獸用中藥生物學(xué)檢測(cè)方法與評(píng)價(jià)技術(shù)

龔旭昊,李慧杰,董玲玲,顧進(jìn)華*

(1.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,北京 100081;2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部中獸醫(yī)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100081)

獸用中藥是在中獸醫(yī)藥理論指導(dǎo)下使用的藥物及其制劑,具有多成分、多靶點(diǎn),整體調(diào)節(jié)等特點(diǎn)。近年來,隨著我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展,獸用中藥因具有綠色天然、毒副作用低、整體功效強(qiáng)、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn),越來越得到人們的重視和認(rèn)可[1]。

中藥質(zhì)量是保障藥品安全有效、穩(wěn)定可控的基礎(chǔ)。中藥的質(zhì)量控制問題一直是制約我國(guó)獸用中藥現(xiàn)代化發(fā)展的熱點(diǎn)與難點(diǎn)問題。我國(guó)現(xiàn)行的獸用中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)體系主要以西方國(guó)家對(duì)化學(xué)藥品的理化檢測(cè)控制方法為借鑒。然而,化學(xué)藥品成分單一、療效與機(jī)制明確,對(duì)于成分復(fù)雜、藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究相對(duì)薄弱的獸用中藥,該體系并不完全適用,探索符合獸用中藥自身特點(diǎn)的質(zhì)量控制體系就尤為重要。

隨著技術(shù)的發(fā)展,生物學(xué)檢測(cè)與評(píng)價(jià)技術(shù)逐步應(yīng)用于中藥質(zhì)量控制研究之中,可以較好地彌補(bǔ)現(xiàn)行質(zhì)控方法的不足,有利于提高獸用中藥質(zhì)量的可控性。生物學(xué)檢測(cè)方法主要包括動(dòng)植物顯微鑒別、DNA分子鑒定、生物效價(jià)測(cè)定,以及正在不斷發(fā)展的基因組學(xué)和代謝組學(xué)等技術(shù)。由于生物學(xué)評(píng)價(jià)技術(shù)具有藥效相關(guān)、整體可控等優(yōu)勢(shì),是符合中醫(yī)藥特點(diǎn)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制模式及方法,亦是中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化的重要發(fā)展方向[2]。以下就生物學(xué)檢測(cè)方法與評(píng)價(jià)技術(shù)在獸用中藥質(zhì)量控制中的應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行闡述,以期為提升獸用中藥質(zhì)量控制水平,保證臨床用藥的有效性和安全性提供更多選擇。

1 顯微鑒別與獸用中藥真?zhèn)舞b定

1.1 顯微鑒別技術(shù) 1838年德國(guó)學(xué)者Schleiden闡明了細(xì)胞是植物體的基本單位,并利用顯微鏡觀察了多種生藥的顯微構(gòu)造,發(fā)現(xiàn)根據(jù)顯微構(gòu)造的不同,各種生藥可以準(zhǔn)確區(qū)別[3]。自此,利用顯微鏡鑒別生藥的方法得到了逐步的發(fā)展。我國(guó)中藥的顯微鑒別研究雖然起步較晚,但經(jīng)過半個(gè)多世紀(jì)的系統(tǒng)性研究,現(xiàn)今顯微鑒別已成為我國(guó)中藥及制劑鑒別的重要方法之一,因具有快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的特點(diǎn)而得到廣泛的應(yīng)用。

中藥來源于植物、動(dòng)物和礦物,其微觀結(jié)構(gòu)因種類的不同而有顯著差異,這些微觀結(jié)構(gòu)的差異可以作為顯微鑒別的依據(jù)。獸用中藥相比人藥,其制劑品種多為散劑,在《中國(guó)獸藥典》2020年版二部中,有近80%的成方制劑有顯微鑒別項(xiàng)。應(yīng)用顯微鑒別技術(shù),不但可檢測(cè)出成方制劑所列出的組分,還能夠通過專屬性鑒別特征檢測(cè)出處方中某些未列出的組分,包括真?zhèn)巍?yōu)劣、摻雜、改變處方等情況,從而彌補(bǔ)了理化鑒別的不足,對(duì)獸用中藥的質(zhì)量控制具有重要作用。

1.2 顯微數(shù)碼成像技術(shù) 獸用中藥大多來源于植物,顯微鑒別的要點(diǎn)是鑒別其組織、細(xì)胞或內(nèi)含物等特征。在進(jìn)行顯微鑒別操作時(shí),傳統(tǒng)的操作只能一邊通過目鏡觀察特征,一邊進(jìn)行手繪圖像,這種方法難免使研究結(jié)果有人為的主觀誤差,且工作效率較低[4]。顯微鏡數(shù)碼成像技術(shù)是將光學(xué)顯微鏡技術(shù)、數(shù)碼攝影成像技術(shù)、光電轉(zhuǎn)換技術(shù)及液晶屏幕技術(shù)完美結(jié)合的一項(xiàng)顯微成像技術(shù),其通過顯微數(shù)碼成像系統(tǒng),可以直接在電腦上更為清晰、實(shí)時(shí)的觀察中藥顯微特征圖像,還能將觀測(cè)的圖像在電腦上以圖片的形式保存下來,大大的方便了使用者將圖像數(shù)據(jù)保存的要求,也更加方便了資料數(shù)據(jù)的管理和編輯。此外,其能通過專業(yè)的配套軟件對(duì)圖像進(jìn)行調(diào)整,標(biāo)注,拼接,合成,測(cè)量、錄像等,形成所需的圖文文件,且可以互相傳閱,實(shí)現(xiàn)多人同時(shí)觀察,顯著提高了工作效率。目前,顯微數(shù)碼成像技術(shù)在獸用中藥顯微鑒別工作中最為常用。

1.3 激光共聚焦顯微技術(shù) 激光掃描共聚焦顯微鏡(Laser Scanning Confocal Microscope, LSCM)是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的高技術(shù)光電儀器,是對(duì)普通顯微鏡質(zhì)的飛躍,更是對(duì)電子顯微鏡的補(bǔ)充。其工作原理主要是通過在熒光顯微鏡成像的基礎(chǔ)上加裝激光掃描裝置,使用紫外光或可見光激光熒光探針,利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖像處理,從而可得到樣品內(nèi)部細(xì)微結(jié)構(gòu)的熒光圖像[5]。該技術(shù)具有高分辨率、高靈敏度和空間結(jié)構(gòu)靈活性觀察的獨(dú)特優(yōu)勢(shì),不僅可觀察固定的細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu),還可提供定量熒光測(cè)定、定量圖像分析等實(shí)用研究手段,達(dá)到對(duì)細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)和信號(hào)進(jìn)行定量分析的目的,現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代生物學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域,在中藥研究中也發(fā)揮著日趨重要的作用。

首先,激光共聚焦顯微技術(shù)基于對(duì)藥材細(xì)胞無損、三維重建點(diǎn)掃描成像技術(shù)及強(qiáng)大的軟件處理程序?qū)崿F(xiàn)對(duì)藥材細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞骨架、細(xì)胞器結(jié)構(gòu)和分布及變化的動(dòng)態(tài)追蹤。通過共振熒光分子作用推定分子之間的距離,為中藥材鑒別及道地藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了良好的思路與方法。如劉向東[6]利用激光掃描共聚焦顯微鏡研究植物細(xì)胞發(fā)育的形態(tài)學(xué),結(jié)果細(xì)胞發(fā)育的形態(tài)學(xué)變化過程能被清楚地觀察到。

2 DNA條形碼分子鑒定法與獸用中藥基原鑒定

2.1 DNA條形碼分子鑒定法 DNA條形碼分子鑒定法(DNA barcoding)是利用基因組中一段公認(rèn)的、相對(duì)較短的DNA序列來進(jìn)行物種鑒定的一種分子生物學(xué)技術(shù),是對(duì)傳統(tǒng)形態(tài)鑒別方法的有效補(bǔ)充[7]。由于不同物種的DNA序列是由腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)四種堿基以不同順序排列組成,因此對(duì)某一特定DNA片段序列進(jìn)行分析即能夠區(qū)分不同物種,具有準(zhǔn)確、穩(wěn)定和可靠的特點(diǎn),該方法在物種鑒定方面具有廣闊的應(yīng)用前景[8]。

中藥材DNA條形碼分子鑒定通常是以核糖體DNA第二內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS2)為主體條形碼序列鑒定中藥材的方法體系,其中植物類中藥材選用ITS2/ITS為主體序列,以葉綠體psbA-trnH為輔助序列,動(dòng)物類中藥材釆用細(xì)胞色素C氧化酶亞基I(COI)為主體序列,ITS2為輔助序列[9]。中藥材DNA條形碼分子鑒定技術(shù)被譽(yù)為中藥鑒定學(xué)的“文藝復(fù)興”,可將中藥基原鑒定至物種水平。經(jīng)過大量實(shí)踐證實(shí),該技術(shù)能有效實(shí)現(xiàn)對(duì)中藥種子種苗、基原物種、藥材、飲片及中成藥等的基原鑒定[10]。“中藥材DNA條形碼分子鑒定法指導(dǎo)原則”自2014年首次被收載于《中國(guó)藥典》(2010年版第三增補(bǔ)本)至今已有9年,也使其逐漸成為藥檢機(jī)構(gòu)的檢測(cè)項(xiàng)目[11],越來越多的中藥生產(chǎn)加工企業(yè)亦開始采用該技術(shù)來監(jiān)控其原料藥基原。隨著該技術(shù)的不斷推廣,不僅有利于規(guī)范藥材市場(chǎng),而且促進(jìn)了中藥質(zhì)量控制水平的提高,在中藥全產(chǎn)業(yè)鏈各關(guān)鍵環(huán)節(jié)均發(fā)揮著重要作用。

2.2 DNA測(cè)序技術(shù) DNA測(cè)序技術(shù)系指分析DNA堿基構(gòu)成和堿基順序的技術(shù),一般采用雙脫氧鏈終止法進(jìn)行DNA測(cè)序。其原理是利用2′,3′-雙脫氧核苷三磷酸(2′,3′-ddNTP)作為鏈終止試劑,通過DNA聚合酶催化和引物延伸產(chǎn)生一系列長(zhǎng)度相差一個(gè)堿基的寡核苷酸,進(jìn)行電泳分離,通過放射自顯影或熒光確定DNA的序列。除雙脫氧鏈終止法外,DNA測(cè)序技術(shù)還包括邊合成邊測(cè)序、單分子實(shí)時(shí)測(cè)序、納米孔測(cè)序等技術(shù)。DNA測(cè)序分析可分為手工測(cè)序和自動(dòng)測(cè)序,當(dāng)前以自動(dòng)測(cè)序?yàn)橹髁鱗12]。通過高精度的DNA序列分析手段測(cè)定中藥材、中藥飲片等所需被測(cè)的基因片段,并加以對(duì)比分析,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)鑒別的目的。選擇用于DNA測(cè)序的基因片段需在種內(nèi)高度保守,而在種間序列的差異較大,進(jìn)而適用于中藥材種間的鑒定[13]。

2.3 獸用中藥標(biāo)準(zhǔn)核酸序列的建立 標(biāo)準(zhǔn)核酸序列系指供藥品標(biāo)準(zhǔn)中要求的種屬源性鑒別或鑒定的核酸序列,其具有確定的堿基排列順序,是實(shí)施核酸檢測(cè)的基礎(chǔ),用于藥品檢驗(yàn)、藥品質(zhì)量控制中涉及的動(dòng)物、植物、微生物以及重組生物制品的種屬鑒別或鑒定。藥品標(biāo)準(zhǔn)中采用核酸序列進(jìn)行鑒定的品種,都建有標(biāo)準(zhǔn)核酸序列[14]。標(biāo)準(zhǔn)核酸序列庫(kù)的可靠性是DNA條形碼分子鑒定的基礎(chǔ)。目前已有的數(shù)據(jù)庫(kù),如GenBank,中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng),EMBL等,數(shù)據(jù)之間缺乏驗(yàn)證,由各位科研人員單獨(dú)提供,質(zhì)量參差不齊,為保證DNA條形碼分子鑒定的可靠性,標(biāo)準(zhǔn)核酸序列應(yīng)具備權(quán)威性、準(zhǔn)確性、專屬性和溯源性的標(biāo)準(zhǔn)。

據(jù)統(tǒng)計(jì),獸醫(yī)臨床及畜牧養(yǎng)殖中常用的獸醫(yī)專用中藥有60余種[1],缺乏DNA分子鑒定研究基礎(chǔ),為了不與人藥爭(zhēng)資源,保障獸用中藥原料質(zhì)量,開展獸醫(yī)專用中藥DNA分子鑒定研究對(duì)促進(jìn)獸用中藥行業(yè)高質(zhì)量發(fā)展具有重要意義。建立獸醫(yī)專用中藥DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)要滿足以下條件,首先應(yīng)確保藥材基原的準(zhǔn)確性,然后應(yīng)采用標(biāo)準(zhǔn)的序列校準(zhǔn)程序。

2.3.1 確保藥材基原準(zhǔn)確 了解獸用中藥材的產(chǎn)地和分布區(qū)域,樣品應(yīng)采自道地產(chǎn)區(qū)和主要分布區(qū),所有采集的樣品均應(yīng)經(jīng)過鑒定專家進(jìn)行鑒定以確保藥材基原準(zhǔn)確。樣品經(jīng)專家鑒定后應(yīng)進(jìn)行規(guī)范化管理,根據(jù)樣品編碼規(guī)則對(duì)采集樣品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)編碼,并進(jìn)行專門存放。

2.3.2 確保DNA條形碼序列可靠性 對(duì)拼接好的中藥DNA條形碼序列進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估時(shí),主要以堿基的Q值(quality value)為依據(jù),Q值代表了堿基測(cè)序的質(zhì)量值,計(jì)算公式為Q=-10×lgP,P為每個(gè)堿基出錯(cuò)的概率。例如,若每100個(gè)堿基有1個(gè)錯(cuò)誤,那么P=0.01,Q就為20,即Q20表示堿基錯(cuò)誤率為1%。一般情況下,單向測(cè)序的堿基質(zhì)量需要大于Q20(99%的可靠性),經(jīng)雙向測(cè)序拼接后的堿基質(zhì)量需要大于Q30(99.9%的可靠性)[15]。序列質(zhì)量判斷標(biāo)準(zhǔn)采用國(guó)際DNA條形碼協(xié)會(huì)(CBOL)通用的標(biāo)準(zhǔn)[16]。

2.3.3 保證序列和基原樣品的一致性 除采集樣品和實(shí)驗(yàn)過程規(guī)范操作外,需采用嚴(yán)格校對(duì)機(jī)制,即通過BLAST分析防錯(cuò)等措施,確保實(shí)驗(yàn)獲得的序列和基原樣品的一致性,避免在實(shí)驗(yàn)過程中由于操作不當(dāng)引入的真菌污染和樣品交叉污染。

所建立的獸用中藥標(biāo)準(zhǔn)核酸序列信息應(yīng)具有完整性,包括物種名稱、編號(hào)、用途、樣本來源、堿基序列和基于現(xiàn)有實(shí)物鑒定標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)描述。標(biāo)準(zhǔn)核酸序列建立后,應(yīng)提交至國(guó)家有關(guān)管理部門審核,經(jīng)批準(zhǔn)后方可納入標(biāo)準(zhǔn)核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)使用。此外,標(biāo)準(zhǔn)核酸序列的建立單位應(yīng)建立常規(guī)的質(zhì)量保障體系,對(duì)其發(fā)行的標(biāo)準(zhǔn)核酸序列進(jìn)行定期監(jiān)測(cè),確保標(biāo)準(zhǔn)核酸序列的及時(shí)更新。

3 基于基因芯片的獸用中藥評(píng)價(jià)技術(shù)與方法

3.1 基因芯片的優(yōu)勢(shì) 基因芯片(Gene chip) 又稱DNA微陣列,是生物芯片的一種,由美國(guó)Fodors等[17]在20世紀(jì)90年代初提出并研究,是專門用于核酸檢測(cè)的生物芯片。其原理是將大量的分子探針附著固定于載體支持物上,與待測(cè)樣品基因組DNA序列雜交進(jìn)行核酸序列測(cè)定,借由熒光或電流等方式檢測(cè)每個(gè)探針分子的雜交信號(hào)強(qiáng)度,進(jìn)而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息。由于基因芯片技術(shù)能夠一次性將大量探針固定在支持物上,因此可以同時(shí)對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行序列檢測(cè)及分析,從而簡(jiǎn)化了傳統(tǒng)核酸印跡雜交技術(shù)操作繁瑣、效率低下等不足,同時(shí)減少了所需檢測(cè)序列的數(shù)量,自動(dòng)化程度顯著提高[18]。

基因芯片技術(shù)以高通量、多因素、微型化和快速靈敏的特點(diǎn)而見長(zhǎng),在應(yīng)用時(shí)可根據(jù)實(shí)際情況具體設(shè)計(jì)探針系列,選擇具有針對(duì)性的分析檢測(cè)方法,可極大地?cái)U(kuò)展此技術(shù)的應(yīng)用范圍,如基因表達(dá)譜測(cè)定、突變檢測(cè)、多態(tài)性分析、基因組文庫(kù)作圖及雜交測(cè)序等[19]。經(jīng)過近30年的發(fā)展,基因芯片作為高度集成化的分析和研究手段已成為進(jìn)行藥物基因組學(xué)研究的主要平臺(tái)。

3.2 基因芯片與獸用中藥評(píng)價(jià) 早在三千多年以前,中藥就被應(yīng)用于促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)及疾病防治。雖然獸用中藥應(yīng)用歷史悠久,但缺乏高質(zhì)量的科學(xué)證據(jù)來證明其有效性。由于采用以理化分析為主的研究方法常存在較多的局限性,導(dǎo)致人們長(zhǎng)期以來對(duì)獸用中藥的認(rèn)識(shí)層次與研究手段基本保持在低效率與低通量。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)理論,所有藥物都是通過直接或間接修飾或改變?nèi)梭w基因及基因產(chǎn)物產(chǎn)生作用[20]。因此,利用基因芯片技術(shù)分析藥物活性成分影響基因表達(dá)多態(tài)性變化就成為從分子水平上深入研究中藥活性成分作用機(jī)制、有效成分篩選、質(zhì)量控制及安全性評(píng)價(jià)等研究難題的重要方法。基因芯片技術(shù)是中藥研究領(lǐng)域中一次具有深遠(yuǎn)意義的改革,具有極廣的發(fā)展擴(kuò)張性與應(yīng)用深度,為中藥現(xiàn)代化的發(fā)展提供了新途徑。

3.2.1 基因芯片與中藥質(zhì)量控制 確保獸用中藥的質(zhì)量,是保證中獸醫(yī)臨床用藥安全有效的前提。鑒于中藥復(fù)方成分復(fù)雜,應(yīng)用常規(guī)方法很難準(zhǔn)確地鑒別其藥用組分,可將基因芯片與從正品中藥中得到的DNA雜交,得到標(biāo)準(zhǔn)基因圖譜,與待鑒定中藥的基因圖譜比較分析即可達(dá)到鑒定的目的。

基因芯片在21世紀(jì)初即被應(yīng)用于中藥鑒定[21],發(fā)展至今,基因芯片在破碎藥材、近緣相似種、炮制藥材及貴重藥材等的鑒別鑒定中均發(fā)揮了不可替代的作用。但值得注意的是,中藥的藥效成分大多是其次生代謝產(chǎn)物,基因芯片只能鑒別中藥的真?zhèn)味荒軐?duì)其優(yōu)劣進(jìn)行鑒定,不能取代中藥化學(xué)成分指紋圖譜等的鑒定[22]。

3.2.2 基因芯片與中藥安全性評(píng)價(jià) 中藥的安全性評(píng)價(jià)是中藥現(xiàn)代化發(fā)展中的熱點(diǎn)問題。中藥進(jìn)入國(guó)際市場(chǎng)通常需要提供安全性研究報(bào)告,因此,中藥毒性的快速評(píng)價(jià)與篩選是中藥研究領(lǐng)域亟待解決的問題[23]。對(duì)于獸用中藥,除人畜共用中藥外,獸醫(yī)專用中藥在臨床及養(yǎng)殖中使用廣泛,該類藥材因毒性較大、安全性風(fēng)險(xiǎn)較高致人醫(yī)很少使用。為保障養(yǎng)殖安全,開展獸用中藥安全性評(píng)價(jià)極為重要。

傳統(tǒng)的藥理毒理研究方法很難對(duì)獸用中藥的安全性進(jìn)行較為全面的評(píng)價(jià),而且對(duì)于慢性毒性和不良反應(yīng),傳統(tǒng)研究方法需要消耗大量的人力、物力和時(shí)間,而且某些毒性和不良反應(yīng)可能檢測(cè)不到[24]。利用基因芯片技術(shù)將中藥的毒副作用與基因表達(dá)特征聯(lián)系起來,通過快速分析中藥微量活性成分,高通量研究全組分作用靶點(diǎn),依據(jù)基因的表達(dá)分析即可確定藥物的毒性[25-26],從而提高獸用中藥的安全性評(píng)價(jià)水平。

4 生物檢測(cè)與獸用中藥藥效質(zhì)量評(píng)價(jià)

當(dāng)前中藥質(zhì)量控制與藥效評(píng)價(jià)主要采用常規(guī)的理化及藥理學(xué)方法,由于中藥化學(xué)組成復(fù)雜,作用靶點(diǎn)多,活性、毒性成分及作用機(jī)制等研究尚不明確,常規(guī)方法雖然簡(jiǎn)單易行,但在有效性和安全性的控制上可能存在不足,較難保證中藥的質(zhì)量可控性[27]。美國(guó)食品藥品管理局(FDA)將生物評(píng)價(jià)作為植物藥質(zhì)量控制的重要方法,2016年美國(guó)FDA正式發(fā)布的《植物藥研發(fā)行業(yè)指南》(Botanical Drug Development Guidance for Industry)中要求,在僅采用化學(xué)檢驗(yàn)不足以確保質(zhì)量和療效一致性的情況下,申請(qǐng)人應(yīng)在植物藥原料藥和(或)藥品放行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和穩(wěn)定性試驗(yàn)方案中納入生物學(xué)檢測(cè)方法。

生物學(xué)檢測(cè)系指采用生物學(xué)方法,以反映被測(cè)物的生物學(xué)特性為目的的測(cè)定方法。生物學(xué)測(cè)定方法可廣泛用于各種檢測(cè)目的,包括鑒別、生物活性和雜質(zhì)檢測(cè)等,其中最主要的是生物活性(或效價(jià)、效力)測(cè)定。根據(jù)中藥特點(diǎn),研究探索生物學(xué)方法用于中藥質(zhì)量控制,與現(xiàn)行質(zhì)控方法相互補(bǔ)充,為建立符合中醫(yī)藥特點(diǎn)的中藥質(zhì)量控制體系提供了新的路徑,亦為保證臨床用藥的安全有效、質(zhì)量可控提供更充分的科學(xué)依據(jù)。

4.1 中藥生物活性測(cè)定 生物活性測(cè)定法,是以藥物的生物效應(yīng)為基礎(chǔ),以生物統(tǒng)計(jì)為工具,運(yùn)用特定的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),測(cè)定藥物有效性的一種方法,從而達(dá)到控制藥品質(zhì)量的作用。該方法將復(fù)雜的中藥活性成分作為“黑箱”,直接以藥效為切入點(diǎn)評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量,可為現(xiàn)有的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)充與完善提供有力借鑒,逐漸得到大家的重視與認(rèn)可[28]。《中國(guó)藥典》從2010-2020年版均收載了《中藥生物活性測(cè)定指導(dǎo)原則》,明確了生物活性評(píng)價(jià)方法作為中藥質(zhì)量控制的具體原則,側(cè)重于在中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)領(lǐng)域中的應(yīng)用。該方法包括生物效價(jià)測(cè)定法和生物活性限值測(cè)定法。在應(yīng)用時(shí)應(yīng)優(yōu)先選用生物效價(jià)測(cè)定法,對(duì)于不能建立生物效價(jià)測(cè)定的品種可考慮采用生物活性限值測(cè)定法。

生物活性測(cè)定法操作簡(jiǎn)便,實(shí)驗(yàn)周期短,所測(cè)數(shù)據(jù)可直觀反映藥物功效,擺脫了“化學(xué)成分作為質(zhì)控指標(biāo)”的桎梏,有望在不斷實(shí)踐的同時(shí)得到蓬勃發(fā)展。然而由于生物活性測(cè)定法用于中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)起步較晚,在實(shí)施、衍化與發(fā)展過程中仍存在不少障礙,如找尋與待測(cè)樣品活性相似的對(duì)照品有一定難度,缺乏生物測(cè)定用的中藥對(duì)照品[29];對(duì)于多種適應(yīng)癥的中藥,其相關(guān)病癥生物活性選擇范圍寬泛等。但對(duì)于功能主治明確、有效成分模糊、檢測(cè)方法不夠完善的中藥,生物活性檢測(cè)法能為其質(zhì)量控制起到有效補(bǔ)充。

4.2 中藥生物效應(yīng)檢測(cè) 生物效應(yīng)檢測(cè)是指利用藥物對(duì)試驗(yàn)系所產(chǎn)生的生物效應(yīng),運(yùn)用特定的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),反映藥物有效性、安全性的一種方法,從而達(dá)到評(píng)價(jià)和控制藥品質(zhì)量的目的。當(dāng)前中藥質(zhì)量控制方法較難與臨床有效性、安全性相關(guān)聯(lián),為制定并完善符合中藥特點(diǎn)的中藥質(zhì)量控制體系,國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥品審評(píng)中心于2020年12月17日發(fā)布了《中藥生物效應(yīng)檢測(cè)研究技術(shù)指導(dǎo)原則(試行)》[30]。

中藥生物效應(yīng)檢測(cè)方法是通過與中藥有效性、安全性相關(guān)聯(lián),反映一類或多類活性/毒性成份的生物效應(yīng),是一種符合中藥多成份、整體作用特點(diǎn)的質(zhì)量控制方法,可較好地彌補(bǔ)現(xiàn)行質(zhì)量控制方法的不足,適用于中藥全生命周期的相關(guān)評(píng)價(jià)。目前,中藥生物效應(yīng)檢測(cè)的相關(guān)評(píng)價(jià)方法可包括生物效價(jià)/生物毒價(jià)、生物活性限值、效應(yīng)成份指數(shù)、生物標(biāo)志物、生物效應(yīng)表達(dá)譜等。基于中藥有效性、安全性和質(zhì)量可控性等因素,建議在以下三種情形中優(yōu)先考慮該方法:①藥理作用清楚、活性明顯、量效關(guān)系明確,但有效成份不清楚的;②涉及毒性藥味和(或)現(xiàn)代研究表明對(duì)人體具有較強(qiáng)的毒性反應(yīng),但產(chǎn)生毒性反應(yīng)的成份尚不明確的;③檢測(cè)的化學(xué)成份與臨床療效和安全性關(guān)聯(lián)性不強(qiáng)的。

中藥生物效應(yīng)檢測(cè)方法作為一種新技術(shù)和新方法,不同于一般的藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法,需要具備藥理學(xué)與藥檢分析的雙重屬性和要求[2],其目前屬于前瞻性、探索性的研究方法,因此在方法的廣泛應(yīng)用方面可能還存在一定困難,對(duì)方法的建立、技術(shù)難點(diǎn)和注意的問題還有待細(xì)化。

4.3 獸用中藥的生物活性測(cè)定 如何更有效的控制和評(píng)價(jià)產(chǎn)品質(zhì)量及臨床療效是目前獸用中藥發(fā)展的焦點(diǎn)問題。中藥的生物活性測(cè)定相對(duì)于理化測(cè)定在獸用中藥藥效評(píng)價(jià)方面的臨床意義更大。早在上世紀(jì)90年代,獸藥行業(yè)就認(rèn)識(shí)到有必要在現(xiàn)有含量測(cè)定的基礎(chǔ)上增加生物活性測(cè)定來控制獸用中藥質(zhì)量。1992年,農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)的新藥“黃芪多糖注射液”采用生物活性限值測(cè)定法,用測(cè)定小鼠脾增重關(guān)聯(lián)中藥制劑提高動(dòng)物機(jī)體免疫力的能力,有效的控制了產(chǎn)品療效。

隨技術(shù)的發(fā)展及普及,生物活性測(cè)定在醫(yī)藥領(lǐng)域的中藥質(zhì)量控制實(shí)踐中也逐漸被采用,如2005年版《中國(guó)藥典》中水蛭的含量測(cè)定,消栓腸溶膠囊國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS3-571(Z-67)-2005(Z)的效價(jià)測(cè)定,均為借鑒生物制品中酶效價(jià)測(cè)定方法。目前,中醫(yī)藥證候類生物活性檢測(cè)方法一直是研究難點(diǎn),張莉華等[31]基于活血化瘀藥物多數(shù)具有的抗血小板聚集的作用機(jī)制,以中藥活性成分丹酚酸B作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),建立了家兔體外抗血小板聚集生物效價(jià)檢測(cè)方法,經(jīng)第三方實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證重現(xiàn)性良好。上述成果為中獸藥藥效和安全性評(píng)價(jià)技術(shù)研究提供了借鑒與參考。

5 展 望

中國(guó)藥典已經(jīng)對(duì)清熱解毒類、活血化瘀類中藥制定了一些生物評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),以及動(dòng)物藥如蘄蛇的模板DNA提取、PCR反應(yīng)等等。為全面地提升獸用中藥材、飲片、提取物和制劑質(zhì)量控制技術(shù),建議加強(qiáng)生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)研究,推動(dòng)基因組學(xué)、代謝組學(xué)在獸用中藥質(zhì)量控制及評(píng)價(jià)中的應(yīng)用。

5.1 運(yùn)用代謝組學(xué)開展中藥過程質(zhì)量控制 中藥質(zhì)量與有效成分的組成、含量、產(chǎn)地和種屬等因素直接相關(guān),傳統(tǒng)的分析技術(shù)很難對(duì)多成分的中藥做出正確分析。代謝組學(xué)是基于藥物整體性的檢測(cè)技術(shù),能對(duì)中藥的品種栽培、產(chǎn)地加工、飲片炮制、分離純化等各個(gè)生產(chǎn)加工環(huán)節(jié)進(jìn)行質(zhì)量管控,是臨床用藥安全性和中藥質(zhì)量控制的有利手段[32]。

應(yīng)用代謝組學(xué)對(duì)影響藥材質(zhì)量的關(guān)鍵因素進(jìn)行分析,提供代謝產(chǎn)物的整體信息,確定與質(zhì)量變化相關(guān)的質(zhì)量標(biāo)志物,為中藥材的質(zhì)量控制和炮制提供重要依據(jù)。中藥品種鑒定是中藥質(zhì)量控制的關(guān)鍵,通過代謝組學(xué)差異研究,可廣泛應(yīng)用于代謝信息相似的中藥質(zhì)量控制,實(shí)現(xiàn)對(duì)多種同屬植物進(jìn)行化學(xué)成分分析和真?zhèn)舞b別。生長(zhǎng)年限是影響中藥成分的重要因素,直接關(guān)系藥材各成分的含量和藥效,隨著中藥栽培時(shí)間的延長(zhǎng),通過研究代謝物含量變化,揭示客觀的量效關(guān)系。此外,中藥炮制是中藥材采收之后處理加工的重要環(huán)節(jié),炮制過程中化學(xué)成分發(fā)生改變,運(yùn)用代謝組學(xué)可對(duì)發(fā)生改變的成分進(jìn)行綜合分析,通過研究代謝產(chǎn)物的空間分布,篩選差異代謝物,進(jìn)而揭示炮制減毒增效的物質(zhì)基礎(chǔ)[33]。

5.2 運(yùn)用基因組學(xué)探索中藥藥性與功能主治關(guān)系中藥基因組學(xué)是從基因組水平研究中藥及其對(duì)人體作用的一門前沿學(xué)科,利用組學(xué)技術(shù)研究中藥基原物種的遺傳信息及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò),闡明中藥防治人類疾病的分子機(jī)制[34]。經(jīng)過不斷發(fā)展,中藥基因組學(xué)已成為開展中藥有效成分篩選、中藥及復(fù)方藥性研究、中藥新藥研發(fā)、中藥質(zhì)量控制與安全性研究及中藥基因芯片構(gòu)建的基礎(chǔ)與重要依據(jù)。

中藥是在中醫(yī)藥理論下指導(dǎo)運(yùn)用的藥物。中藥的基本理論,部分與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)有一定相關(guān)性解釋,如活血化瘀、行氣止痛、清熱解毒等,可以優(yōu)先考慮進(jìn)行生物活性測(cè)定,不強(qiáng)求完全反應(yīng)中藥的本質(zhì)特點(diǎn),但可以達(dá)到以良好的生物效應(yīng)控制標(biāo)準(zhǔn)符合國(guó)際公認(rèn)的質(zhì)量準(zhǔn)則,從而推動(dòng)中藥在臨床中的使用,并推動(dòng)中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的進(jìn)步。對(duì)于中醫(yī)藥基礎(chǔ)理論,如寒熱溫涼、中醫(yī)證候的辨證論治,其本質(zhì)也是一種生物體的過程和反應(yīng),那么就可以通過基因組學(xué)、蛋白組學(xué)等方法,從分子生物學(xué)基因?qū)用骊U述中藥藥性、作用機(jī)制,通過建立全新的生物檢定方法,進(jìn)一步探索中藥的藥性與功能主治的關(guān)系[35],為中醫(yī)藥理論文化的繼承與發(fā)展提供有效技術(shù)支撐。