磺胺二甲嘧啶鈉注射液和磺胺間甲氧嘧啶鈉注射液細菌內毒素檢查方法的改進研究

韓寧寧,張 雯,王 軒,彭文繡,趙 暉,楊秀玉,戴 青,趙富華*

(1.中國獸醫藥品監察所,北京 100081;2.寧夏回族自治區獸藥飼料監察所,銀川 750011)

磺胺二甲嘧啶鈉和磺胺間甲氧嘧啶鈉均為磺胺類抗菌藥物,可與對氨基苯甲酸競爭性作用于細菌體內的二氫葉酸合成酶,阻止葉酸的合成,減少具有代謝活性的四氫葉酸的量,從而抑制細菌的生長繁殖[1-2]。二者在動物體內外都具有很強的抗菌活性,對大多數革蘭陽性菌和陰性菌都有較強的抑制作用,能用于由敏感菌引起的各類感染,也可用于弓形蟲的感染[3]。磺胺二甲嘧啶鈉注射液和磺胺間甲氧嘧啶鈉注射液均為靜脈用注射劑。根據《中國獸藥典》附錄0102[4]的要求,靜脈用注射劑應進行細菌內毒素或熱原的檢查。但2015年版《中國獸藥典》中上述兩個注射液[5-6]均無相關檢查項目。為提升標準對產品安全性的質量控制作用,按照農業行業(國家)標準項目獸藥國家標準制修訂計劃,2020年版《中國獸藥典》上述兩個注射液質量標準中擬增加細菌內毒素檢查項。該標準起草單位最初擬定的標準為“取本品,依法檢查,每1 mL注射液中含內毒素的量應小于5 EU”。作為復核單位,研究發現,按照標準選擇常規靈敏度的鱟試劑,供試品對鱟試劑的凝結產生干擾。通過對干擾作用產生的原因進行剖析,并用固定濃度的鹽酸溶液溶解供試品,再使用無熱原濾膜過濾的方法排除了干擾。通過上述供試品前處理方法的改進,檢驗人員無需采用特殊靈敏度的鱟試劑,亦可完全消除干擾作用,增強了標準的可執行性。改進后的標準被收載入2020年版《中國獸藥典》[7-8]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試品 共收集到來自2家獸藥生產企業的3批磺胺二甲嘧啶鈉注射液,見表1。共收集到來自3家獸藥生產企業的3批磺胺間甲氧嘧啶鈉注射液,見表2。

表1 磺胺二甲嘧啶鈉注射液樣品信息

表2 磺胺間甲氧嘧啶鈉注射液樣品信息

1.1.2 試劑 共采購了來自2個廠家的3種不同靈敏度的鱟試劑,見表3。細菌內毒素國家標準品購自中國食品藥品檢定研究院,規格為9000 EU/支。細菌內毒素檢查用水購自中國食品藥品檢定研究院。

表3 鱟試劑信息

1.1.3 儀器和耗材 細菌內毒素檢查儀(ET-96)購自天大天發科技有限公司。0.45 μm無熱原濾膜購自Sartorius。

1.2 方法

1.2.1 原擬定標準方法的復核和問題分析

1.2.1.1 原擬定標準方法的復核 采用上述3種靈敏度的6批鱟試劑,分別對上述6批供試品進行內毒素檢查。每批供試品均同時配制供試品陽性(PPC)和陽性(PC)。供試品、PPC、PC和陰性均配制兩個平行管。觀察采用不同靈敏度鱟試劑的PPC管凝結情況與PC管是否一致。

1.2.1.2 PPC管不凝結的原因分析及不同稀釋倍數的供試品溶液pH值測定 采用0.25 EU/mL或0.5 EU/mL的鱟試劑,各批供試品PPC管均未凝結,顯示供試品對鱟試劑凝結產生干擾作用。考慮磺胺二甲嘧啶鈉注射液和磺胺間甲氧嘧啶鈉注射液的pH值均為堿性(《中國獸藥典》規定二者的pH值均為9.0～11.0),分析產生干擾作用的主要因素是供試品溶液pH值不在6.0～8.0的中性范圍,影響了鱟試劑與內毒素的凝結反應[9-10]。為驗證上述分析,對各批供試品原液的pH值和稀釋后的pH值進行了測定。

1.2.2 細菌內毒素檢查方法的改進

1.2.2.1 鱟試劑靈敏度復核 由于本方法的限值是5 EU/mL,按照鱟試劑靈敏度不得高于限值的要求[11-12],選擇常規靈敏度的鱟試劑即可符合要求,因此擬選擇0.25 EU/mL和0.5 EU/mL兩個靈敏度的鱟試劑。按照《中國獸藥典》一部附錄1143的規定,對采購自兩個廠家的上述兩個靈敏度的鱟試劑分別進行標示靈敏度的復核。對應各濃度的細菌內毒素標準品溶液配制方法見圖1。

圖1 各濃度內毒素標準溶液配制流程圖

1.2.2.2 供試品前處理方法的改進 由于供試品呈堿性,在使用0.06 EU/mL的鱟試劑時,即便稀釋至最大稀釋倍數83倍仍不能滿足pH值在6.0～8.0范圍內的要求,故采用加入稀鹽酸的方法調節供試品稀釋液pH值。嘗試采用不同濃度的鹽酸溶液調節pH值,或采用不同濃度的鹽酸溶液直接溶解供試品,以使供試品溶液pH值符合上述要求[13]。

采用確定濃度的鹽酸溶液溶解后,磺胺二甲嘧啶鈉或磺胺間甲氧嘧啶鈉產生白色沉淀。而白色沉淀的產生會影響凝結現象的觀察[14]。因此,進一步將混懸稀釋液用0.45 μm無熱原濾膜進行過濾后即得澄清稀釋液。對采用上述方法配制的供試品溶液的pH值進行了測定,以確證其pH值符合上述要求。

1.2.2.3 前處理方法中使用濾膜是否會截留內毒素的驗證試驗 由于前處理方法中需要使用無熱原的濾膜對供試品稀釋液進行過濾,如果濾膜表面截留了內毒素,會影響供試品內毒素測定的準確性[15]。因此,將內毒素標準品溶液采用相同濾膜進行過濾,再進行靈敏度復核試驗,以驗證濾膜是否截留內毒素。

1.2.2.4 干擾試驗 配制6批供試品的1∶5稀釋液。使用上述4批鱟試劑進行干擾試驗,具體配制流程圖見圖2～圖3。

圖2 使用靈敏度為0.25 EU/mL的鱟試劑供試品系列溶液B配制流程圖

圖3 使用靈敏度為0.5 EU/mL的鱟試劑供試品系列溶液B配制流程圖

2 結果與分析

2.1 原擬定標準方法的復核和問題分析

2.1.1 原擬定標準方法的復核結果 采用3種靈敏度的6批鱟試劑,分別對6批供試品進行內毒素檢查,見表4。該結果顯示,當采用0.06 EU/mL的鱟試劑時,6批供試品的陽性(PPC)管均可凝結,與陽性對照(PC)管結果一致;但是當采用0.25 EU/mL或0.5 EU/mL的鱟試劑時,6批供試品的陽性(PPC)管均不凝結,與陽性對照(PC)管不一致。這表明使用0.25 EU/mL或0.5 EU/mL的鱟試劑,供試品對鱟試 劑與內毒素的凝結反應存在干擾作用[16-17]。

表4 原擬定標準方法復核結果

2.1.2 PPC管不凝結的原因分析及不同稀釋倍數的供試品溶液pH值測定 對各批供試品原液的pH值和稀釋后的pH值進行了測定(表5)。該結果顯示,按照最大稀釋倍數MVD進行稀釋,6批供試品稀釋10倍、20倍或83倍后,pH值均不在6.0-8.0的范圍,只是稀釋83倍后的供試品溶液pH值更接近8.0。供試品本身呈堿性,使用0.25 EU/mL或0.5 EU/mL的鱟試劑時,MVD僅為20倍或10倍,無法使供試品溶液處于pH中性范圍,影響了鱟試劑與內毒素的凝結反應,是導致干擾產生的主要因素。而本方法的限值為5 EU/mL,按照鱟試劑靈敏度不低于限值即可的原則,0.25 EU/mL或0.5 EU/mL均是可選擇的靈敏度,反而檢驗人員不易考慮到采用更高靈敏度的鱟試劑(0.06 EU/mL)。基于上述分析,原擬定標準的可執行性較差,需要進行進一步改進。

表5 供試品及稀釋液pH值測定結果

2.2 細菌內毒素檢查方法的改進

2.2.1 鱟試劑靈敏度復核 對兩個廠家的0.25 EU/mL和0.5 EU/mL兩種靈敏度的的鱟試劑分別進行標示靈敏度的復核,見表6、表7。該結果顯示,4批鱟試劑的最大濃度2 λ管均為陽性,最低濃度0.25 λ管均為陰性,陰性對照管陰性,試驗有效。4批鱟試劑的計算靈敏度λc均在0.5～2λ范圍內,靈敏度復核結果符合要求。

表6 0.25 EU/mL鱟試劑靈敏度復核結果

表7 0.5 EU/mL鱟試劑靈敏度復核結果

2.2.2 供試品前處理方法的改進 采用鹽酸溶液直接調節供試品溶液的pH值時,由于溶液沒有緩沖能力,容易出現少滴加一滴pH值仍處于堿性范圍,但再滴加一滴pH值又處于酸性范圍的情況,不易操作。因此摸索了不同濃度的鹽酸溶液溶解供試品的方法,結果發現,采用0.06 mol/L的鹽酸溶液將供試品稀釋5倍,可將所有批次的供試品溶液pH值均調節至6.0～8.0的范圍。

采用上述方法配制供試品溶液,磺胺二甲氧嘧啶鈉或磺胺間甲氧嘧啶鈉由鈉鹽變為游離狀態,溶解性降低,會產生白色沉淀。將磺胺間甲氧嘧啶鈉注射液的混懸稀釋液用0.45 μm無熱原濾膜進行過濾后即得澄清稀釋液。但將磺胺二甲嘧啶鈉注射液的混懸稀釋液立即過濾仍會再次產生白色沉淀,分析原因為立即過濾會使鹽酸與磺胺二甲嘧啶鈉反應不完全。故將磺胺二甲嘧啶鈉注射液的混懸稀釋液靜置2 h后過濾,即可得澄清稀釋液。具體配制方法見表8。

表8 供試品稀釋液配制方法及稀釋液pH值

2.2.3 前處理方法中使用濾膜是否會截留內毒素的驗證試驗 將內毒素標準品溶液采用相同濾膜進行過濾,再進行靈敏度復核試驗。結果表明,即便內毒素標準品溶液經濾膜過濾處理,計算靈敏度均符合要求,進而驗證了濾膜過濾對供試品中內毒素無截留作用。

2.2.4 干擾試驗 結果見表9～表12。該結果顯示6批供試品系列溶液A和陰性對照D都為陰性,并且系列溶液C的結果在鱟試劑靈敏度范圍內,判定試驗有效。ES在0.5～2.0 λ范圍內,6批供試品Et均在0.5～2.0 ES范圍內,判定供試品10倍或20倍稀釋液對0.5 EU/mL或0.25 EU/mL的鱟試劑與內毒素的反應均無干擾作用。

表9 使用安度斯/1903041(靈敏度為0.25 EU/mL)鱟試劑的干擾試驗結果

表10 使用廈門/19041022(靈敏度為0.25 EU/mL)鱟試劑的干擾試驗結果

表11 使用安度斯/1902012(靈敏度為0.5 EU/mL)鱟試劑的干擾試驗結果

表12 使用廈門/19041016(靈敏度為0.5 EU/mL)鱟試劑的干擾試驗結果

3 討論與結論

考慮到本試驗僅收集到磺胺二甲嘧啶鈉注射液和磺胺間甲氧嘧啶吶注射液各3批供試品,樣本量較小。而不同企業的處方組成和生產工藝的差異導致供試品的pH值可能存在更大差異性。因此檢驗人員可參考本方法所提供的供試品溶液pH值調節方法,如采用該方法仍無法使供試品溶液處于6.0～8.0的pH值范圍,可適當調整鹽酸溶液的濃度。

本標準經復核后被收載入2020年版《中國獸藥典》,標準規定為“取本品(必要時,可調節被測溶液的pH值,使其和鱟試劑混合后溶液的pH值在6.0～8.0的范圍內),依法檢查,每1 mL注射液中含內毒素的量應小于5 EU”。在執行該標準時,檢驗人員可選擇使用靈敏度較高的鱟試劑,也可采用鹽酸溶液調節pH值的方法,甚至也可以選用一些市售的商品化緩沖液進行稀釋[18],以達到消除干擾的作用。但無論采用哪種方法,均應進行干擾試驗,以確證消除了供試品溶液pH值對凝結作用的干擾。

目前《中國獸藥典》中收載的各品種項下的細菌內毒素檢查項,大多沒有供試品溶液配制方法的描述,這是基于保證方法通用性的考慮,檢驗人員執行標準時可自行選擇適宜靈敏度的鱟試劑和對應的稀釋方法。但對于本身呈強酸性或強堿性的供試品,稀釋后可能仍無法處于中性范圍。除本試驗所述磺胺類注射液外,可能存在類似干擾作用的品種還有注射用鹽酸土霉素、注射用鹽酸四環素、維生素B1注射液、維生素B6注射液等。檢驗人員在供試品溶液配制完畢后,需先進行pH值的測定,必要時采用適宜的酸或堿進行調節,以防止對凝結反應的干擾。

對磺胺二甲嘧啶鈉注射液和磺胺間甲氧嘧啶吶注射液的細菌內毒素檢查方法的擬定標準進行了改進,通過固定濃度的鹽酸溶液溶解供試品,再使用無熱原濾膜過濾的方法排除了干擾。通過上述供試品前處理方法的改進,檢驗人員無需采用特殊靈敏度的鱟試劑,亦可完全消除干擾作用,增強了標準的可執行性[19-20]。