卡巴匹林鈣水分測定法的改進

于曉輝,王 雷,楊 星,馬秋冉

(中國獸醫藥品監察所,北京 100081)

卡巴匹林鈣收載于《中國獸藥典》2020年版一部[1],其中的【水分】項測定方法為:取本品1.0 g,加無水甲醇與二甲基甲酰胺各15 mL,照水分測定法(附錄0832第一法A)測定。按照該方法進行測定時發現,結果平行性差、無法準確評價產品中的水分含量,具體實驗結果見表1。

表1 現行標準方法的測定結果

從表1中的結果得知,采用現行質量標準中的水分測定方法,對同一批卡巴匹林鈣樣品進行測定時,數據的平行性、重復性很差。第一次測定結果中的最大值和最小值的相對偏差高達82%;第二次測定結果中,第三份樣品的儀器測定結果為0.00%,但在實際測定過程中明確觀察到樣品消耗了滴定液,出現0.00%的結果,表明水分測定儀的終點判斷出現了誤差。

水分是卡巴匹林鈣質量控制的重要項目,當其中的水分值超過限度0.2%時,即會造成卡巴匹林鈣加速降解,生成水楊酸等一系列降解雜質,嚴重影響產品的質量[2,3]?，F行質量標準中的方法無法真實反映卡巴匹林鈣中的水分情況,無法保證卡巴匹林鈣質量可控。

為了更好的控制卡巴匹林鈣的質量,我們對現行質量標準中的水分測定法進行了改進。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 701KF卡氏水分滴定儀,瑞士萬通公司;費休氏試液(滴定度1 mg/mL),Honeywell公司;二甲基甲酰胺,Alfa Aesar公司;無水甲醇:Honeywell公司。

1.2 試藥 供試品:共4家企業生產的4批卡巴匹林鈣。

1.3 實驗方法 向滴定杯中分別加入二甲基甲酰胺20 mL、無水甲醇20 mL,取供試品0.1 g,精密稱定,置于滴定杯中,攪拌5分鐘,照水分測定法(附錄0832第一法A)測定。注:連續測定4份樣品后,需更換滴定杯中的溶劑。

2 結果與分析

2.1 溶劑中二甲基甲酰胺與無水甲醇比例的篩選通過前期的實驗研究得知,二甲基甲酰胺-無水甲醇適合作為卡巴匹林鈣水分測定的溶劑。其中,二甲基甲酰胺作為分散劑,起到分散樣品、“釋放”水分的作用,無水甲醇參與滴定反應,起到促進反應順利進行的作用。二者“各司其職”,在一定比例范圍內協同作用,才能得到準確可靠的測定結果。

因此,本研究對二甲基甲酰胺和無水甲醇的比例進行了比較研究,按照1.3中的方法,考察在不同比例的溶劑中,分別攪拌5 min和攪拌10 min測定結果的異同。為保證研究充分、結果可靠,我們將上述過程重復測定,即,每種混合溶劑中,連續測定樣品4份,第一份攪拌5 min、第二份攪拌10 min、第三份攪拌5 min、第四份攪拌10 min。實驗結果見表2。

表2 二甲基甲酰胺-甲醇不同比例時的測定結果

溶劑1:二甲基甲酰胺20 mL、無水甲醇20 mL(1∶1)

溶劑2:二甲基甲酰胺13 mL、無水甲醇27 mL(1∶2)

溶劑3:二甲基甲酰胺27 mL、無水甲醇13 mL(2∶1)

從表2的實驗結果得知,當以溶劑2為溶劑時,攪拌5 min后的測定結果與攪拌10 min后的測定結果存在差異,攪拌10 min后的測定結果高于攪拌5 min后的。這可能是由于該混合溶劑中,二甲基甲酰胺的量較少、分散能力較弱,攪拌5 min不足以充分“釋放”卡巴匹林鈣中的水分。

當以溶劑3為溶劑時,前兩份樣品,即分別攪拌5 min和10 min的測定結果一致;但此后,攪拌5 min和攪拌10 min的測定結果出現差異,并且第三、第四份樣品的測定結果低于第一、第二份樣品的結果。這可能是由于溶劑3中,甲醇量較少,隨著樣品量的增加,參與滴定反應的溶劑量減少,滴定反應無法充分徹底進行,以至于測定兩份樣品后,后續樣品中的水分無法被充分滴定,測定結果偏低。

當以溶劑1,即二甲基甲酰胺-甲醇(1∶1)為溶劑時,實驗結果穩定,平行性良好,攪拌5 min和攪拌10 min的測定結果基本一致,重復測定4份樣品的結果也一致。

上述實驗結果表明,改進后的方法中,二甲基甲酰胺和無水甲醇的比例應為1∶1。

2.2 加入樣品后攪拌時間的選擇 卡巴匹林鈣在二甲基甲酰胺-無水甲醇中的溶解性較差,為保證其在上述溶劑中被充分分散、樣品中的水分被充分“釋放”出來,加入樣品后、開始滴定前應對溶劑杯中的樣品充分攪拌。

本研究按照1.3中的方法,對樣品加入滴定杯后的攪拌時間進行了比較研究,結果見表3。

表3 不同攪拌時間的測定結果

從表3的實驗結果得知,加入樣品后立即滴定(0 min)的水分值明顯低于攪拌一定時間后再滴定的結果;攪拌5 min后再滴定的結果與攪拌10 min、15 min、20 min的結果一致,實驗研究結果表明,攪拌5 min即能將卡巴匹林鈣樣品中的水分充分“釋放”出來。所以,本研究最終選擇加入樣品后攪拌5 min再進行滴定。

2.3 取樣量的選擇 經過前期實驗研究得知,將取樣量降低至0.1 g并以二甲基甲酰胺+無水甲醇為溶劑時,測定結果穩定、平行性良好。為了更好的確定卡巴匹林鈣的取樣量,我們按照1.3中的方法,比較研究了0.05 g、0.1 g和0.2 g三種取樣量,結果見表4。

表4 不同取樣量時的測定結果

從表4的實驗結果得知,當取樣量為0.05 g時,數據的平行性較差,最大值和最小值的相對偏差約為35%。所以,0.05 g不適合作為該方法的取樣量。

當取樣量為0.2 g時,數據的平行性良好,最大值與最小值的相對偏差約為6%。但是,0.2 g取樣量時,一份樣品測定完成后,儀器約需5 min才能達到平衡狀態(condition),這可能是由于取樣量較大,樣品中的水分未能在短時間內被完全滴定,從而造成滴定延遲。

當取樣量為0.1 g時,測定結果穩定,數據平行性良好,最大值與最小值的相對偏差約為4%;一份樣品測定完成后,僅需約1 min,儀器即達到平衡狀態(condition)。所以,本研究最終選擇0.1 g作為改進方法的取樣量。

2.4 連續測定樣品份數驗證 通過前期實驗發現,隨著滴定杯中樣品量的逐漸增加,連續測定多份樣品時,結果的平行性和準確性有變差的趨勢。為保證連續測定時結果準確,我們按照1.3中的方法,對連續測定樣品的份數進行了考察,實驗結果見表5。

表5 連續測定6份樣品時的測定結果

從表5的實驗結果得知,在40 mL溶劑中,連續測定6份樣品時,前5份結果的平行性良好,最大值和最小值的相對偏差約為5%;第6份結果的準確性出現變差趨勢,這可能是由于加入的樣品量較大,超出了40 mL溶劑的分散能力和反應能力,此時需要更換滴定杯中的溶液,重新加入溶劑后再進行測定。

為保證連續測定結果的可靠性,改進后的方法規定“連續測定4份樣品后,需更換滴定杯中的溶劑。”

2.5 滴定杯中溶劑量的選擇 通過前期實驗得知,溶劑量越大,可以測定的樣品份數越多、越容易得到平行性良好的實驗結果。

常見滴定杯的容量約為100 mL,如果向其中加入的溶劑量超過50 mL,隨著費休氏試液標定和樣品測定實驗的進行,容易出現杯中溶劑量過多、杯中溶液倒吸等現象。

綜合考慮,本研究最終選擇40 mL溶劑量進行實驗。

2.6 樣品測定 按照1.3中的方法對四批樣品進行了測定,結果見表6。

表6 應用改進后方法的測定結果

從表6的實驗結果得知,應用改進后的水分測定法對四批樣品進行測定,結果穩定,數據平行性良好,表明改進后的方法徹底解決了現行質量標準中卡巴匹林鈣水分測定法存在的數據平行性差、結果混亂異常的問題。

2.7 與其他水分測定法的比較 為了進一步驗證改進后方法的準確性,我們分別采用60 ℃減壓干燥失重法和氣相色譜法(《中國獸藥典》附錄0832 第三法)對四批卡巴匹林鈣樣品中的水分進行測定。結果見表7和表8。

表7 減壓干燥失重法水分測定結果

表8 氣相色譜法水分測定結果

卡巴匹林鈣對溫度敏感,在高溫下易產生降解,生產企業通常采用80 ℃的溫度對生產得到的原料進行干燥。為保證測定結果準確,本研究采用60 ℃減壓干燥的方式對4批卡巴匹林鈣樣品進行干燥失重測定。

從表7的實驗結果得知,采用60 ℃減壓干燥失重法測定時,前三批產品的測定結果與改進后方法的測定結果一致,均為0.1%;樣品4的測定結果(0.8%～1.5%)與改進后方法的測定結果(0.6%)差異明顯。

之所以出現上述差異,是由于被測樣品的降解程度不同造成的。通過HPLC實驗結果[1,4]得知,前三批樣品中雜質含量很少,主要雜質-水楊酸的含量約為0.2%～0.4%;而樣品4中雜質含量多,主要雜質-水楊酸的含量約為20%。水楊酸在70 ℃的條件下即會發生升華,在60 ℃減壓干燥條件下,樣品4中的水楊酸不斷升華,從而造成其干燥失重結果高于改進后方法的測定結果,并且其干燥8小時后仍未達到恒重。前三批樣品測定過程中,受到雜質干擾少,所以,這三批樣品的干燥失重結果與改進后方法的測定結果一致。

上述實驗結果表明,當卡巴匹林鈣樣品合格、雜質水楊酸的量較少時,60 ℃減壓干燥的方式可以準確測定樣品中的水分值。但當樣品降解嚴重、雜質水楊酸的量較多時,60 ℃減壓干燥的方法不能準確測定其中的水分。

所以,60 ℃減壓干燥失重法用作卡巴匹林鈣的水分測定時,適用范圍較窄。

從表8的實驗結果得知,采用氣相色譜法測得的卡巴匹林鈣樣品中的水分值明顯低于改進后方法的測定結果,這是由于熱導檢測器的靈敏度較低造成的。所以,附錄0832第三法 氣相色譜法不適合作為水分限度值較低的卡巴匹林鈣水分測定方法。

3 討 論

為了保證實驗結果真實可靠,我們進行了如下三方面的工作:為了排除樣品不均勻對測定結果造成影響,實驗開始前,我們將樣品充分混勻;為了排除溶劑“不新鮮”而對測定結果產生影響,每次實驗開始前,我們均更換滴定杯中的溶劑;為了排除儀器不穩定對測定結果造成影響,每次測定樣品前,我們均應用該儀器對費休氏試液進行標定,當連續三次標定結果相對偏差≤1.0%時,才開始樣品測定。

卡爾費休氏滴定反應受pH值影響,5～7.5是理想的pH值范圍。我們曾以為卡巴匹林鈣偏酸性是造成測定結果平行性差的原因,但是,當我們向溶劑中添加了20%～30%的咪唑緩沖鹽后,實驗結果仍然不理想,最大值和最小值的相對偏差在20%～30%的范圍內。驗證結果表明,卡巴匹林鈣偏酸性不是現行標準方法測定結果平行性差的主要原因。

通過實驗驗證得知,現行標準方法測定結果平行性差的主要原因是卡巴匹林鈣中的Ca2+與費休氏試液滴定過程中產生的SO42-結合形成CaSO4沉淀, CaSO4沉淀顆粒細小、附著力強,當卡巴匹林鈣樣品量大(1.0 g)時,生成的CaSO4沉淀量亦較大,滴定杯中的溶劑無法充分分散生成的沉淀,以致沉淀覆蓋電極表面,造成電極靈敏度變差、無法正常指示滴定終點,從而導致滴定結果異常。

甲酰胺是費休氏水分測定法中最推薦使用的強分散劑,但是,我們通過實驗研究證明,甲酰胺不適于用作卡巴匹林鈣水分測定時的分散劑。

采用水分測定儀進行測定時,當滴定體積占滴定管總體積的10%～90%,即可保證滴定結果的準確性。目前,水分測定儀滴定管的最小體積為1 mL,所以,當滴定體積大于0.1 mL即可滿足方法準確性的要求。根據實驗結果推算得知,當水分測定值為0.2%時,0.1 g取樣量消耗的滴定液(滴定度1 mg/mL)體積約為0.2 mL,滿足方法準確性的要求。

溶劑二甲基甲酰胺、無水甲醇應于實驗開始前分別加入滴定杯中,不可將二者提前混合在一起,因為甲酰胺類化合物易與醇類化合物發生副反應,尤其在光照條件下,二者的副反應會加速發生,以致滴定杯中的溶液呈現“果凍狀”,嚴重影響實驗的順利進行。

雖然溶劑中采用二甲基甲酰胺作為分散劑,以減少滴定反應過程中生成的CaSO4沉淀對電極的覆蓋,但是,為了更好的去除電極表面可能覆蓋的沉淀,建議實驗結束后,用粗糙的濾紙等擦拭電極鉑片,以保持電極的靈敏度。

本研究未采用卡式爐升溫的方式提取樣品中的水分。因為卡巴匹林鈣高溫下易降解,主要降解產物是水楊酸,水楊酸在70 ℃發生升華。如果采用卡式爐升溫加熱的方式對卡巴匹林鈣中的水分進行提取,會造成降解產物水楊酸進入水分測定系統中,從而對水分測定結果產生明顯干擾。

本研究采用容量法對卡巴匹林鈣中的水分進行測定,而未采用庫倫法,主要原因有以下兩方面:①經實驗驗證,容量法的測定結果準確可靠,滿足卡巴匹林鈣質量控制的要求;②相比于庫倫法水分測定儀,容量法水分測定儀造價低廉,普及率廣,尤其在各企業實驗室中應用廣泛。為節約企業生產成本,最終改進后的方法采用了容量法。

采用雜質含量較多的樣品4進行實驗研究?？ò推チ肘}易降解生成水楊酸,而水楊酸對水分測定結果干擾明顯。為保證改進后的方法具有良好的耐用性,本研究采用雜質含量較多、尤其水楊酸含量較多的樣品4進行方法開發和方法驗證。

4 結 論

研究改進了卡巴匹林鈣水分測定法,解決了現行標準方法數據平行性差、無法反映產品中水分的真實情況等問題。

相比于減壓干燥失重法和氣相色譜法,改進后的方法適用范圍廣、靈敏度高、易于推廣普及,適用于卡巴匹林鈣中的水分測定。