基于網絡藥理學分析丹參抑制FASN表達治療膀胱癌的分子機制研究

桂志明 黃健 李世豪 吳昊開 汪前亮

廣東醫科大學附屬醫院泌尿外科，湛江 524001

膀胱癌作為泌尿系最常見的惡性腫瘤，位居全球惡性腫瘤發病率第9 位及病死率第13 位［1］，其極易復發并伴隨著較差的預后，使臨床治療困難。目前，針對膀胱癌尚無較好的藥物治療策略，仍以手術切除為主，但淺表性膀胱癌電切術后復發率高達50%～70%，其中10%～20%患者可進一步發展為浸潤性膀胱癌［2］。但傳統意義上的放化療則往往治療效果不佳，不論是針對膀胱癌細胞的腫瘤殺傷指數偏低，或是治療不良反應偏大，使這種治療手段無法在臨床獲益［3］。基于這一現狀，研究新的治療策略，開發新的治療藥物，提高臨床治療效果，已極為迫切。目前，臨床上藥物治療膀胱癌除了絲裂霉素C 及表柔比星等化療藥物外，還有一些較好的治療藥物。研究發現，卡介苗可通過刺激患者免疫進而抑制腫瘤進展，是非肌層浸潤性膀胱癌最有效的治療方法，此外，部分中藥及腺相關病毒也在近年來展現出足夠的治療潛力，有望為膀胱癌的治療提供助力［4］。尤其是中藥，在近年來，逐漸在腫瘤治療領域展露光彩，但因缺乏系統性的研究框架，未能深入揭示中藥治療腫瘤的功能機制。較單靶點藥物而言，傳統中藥（TCM）具有多成分、多靶點、多途徑協同作用的強大優勢［5］。此外，與化學合成的藥物相比，TCM 以其天然產物的身份往往更易于人體吸收，且在很大程度上對機體是無害的，這極大彌補了其他治療藥物不良反應大的巨大缺陷［6］。丹參作為著名藥材應用于臨床治療中，尤其在心腦血管方面具備悠久的使用歷史，療效顯著［7］。隨著研究深入，丹參在癌癥治療中的作用日益凸顯，大量文獻對此進行了報道［8-10］，但并未系統闡明丹參在膀胱癌治療中的作用機制。隨著生物大數據的精確性不斷提高以及生物信息學、系統生物學與藥理學的不斷融合，基于網絡藥理學揭示中藥有效成分及精準靶點的Network 模式已被認為是一種極具潛力的研究方法［11-15］。本研究基于這一方法，深入分析丹參的有效活性成分及其潛在分子靶點，結合膀胱癌患者的癌癥基因圖譜（TCGA）數據集，進行預后及風險回歸分析等，確定其治療靶點，并在體外細胞中進行實驗研究，為丹參治療膀胱癌提供詳細的分子機制基礎，為臨床應用提供實驗依據。

材料與方法

1.材料

膀胱癌細胞系：5637、T24、J82、UMUC3（ATCC 細胞庫）；正常膀胱上皮細胞：SV-HUC-1（ATCC 細胞庫）。抗體：脂肪酸合成酶（FASN）（Proteintech；10624-2-AP）。丹參提取物：扶風斯諾特生物科技有限公司購買。培養液：1640培養基（GIBCO）；DMEN 基礎培養基（GIBCO）；MEM 培養基（GIBCO）；FBS（胎牛血清，依客賽）；L-Glutamine 200mM（100X）（GIBCO）。耗材：培養皿（耐思NEST），Transwell 小室（REF，353097）。研究時間：2022 年1 月至2023年6月。

2.方法

2.1.網絡藥理學篩選丹參有效成分及分子靶點 基于中藥系統藥理學數據庫分析平臺（TCMSP）（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）獲得丹參的成分信息，根據生物利用度（OB）≥30%，類藥性指數（DL）≥0.18 的標準篩選有效藥物成分，通過Swiss Target Prediction 數據庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/）收集有效成分的治療靶點并在Cytoscape軟件中進行可視化分析。

2.2.基因本體論（GO）與京都基因與基因組百科全書（KEGG）功能富集分析 通過WebGestalt 數據庫（https：//www.webgestalt.org/）對這些分子靶點進行GO 與KEGG 功能分析，并對前十位的通路進行可視化。

2.3.TCGA膀胱癌數據集篩選 從TCGA數據集（https：//tcga-data.nci.nih.GOv/tcga/）下載截至2023年7月11日前膀胱癌患者的RNA-seq測序數據及臨床資料，包括生存狀態等臨床信息，納入上述獲得的藥物分子靶點進行預后分析（P＜0.05），篩選存在預后價值的丹參-疾病基因，同時應用“limma”包分析這些基因在癌與癌旁組織中的差異表達（P＜0.05）。

2.4.風險回歸模型構建 本研究納入TCGA 數據集共408 個膀胱癌樣本，隨機分為訓練集和測試集，各204 個。訓練集用于構建丹參-疾病基因的風險回歸模型，測試集用于驗證所建立的模型。基于先前獲得的44 個具有預后價值的靶點，使用R 軟件包“glmnet”進行lasso-Cox 回歸分析。進而從TCGA 數據集中篩選出18 個與肌層浸潤性膀胱癌（MIBC）患者的總生存率顯著相關的丹參-疾病基因，基于這些基因成功建立風險模型。使用以下公式計算風險評分：風險評分=coe（fRNA1）×expr（RNA1）+coe（fRNA2）×expr（RNA2）+……+coe（fRNA18）×expr（RNA18），coef 表示與存活相關的RNA 系數，expr（RNA）表示RNA 的表達。根據中位風險評分建立包括低風險組和高風險組的亞組。

2.5.關鍵蛋白FASN 驗證 在獲得風險基因后，進一步結合其風險系數，基因表達水平與預后信息進行篩選，確定FASN 是最顯著高風險基因后，在常見膀胱癌細胞系中進行Western blot 蛋白檢測：細胞培養至80%時停止生長，用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）清洗后加入RIPA裂解液進行細胞蛋白提取。以7.5%的SDS-PAGE 分離膠進行電泳，轉膜后加入標記FASN 和GAPDH 抗體在4 ℃冰箱孵育過夜，TBST 清洗聚偏二氟乙烯（PVDF）膜后再加入對應的二抗（Rabbit）室溫下孵育1 h，TBST清洗后借助ECL顯影液進行顯影。

2.6. 細胞分組和處理 取生長至對數期的J82 細胞，待細胞生長至70%時進行處理，分別加入丹參提取物（1 mg/ml）與PBS（陰性對照）進行處理。

2.7.細胞增殖、侵襲及遷移能力檢測 細胞增殖：取生長狀態好的細胞進行鋪板（96 孔板），然后加入丹參提取物處理，分別在24 h、48 h、72 h 進行MTT 檢測細胞增殖情況；侵襲：首先將細胞在六孔板中進行鋪板，待細胞生長至70%時進行藥物處理，待細胞長至90%時進行細胞劃痕實驗，觀察細胞橫向遷移能力變化；侵襲：同樣取正常細胞，在細胞長至70%進行藥物處理，待細胞長滿后用胰酶消化，提前在Transwell 小室內部進行基質膠處理，然后在小室內加入5×103個藥物處理過的細胞與正常細胞，待24 h后取出小室以棉球擦除小室內部未穿過的細胞，以結晶紫染色拍照，觀察細胞侵襲能力變化。

3.統計學方法

研究結果采用SPSS 16.0 軟件統計分析，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）進行組間比較。

結果

1.構建丹參-有效成分-靶點網絡

將丹參有效成分及其靶點信息輸入Cytoscape_v3.8.2進行可視化分析，得到藥物-有效成分-靶點的網絡圖，其中丹參有效成分65個，靶點270個（圖1）。

2.丹參靶點的功能富集分析

在獲得丹參靶點信息后，進行GO 與KEGG 功能富集分析，結果顯示其主要富集在氮代謝、膀胱癌、內分泌抵抗、催乳素信號通路、前列腺癌及其他癌癥等通路上，展現出丹參在膀胱癌及其他癌癥中的治療潛力（圖2）。

圖2 丹參有效靶點的GO功能富集分析（A）及KEGG功能富集分析（B）

3.膀胱癌有效靶點預測

將270個藥物靶點輸入膀胱癌TCGA 數據集中（Tumor：408 比Normal：19），結合患者預后信息進行篩選，其中44 個基因在膀胱癌中具有預后價值（P＜0.05），接著基于“limma”R 包分析其在膀胱癌與癌旁之間的表達水平，結果顯示，其中33個基因存在差異表達（圖3）。

圖3 44個基因預后信息（A）及44個基因在膀胱癌與癌旁中的表達水平（B）

4.基于18個基因構建風險回歸模型

研究基于其中的18 個基因在膀胱癌測序數據集中建立風險回歸模型，其測試集（204 例）曲線下面積（AUC）=0.819，驗證集（204 例）AUC=0.661，具備預測價值（圖4）。MAOA、NR1H3、PTPN6、PDE10A、CASP9、POLB及EED是低風險基因，而MMP9、HCAR2、ADRA2C、PSMB5、SUZ12、FASN、MAP2K1、PGR、SLC6A2、HTR2B、ABCC9 則是高風險基因，研究結合患者臨床信息發現，高風險基因在TNM 高等級患者中表達水平更高（圖5）。研究進一步分析這些基因在癌與癌旁間的表達，結果顯示，MAOA 作為低風險基因在癌中顯著低表達，而HCAR2、FASN、MMP9及PSMB5則作為高風險基因在癌中顯著高表達，其中又以FASN系數最高（圖6）。預后信息同樣顯示其預后較差。總生存率：HR=1.66，無復發生存期：HR=2.61，可作為促癌基因進行后續研究分析（圖7）。

圖4 基因構建風險回歸模型。A：10倍交叉驗證的LASSO回歸圖譜；B：18個基因的LASSO系數圖譜；Kaplan-Meier對高風險和低風險人群中MIBC的生存分析（C：測試集：D：驗證集）；風險評分模型ROC（E：測試集：F：驗證集）

圖6 風險基因在癌與癌旁中的表達水平分析

5.丹參可抑制FASN 表達進而抑制膀胱癌細胞增殖侵襲及遷移能力

在常見膀胱癌細胞系及正常膀胱上皮細胞中檢測發現，FASN 在J82 細胞系中顯著高表達，而丹參提取物在10 mg/L 時不影響膀胱上皮細胞生長但可顯著抑制膀胱癌細胞生長，并可抑制其增殖、侵襲及遷移能力（圖8）。

討論

隨著我國對中醫藥發展創新的日益重視，探索中藥在多種疾病尤其是腫瘤領域中的治療效用是重要方向，而科學的研究理念結合先進技術手段可以更深入挖掘其間機制。丹參不僅可作為心腦血管治療藥物，其在腫瘤治療中同樣具備顯著治療作用。Zhou 等［16］研究發現，丹參酮Ⅰ可通過使磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/蛋氨酸合成酶通路失活，進而誘導細胞凋亡和自噬并最終減弱卵巢癌的惡性生物學特性；Chen 等［17］研究顯示，丹參多糖可通過激活Toll樣受體介導的絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和核轉錄因子-κB信號通路進而激活癌癥患者的T細胞免疫，緩解腫瘤患者免疫微環境抑制狀態。Cao等［18］研究同樣顯示，丹參提取物-二氫丹參酮能通過調節胱天蛋白酶與細胞色素C 進而誘導神經膠質瘤細胞的凋亡并抑制其增殖；而在泌尿系惡性腫瘤中，丹參同樣發揮著重要作用。Park 等［19］研究報道，從丹參中分離出來的主要成分-隱丹參酮可通過Bcl-2 和MAPK 調節使DU145 前列腺癌細胞對Fas（APO1/CD95）介導的凋亡敏感。Chen 等［20］研究發現，丹參的水性成分丹酚酸B 可抑制YAP1 和Hippo 信號的激活，從而消除了低剪切應力誘導的腎癌細胞上皮-間質轉化（EMT），并導致N-鈣黏蛋白表達降低，同時下調SNAIL1 和TWIST，并伴有高剪切應力誘發的腎癌細胞凋亡。這些研究均顯示出丹參在腫瘤治療中的潛力，而在膀胱癌中，則分別發現了丹參酮ⅡA 及隱丁胺酮（CTT）均具有治療作用［21-22］。截至目前，其在膀胱癌中的功效及作用機制仍需進一步探討。

本研究基于網絡藥理學分析方法及TCGA 等大數據分析，丹參提取物具備一定的抗癌活性，可通過抑制FASN 的表達進而抑制膀胱癌細胞系的增殖、遷移及侵襲能力。FASN 處于激活狀態時，是一種具有7 種不同催化活性的同型二聚體，可在肝臟中產生脂質后輸出到代謝活躍的組織或儲存在脂肪組織中。免疫組織化學染色表明FASN 水平與乳腺腫瘤大小直接相關［23］，且FASN在肺癌和前列腺癌中高表達，是乳腺癌和前列腺癌的預后不良指標［24-26］。FASN作為癌癥和代謝綜合征診療中的一個潛在靶標已受到越來越多的關注［27-28］。Xiong 等［29］研究發現，FASN 在膀胱癌正常組織和腫瘤組織中表達存在差異，并且與生存相關，可獨立預測MIBC 進展，與免疫細胞浸潤顯著相關，研究進一步發現FASN 低表達的患者對免疫檢查點抑制劑治療反應往往更好。而Deng 等［30］研究發現，二甲雙胍可以靶向Clusterin 進而通過SREBP-1c/FASN 軸調控脂肪生成并抑制膀胱癌細胞生長。這些研究展現出FASN 作為促癌基因在膀胱癌這重要功能。本研究在前期數據分析中顯示，丹參可下游作用于FASN并在實驗中進一步揭示其調控關系，即丹參提取物可抑制FASN表達進而抑制膀胱癌惡性表型。

本研究表明丹參提取物可抑制FASN 表達進而抑制膀胱癌細胞系惡性表型，其有望作為一味中藥應用于臨床上膀胱癌的預防或治療；本研究通過科學嚴謹的研究體系結合大數據挖掘及實驗技術等證明了丹參提取物在膀胱癌治療中的功能機制，同樣為后續藥物研發提供了新的研究策略。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻聲明 桂志明：醞釀和設計試驗，起草文章，獲取研究經費；黃健：分析/解釋數據，統計分析；李世豪：實施研究；吳昊開：分析/解釋數據；汪前亮：采集數據，對文章的知識性內容作批評性審閱，指導