HPLC法測定石椒草中蘆丁的含量

田樹興,馬 健,周崇富,劉紅光,李軍山

(1.云南神威施普瑞藥業有限公司,云南楚雄 675000;2.云南省中藥配方顆粒工程研究中心,云南楚雄 675000;3.神威藥業集團有限公司,河北石家莊 051430)

蘆丁是一種天然的黃酮衍生物,也被稱為蕓香苷、槲皮素-3-蕓香糖苷、槐糖苷、維生素 P等[1-3]。它具有抗氧化、抗心肌損傷、抗菌、抗炎、抗病毒、抗腫瘤等作用[4-6]。關于蘆丁含量測定的方法種類繁多,可通過多壁碳納米管(MWCNTs)及羧甲基纖維素鈉、二硫化錫、十六烷基三甲基溴化銨、羥基富勒烯和漆酶等構建電化學傳感器或生物傳感器,用于蘆丁的超靈敏檢測[7-9]。例如:樂薇等[10]通過殼聚糖基碳點紙芯片對槐米中蘆丁含量進行快速檢測;牛宏亮等[11]通過HPLC-MS/MS法對配制酒中的蘆丁含量進行測定;嚴成等[12]以蘆丁為對照品,通過紫外分光光度法對溪邊鳳尾蕨總黃酮進行測定。此外,也可通過高效液相色譜法對蘆丁進行含量測定[13-14]。

石椒草為蕓香科植物石椒草BoenninghauseniasessilicarpaLévl.的干燥全草[15],別名九牛二虎草、銅腳一枝蒿、白虎草、羊膻草,分布于四川、云南等地[16-17],具有清熱解毒,行氣活血等功效,常被用于感冒、乳蛾、痄腮、肺熱咳喘、脘腹脹痛、腎盂腎炎、脫疽、腰痛、跌打損傷等病癥[18-19]。石椒草收載于《云南省中藥材標準》,其中僅有幾個簡單的檢查項目,未規定含量測定項[20]。有學者從石椒草水煮液中分離得到蘆丁、石椒草堿[21];趙樹年等[22]從石椒草精油中鑒定出松油烯-4-醇等33種成分;陳于澍[23]用乙醚從石椒草的全草中提取并分離出二十八烷醇等5種化合物;尹連紅等[24]采用高速逆流色譜法從石椒草中分離制備高純度蘆丁。但是,關于石椒草中蘆丁的含量測定,目前國內外均未見報道,因此有必要建立石椒草中蘆丁的含量測定方法。由于高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)具有分析精度較高、分析速度快、重復性好等優點,故本文通過超聲提取,采用HPLC法對石椒草中蘆丁含量進行定量分析,以期為石椒草的質量控制提供依據。

1 儀器與材料

1.1 儀 器

Agilent 1200高效液相色譜儀(安捷倫科技公司提供);SK250LH超聲波清洗器(上?？茖С晝x器有限公司提供);XPE 26電子天平(d=0.001 mg,瑞士梅特勒公司提供);TU 1901雙束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司提供);Milli-Q IQ 7000超純水機(德國默克密理博公司提供)。

1.2 材 料

石椒草購自祿豐縣勤豐鎮恒康中藥經營部(產地分別為云南楚雄、云南安寧和云南祿豐),經河北省藥品檢驗研究院孫寶惠主任鑒定為蕓香科植物石椒草BoenninghauseniasessilicarpaLévl.的干燥全草。蘆丁對照品(中國食品藥品檢定研究院提供,批號為100080-202012,純度為91.6%);甲醇(色譜純,德國默克集團提供);冰醋酸(分析純,國藥集團化學試劑有限公司提供);實驗室用水為自制超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6 mm×150 mm,5 μm);流動相為甲醇-1%(體積分數,下同)冰醋酸溶液(體積比為30∶70);柱溫為25 ℃;檢測波長為257 nm;流速為1.0 mL/min;進樣量為10 μL。

2.2 供試品溶液的制備

取石椒草粉末(過4號篩)約1 g,精密稱定,加75%(體積分數,下同)的甲醇20 mL,超聲(功率為500 W,頻率為40 kHz)處理30 min,取出放至室溫,用75%的甲醇補足減失的質量,搖勻,用0.45 μm的微孔濾膜過濾,取續濾液作為供試品溶液,同法制備陰性樣品溶液。

2.3 對照品溶液的制備

精密稱取蘆丁對照品20.380 mg,置20 mL的量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,作為對照品儲備液,精密吸取對照品儲備液1 mL置10 mL量瓶中,加甲醇至刻度,作為對照品溶液(其質量濃度為93.34 μg/mL)。

2.4 專屬性試驗

取上述供試品、對照品和陰性樣品溶液,按照“2.1”項色譜條件測定,結果見圖1。蘆丁的理論塔板數為n=5.54(tR/Wh/2)2,其中:n為理論塔板數;tR為保留時間;Wh/2為半高峰寬;分離度R=2(tR2-tR1)/(W2+W1),其中tR2和W2分別為相鄰兩色譜峰中后一峰的保留時間及峰寬,tR1和W1分別為相鄰兩色譜峰中前一峰的保留時間及峰寬。結果詳見表1。該色譜條件能對供試品中蘆丁有較好的分離度,分離度大于1.5,且達到基線分離。

表1 理論塔板數及分離度

圖1 石椒草HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of Boenninghausenia sessilicarpa Lévl.

2.5 線性關系考察

精密吸取“2.3”項蘆丁對照品溶液1.0,2.5,5.0,7.5,10.0,12.5 μL,注入高效液相色譜儀,分別測定峰面積,以峰面積為縱坐標(Y),對照品進樣量為橫坐標(X),繪制標準曲線,得到蘆丁回歸方程Y=2 182 623.0X+38 076.2,R2=0.999 2,表明蘆丁進樣量在0.093 34～1.166 75 μg時與峰面積呈良好的線性關系。

2.6 精密度試驗

精密吸取按照“2.3”項制備的蘆丁對照品溶液10 μL,連續進樣6次,分別測定峰面積,計算得到RSD為1.04%,表明儀器的精密度良好,具體測定結果詳見表2。

表2 儀器精密度測定結果

2.7 穩定性試驗

精密吸取同一供試品溶液10 μL,在0,4,8,12,16,20,24 h分別進行測定,結果顯示24 h內峰面積無明顯變化,計算得到RSD為1.11%,表明被測樣品在24 h內穩定性良好,具體考察結果詳見表3。

表3 穩定性考察結果

2.8 重復性試驗

取同一批樣品(產于云南祿豐)6份,按“2.2”項方法分別制備供試品溶液并進行測定,計算得到RSD為0.55%。結果表明測定方法的重復性良好,具體考察結果詳見表4。

表4 重復性考察結果

2.9 加樣回收率試驗

取已知蘆丁含量的適量樣品(產自云南祿豐),約0.6 g,共6份,蘆丁的質量分數為2.274 mg/g,精密稱定,分別加入質量濃度為1.400 4 mg/mL的蘆丁對照品溶液1 mL,揮干溶劑,按“2.2”項方法制備供試品溶液。按上述色譜條件進樣測定蘆丁含量,計算回收率,結果詳見表5。

表5 加樣回收率試驗結果

2.10 色譜柱耐用性試驗

分別用Thermo Acclaim TM 120 C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色譜柱(美國賽默飛世爾科技公司提供)和Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6 mm×150 mm,5 μm)色譜柱進行蘆丁含量的測定,考察其耐用性,結果顯示2種色譜柱均能取得較好的分離效果,耐用性良好。

2.11 樣品含量測定

分別取不同產地的石椒草,按“2.2”項方法制備供試品溶液,并進行蘆丁含量的測定,結果詳見表6。

表6 樣品含量測定結果

3 討 論

3.1 流動相的選擇

HPLC法測定蘆丁含量大多采用甲醇-冰醋酸、磷酸或乙腈-磷酸溶液[25]。本研究選用甲醇-1%冰醋酸溶液為流動相,并在比例上進行優化,以甲醇與1%冰醋酸溶液的體積比分別為32∶68,30∶70,28∶72進行比較,結果顯示體積比為32∶68的樣品主峰分離度較差,體積比為30∶70和體積比為28∶72的樣品分離度較好,且基線波動小,但體積比為28∶72的樣品主峰保留時間較長,故選擇體積比30∶70的甲醇-1%冰醋酸溶液作為流動相。

3.2 波長的選擇

Agilent 1200 Series高效液相色譜儀DAD檢測器的波長范圍為200～400 nm。通過紫外可見分光光度計對對照品溶液進行波長掃描,發現蘆丁在257 nm和359 nm有較大吸收,257 nm比359 nm的吸收值更大,波長掃描結果見圖2。綜合分析,在257 nm波長下的色譜圖基線平穩,雜峰少,故選擇257 nm進行檢測分析。

圖2 蘆丁的波長掃描圖Fig.2 Wavelength scan of rutin

3.3 色譜柱的選擇

對比發現,使用Thermo AcclaimTM120 C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)、Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6 mm×150 mm,5 μm)色譜柱均能取得較好的分離效果,但Thermo AcclaimTM120 C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)為長柱,出峰時間較晚。從節約能源和時間的角度考慮,選擇Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6 mm×150 mm,5 μm)作為測定用色譜柱。

3.4 提取溶劑的選擇

分別采用體積分數為25%,50%,75%的甲醇溶液,以及純甲醇作為提取溶劑,并對提取效果進行比較。結果顯示,25%甲醇溶液的提取率較低,50%甲醇和純甲醇的提取率相近;75%甲醇的提取率最高,且對蘆丁含量的測定無干擾,基線平穩,故選用75%的甲醇溶液作為提取溶劑。

3.5 提取時間的選擇

分別對超聲提取時間為10,20,30,40,50 min制備的供試品進行考察,結果顯示超聲提取10 min和20 min的樣本蘆丁提取率較低,而超聲提取30,40和50 min的樣本蘆丁提取率相近,故選擇超聲提取時間為30 min。

4 結 語

本文利用HPLC法測定民族藥石椒草中蘆丁的含量,分別對流動相、檢測波長、色譜柱、提取溶劑及提取時間等進行考察,最終確定了HPLC法測定民族藥石椒草中蘆丁含量的最優條件,即以甲醇-1%冰醋酸溶液(體積比為30∶70)為流動相,柱溫為25 ℃,檢測波長為257 nm,流速為1.0 mL/min,進樣量為10 μL。結果表明,當蘆丁含量為0.093 34～1.166 75 μg時與峰面積會呈現良好的線性關系,此時R2為0.999 2,平均回收率(n=6)為99.49%。該方法準確可靠,且具有分離度好、靈敏度高、準確性高、供試品制備簡單等優點,可為石椒草質量評價及標準提升提供可靠依據。

由表6可知,3種不同產地的石椒草中均含有蘆丁,但不同產地的石椒草中蘆丁含量的差別較大。這與文獻研究結果相一致,不同的產地、采收期、采收部位及加工方式,其藥材中有效成分的含量有較大差異[26-30]。未來應繼續深入研究不同產地、采收期、采收部位及加工方式等對石椒草中含量的變化差異,以利于石椒草的質量控制及保證臨床療效。