教學提供參考。

1 引物的設計

【例1】(2017·江蘇)設計引物時需要避免引物之間形成________,而造成引物自連。

參考答案:堿基互補配對

分析:DNA 聚合酶只能延長已存在的DNA 片段。體內DNA 的復制先由引發酶在DNA 模板上合成一段RNA 鏈,接著由DNA 聚合酶從RNA 引物3'端合成DNA 子鏈。體外擴增DNA 需要在PCR 體系中加入DNA 引物。單條引物內或兩條引物間不應含有4 bp 以上的互補序列。

教學建議:教師可以通過試題提醒學生,引物的設計除了滿足堿基互補配對這一基本要求外,還要考慮其他方面的限制因素,如引物之間的互補、引物序列與退火溫度等。

2 引物的選擇

【例2】(原創)圖1 為X 蛋白的部分基因序列,所示序列為引物結合的部分,據圖分析:

圖1 X 蛋白的部分基因序列

擴增X 蛋白基因所需的引物序列是________________________;________________________。

參考答案:5'-ATGCCGTAAGTCCTAC-3'; 5'-TGATCTACGGCTTACA-3'

分析:DNA 子鏈的合成不能從無到有進行,DNA聚合酶只能催化脫氧核糖核苷酸加到DNA 子鏈的3'端上。分析模板鏈的5'端及3'端,結合DNA 雙鏈反向平行的特點,推測引物的延伸方向。書寫引物序列,一般從引物的5'端向3'端書寫,避免誤判。圖中位于上方的模板鏈5'端磷酸基團在左,3'端羥基在右側,可知與上方模板鏈配對的引物5'端在右側,3'端在左側,引物序列為“5'-TGATCTACGGCTTACA-3'”。同理推測另外一條引物的序列。

教學建議:教師可以通過試題提醒學生熟練掌握DNA5'端與3'端的表現形式,引導學生結合DNA 反向平行的特點解題。

3 引物的數量計算

一個DNA 分子n 次擴增得到DNA 分子2n個,DNA 單鏈2n+1條,需消耗引物的數量為2n+1-2,每種引物需要的條數是(2n+1-2)/2,即2n-1。如圖2所示,教師可引導學生分析引物與DNA 分子中間片段結合的情況,當第三輪PCR 循環結束時出現兩條單鏈等長的目的片段。該情境可延伸出另外兩種情況:(1)若一條引物從DNA 分子端部結合,另一條引物從DNA 分子中間部位結合,則第二輪PCR 循環結束時出現兩條單鏈等長的目的片段;(2)若兩條引物均從DNA 分子端部結合,則第一輪PCR 循環結束時出現兩條單鏈等長的目的片段。

圖2 引物與DNA 分子中間片段結合時的情況

【例3】(原創)已知引物1 及引物2 之間的序列為目的序列,若引物與DNA 的結合位點如圖3所示,在第________輪循環產物中開始出現兩條單鏈等長的目的片段。

圖3 引物與DNA 的結合位點圖

參考答案:2

分析:題中的引物1 不在DNA 片段的端點,第1輪循環后,得到的兩個DNA 分子中有一個DNA 分子兩條單鏈等長并長于目的片段,另一個DNA 分子兩條脫氧核苷酸鏈不等長。通過繪圖可推知,在第二輪循環產物中出現兩條脫氧核苷酸鏈等長的目的片段。

教學建議:教師可以通過試題提醒學生做題不能死記硬背,應該結合圖形具體問題具體分析。

4 引物擴增片段長度計算

【例4】(2022·北京楊鎮第一中學模擬)若單菌落擴增后的DNA 樣品電泳結果如圖4,則圖5 中對應泳道1 和泳道2 的引物組合分別為_________。(填序號)

圖4 單菌落擴增后的DNA 樣品電泳結果圖

圖5 引物圖

參考答案:引物3 和引物4;引物1 和引物2

分析:為判斷PCR 擴增所得DNA 是否為目的片段,可用標準品(Marker)與PCR 產物同時電泳,用染料對DNA 進行染色后再用儀器檢測PCR 產物及標準品位置。通過對比PCR 產物與標準品相對位置,推斷實驗擴增目的片段是否成功。泳道1 和泳道2的條帶分別為541 bp 和1 076 bp,因此,應選擇兩對方向相反的引物,其中引物3 和引物4 擴增的堿基對長度是473+68=541 bp,引物1 和引物2 擴增的堿基對長度是(2 073-473-590)+66=1 076 bp,故對應泳道1和泳道2 的引物組合分別為引物3 和4、引物1 和2。

教學建議:部分學校因實驗條件限制不能進行PCR 擴增及DNA 瓊脂糖凝膠電泳實驗,教師可通過視頻展示PCR 與DNA 電泳實驗過程,解說兩個實驗之間的聯系。

5 引物與退火溫度

【例5】(2021·湖北)某實驗利用PCR 技術獲取目的基因,實驗結果顯示,除了目的基因條帶(引物與模板完全配對)外,還有2 條非特異條帶(引物和模板不完全配對)。為了減少反應中非特異條帶的產生,以下措施中有效的是

A.增加模板DNA 的量 B.延長熱變性的時間

C.延長延伸的時間 D.提高復性的溫度

參考答案:D

分析:DNA 的濃度越大,復性越快。降低退火溫度可提高擴增產量,但引物與模板間錯配現象會增多,導致非特異性擴增上升;提高退火溫度可以減少引物與模板鏈間的非特異性結合,提高PCR 反應的特異性,但擴增效率下降。在教學過程中,會有學生對PCR 的退火過程產生疑問,如“退火過程中已經解旋的兩種模板鏈是否會發生模板鏈之間的互補配對?”教師應引導學生從模板鏈濃度和引物濃度兩方面思考。實驗中引物濃度遠高于實驗初始模板DNA的濃度,因此兩種DNA 模板鏈之間堿基互補配對的概率很低。

教學建議:教師應該在教學中適當拓展PCR 實驗每個步驟的注意事項,幫助學生理解不同PCR 退火溫度及其他參數設置的差異。

6 PCR 在基因工程中的應用

6.1 添加酶切位點,構建基因表達載體

【例6】(2020·江蘇揚州中學月考)用PCR 技術將DNA 分子中的A1片段進行擴增,設計了引物Ⅰ、Ⅱ,其連接部位如圖6所示,X 為某限制酶識別序列且X 是引物Ⅱ上的一部分。擴增后得到的絕大部分DNA 片段是

圖6 引物與DNA 片段結合圖

參考答案:D

分析:將真核生物基因導入原核生物質粒中構建基因表達載體,常需要在真核生物目的片段兩端加上限制酶識別序列。引物延伸從3'端開始,一般不對引物3'端進行修飾,限制酶切割位點應加在5'端。先用限制酶處理原核生物的質粒與改造后的目的基因,用DNA 連接酶將兩者連接構建基因表達載體,導入原核細胞中表達蛋白質。如圖6所示,在第一次PCR 循環結束后,得到以引物Ⅱ延長得到的單鏈。在往后的PCR 循環中,以引物Ⅱ所形成的單鏈為模板在引物Ⅰ的作用下合成DNA 時,引物Ⅱ上的X 片段也被作為模板合成子鏈。因為兩條引物間的片段以指數倍數擴增,實驗結束得到的絕大部分DNA 片段是選項中的D。

教學建議:教師利用繪圖,將前兩輪PCR 結束后的產物用圖形直觀地呈現出來,并讓學生思考基因工程中可能遇到的實際問題——天然基因可能不包含與質粒相同的限制酶識別序列。通過學習學生認識到在基因工程中需要研究人員為目的基因添加與質粒相同的限制酶識別序列,為構建基因表達載體提供基礎。

6.2 定點突變,改造蛋白質結構與功能

【例7】(2022·山東泰安市模擬)研究人員發現若將蛛絲蛋白31 號位的色氨酸替換為酪氨酸,蛛絲韌性提高50%,因而設計了與蛛絲蛋白基因結合的兩對引物(引物B 和C 中都替換了一個堿基),并按圖7的方式依次進行4 次PCR 擴增,以得到新的蛛絲蛋白基因。

圖7 PCR 擴增圖

(1)如圖7所示的4 次PCR 都涉及到引物的選擇,其中PCR 1 選擇的引物是________,PCR 4 選擇的引物是________。(填A、B、C、D)

參考答案:引物A、B;引物A、D

分析:基因工程在原則上只能生產天然蛋白質,天然蛋白質的結構和功能可滿足特定物種生存需要,卻不一定符合人們生產和生活的需要。定點突變目的基因可在細胞中表達更優的蛋白質。在蛋白質工程中,由于基因決定蛋白質,因此對蛋白質空間結構進行設計改造需要通過改造基因來達成。如圖7所示,用引物A 和突變引物B 進行PCR 1,在另外的PCR 體系中用突變引物C 和引物D 進行PCR 2,將兩次PCR 產物混合作為模板,用引物A 和引物D 進行PCR 3 和PCR 4,最終產物即為引入突變位點的DNA序列。

教學建議:在人教版《選擇性必修3·生物技術與工程》的“基因工程”這一章節中,教材先分析了基因工程原理和操作,再分析蛋白質工程的目的和流程。通過PCR 技術,我們可以把基因工程和蛋白質工程有機結合,通過對目的基因的定點突變,實現改造天然蛋白質。

【例8】(2021·天津)乳酸菌是乳酸的傳統生產菌,但耐酸能力較差,影響產量。釀酒酵母耐酸能力較強,但不產生乳酸。研究者將乳酸菌的乳酸脫氫酶基因(LDH)導入釀酒酵母,獲得能產生乳酸的工程菌株。圖8 為構建表達載體時所需的關鍵條件。

圖8 構建表達載體關鍵條件圖示

(1)獲得轉基因釀酒酵母菌株的過程如下:

①設計引物擴增乳酸脫氫酶編碼序列。

為使擴增出的序列中編碼起始密碼子的序列由原核生物偏好的GTG 轉變為真核生物偏好的ATG,且能通過雙酶切以正確方向插入質粒,需設計引物1 和2。其中引物1 的5'端序列應考慮________和________。

參考答案:包含BamHI 的識別序列;將GTG 改為ATG

分析:定點突變PCR 不僅能突變目的基因的外顯子序列,還能突變起始密碼子對應的DNA 序列,使原核生物基因突變后轉錄的起始密碼子具有真核生物的偏好性,使基因在真核生物中高效表達。酵母菌為真菌,編碼起始密碼子的序列為真核生物偏好的ATG,原有引物1 序列為GTG,因此將引物1 的5'端序列中GTG 改為ATG。題干中還要求目的基因“能通過雙酶切以正確的方向插入質粒”,由圖中釀酒酵母基因啟動子的方向及兩種限制酶BamH I 和XbaI 的順序可知,在引物1 的5'端要包含BamH I 的識別序列。

教學建議:基因工程的實際操作會涉及到對目的基因和質粒的改造,試題以科技論文為背景并附有圖形,信息量較大。教師可以讓學生嘗試提取題目中的信息,并提出解決問題的方案。

6.3 設計鏈接引物,構造融合基因

【例9】(2018·天津靜海一中)融合PCR 技術是采用具有互補末端的引物,將不同來源的擴增片段連接起來構建融合基因的方法,其過程如下圖9所示。

圖9 融合PCR 技術過程示意圖

(1)若通過融合PCR 技術將啟動子、目的基因、終止子拼接起來,需要設計________種引物,其中能夠起著“搭橋”作用的引物有________種。

參考答案:6;4

分析:單種蛋白質功能有限,通過融合基因編碼“目的蛋白—特定蛋白”融合蛋白可實現多種應用,如借助熒光蛋白對目的蛋白進行示蹤。利用PCR 技術將兩個基因連接為一個融合基因需要設計兩對引物。如圖9所示,第1 階段中PCR 至少分別進行2 次循環,才能獲得雙鏈等長的含引物2、含引物3 的DNA,第二階段中因引物2 與引物3“具有互補末端”,使得兩種DNA 能成功“搭橋”連接起來,再經PCR 1、PCR 2 形成融合基因。通常,連接幾種目的片段,則需要設計幾對相應的引物。若通過融合PCR 技術將啟動子、目的基因、終止子拼接起來,需要設計3 對引物,其中能夠起著“搭橋”作用的引物有2 對。

教學建議:通過PCR 構建融合基因的試題具有一定的難度,可以用于在二輪的專題復習中開拓學生視野,培養學生的推理能力。

7 總結

教師可以借助上述典型例題先歸納基礎知識,加深學生對基本原理的理解,例如引物5'端與模板鏈3'端堿基互補配對,子鏈的合成方向由5'端向3'端進行等。然后,教師進而適度拓展與延伸,引導學生分析引物的相關計算、PCR 退火溫度與特異擴增的關系等問題。最后,教師可以分析PCR 在基因工程中的應用,如通過給目的基因加上與質粒相同的限制酶識別序列,使目的基因與質粒正確連接;通過對目的基因進行改造使宿主細胞表達的目的蛋白品質更好;通過給目的基因加上宿主細胞偏好的轉錄或者翻譯的序列,使目的蛋白高效表達。教師借助由淺入深的試題的歸類與分析,讓學生理解PCR 不僅用于擴增目的基因,還能解決基因工程遇到的實際問題,考察學生的科學思維,培養學生的關鍵能力。此外,教師在二輪復習及模擬題命制中,可以注意將前沿科技在高中生物學中適當延伸,提升學生在以科研為背景的試題中獲取信息并解決問題的能力。