養殖場非洲豬瘟自檢實驗室操作規范及關鍵點

周小鈺，陳海軍，蔡東森，徐偉風，李開軍

1.南京市畜牧家禽科學研究所，江蘇南京 210036；2.南京市畜牧技術推廣站，江蘇南京 210036

非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒引起的一種高度接觸傳染性疾病，由于目前非洲豬瘟依然沒有有效的疫苗和藥物進行防治，檢測、撲殺、隔離是阻斷非洲豬瘟傳播的唯一途徑，因此病毒檢測在養殖場生產環節中發揮至關重要的作用。熒光PCR 方法檢測非洲豬瘟病毒核酸具有特異性好、操作簡單、成本低、結果準確可靠等優點。但在實際檢測過程中可能會由于操作不規范等導致檢測結果出現偏差，進而影響判斷，甚至可能會造成環境的污染。為了防止交叉污染，確保檢測結果的準確性，本文總結了檢測前準備、檢測過程、檢測結束后處理的操作關鍵點及相關注意事項，為養殖場開展非洲豬瘟自檢工作提供參考依據。

1 檢測前準備

1.1 檢測實驗室布局要求

養殖場檢測實驗室應遠離生產區，按照《非洲豬瘟常態化防控技術指南》中養殖場非洲豬瘟自檢實驗室建設規范的內容要求進行合理的區域劃分，包含準備區、核酸提取區和核酸擴增區，各區域內均設有紫外消毒設備。

1.2 檢測人員必要條件

實驗室檢測人員需熟悉非洲豬瘟檢測流程及要點，并接受實驗室分子生物學檢測技術及生物安全相關知識培訓，培訓合格后方可上崗。

1.3 實驗室主要配置

每間實驗室均準備專用工作服、無菌乳膠手套、一次性口罩、鞋套和帽子、稀釋后的84 消毒液、75%的酒精、廢液桶等，注意各區域的儀器、耗材等禁止交叉使用。準備區主要配置衣柜或衣架、鞋架等；核酸提取區主要配置核酸提取儀、高速離心機、渦旋儀、恒溫水浴鍋及配套耗材用于檢測，冷藏冷凍冰箱用于檢測試劑、檢測樣本等保存，高壓滅菌器用于檢測廢棄物處理；核酸擴增區主要配置熒光PCR 儀及配套耗材等。

1.4 試劑及耗材準備

提前準備好檢測所需的試劑及耗材并檢查各類試劑的有效期等，帶濾芯的專用吸頭和PCR 管等檢測耗材需經過高壓滅菌后使用。檢測開始前60 min 將需用的移液器、無菌吸頭和離心管等提前消毒好放入生物安全柜，并開啟生物安全柜紫外燈照射消毒。在緩沖間準備好本次檢測專用的實驗服、一次性無菌口罩、一次性鞋套、乳膠手套等，實驗室的地面、臺面、生物安全柜等經75%酒精擦拭消毒后，開啟實驗室紫外照燈進行消毒。

2 檢測過程操作規范

2.1 樣本采集

科學采集樣本進行檢測，在做好工作人員及檢測場所生物安全防護工作的前提下，嚴格按照中國動物疫病預防控制中心發布的《養殖場非洲豬瘟變異株防控技術指南》的要求采集樣本，主要采集樣本類型包括血液、組織、口腔液和拭子等。新鮮采集的樣本需用專用容器密閉包裝好后在2 ～8 ℃條件下盡快送檢。

2.1.1 血液樣本：使用含EDTA 抗凝劑的真空采血管通過豬前腔靜脈、耳緣靜脈或尾靜脈采集豬全血（不可使用含肝素的采血管，避免影響檢測結果），注意采集后顛倒混勻。

2.1.2 組織樣本：用不同規格的離心管或自封袋采集組織樣本，組織樣本類型包括脾臟、扁桃體、淋巴結、腎臟等。

2.1.3 口鼻拭子：日常監測可采集豬口鼻拭子，對豬產生的應激和損傷小，使用無菌采樣棉簽插入豬的口腔或鼻腔中，棉簽在口腔或鼻腔內旋轉刮取后將其裝入離心管中。

2.1.4 口腔液樣本：對規模豬場育肥豬群等大欄可使用棉繩采集口腔液進行病原檢測。在早上飼喂前將棉質繩子放入欄舍內，吸引豬來咀嚼，懸掛時間30 min 后將棉繩放入封口袋中，通過在袋內擠壓棉繩收集口腔液，隨后將袋內口腔液收集到離心管中。2.1.5 環境樣本：使用棉拭子采集環境樣本，主要針對豬場內易與外部環境接觸的風險點，用生理鹽水浸潤的無菌棉簽在環境表面擦拭后裝入離心管中。液體環境樣本直接用無菌吸管或注射器取適量液體至離心管中。

2.2 樣本接收

樣本接收過程需注意規范，避免對環境造成污染。實驗室接收樣本時，應先在外包裝四周噴灑消毒劑，作用一定時間后取出樣品包裝袋及采樣單等送至檢測實驗室并由檢測人員及時做好編號或標注，避免混淆。樣本接收完成后需對接樣環境用紫外燈進行紫外消毒30 min 以上。接收的樣本由檢測人員帶入實驗室后直接放入生物安全柜，開始檢測前必須確保生物安全柜保持開啟且有效狀態。

2.3 樣本前處理

打開樣本包裝袋取樣時動作不宜過大，防止氣溶膠污染。不同的樣本類型需采用不同的方式進行處理，抗凝血、血清、精液、口腔液等液體樣本經高速冷凍離心機離心后取上清液用于核酸提取；固體組織樣本經勻漿處理后離心取上清液用于核酸提取，不宜直接取樣本原液進行檢測，這樣易造成檢測結果不準確；拭子樣本經稀釋液充分浸潤后取浸泡液用于核酸提取。樣本處理結束后，剩余的樣本用新的密封袋集中裝好后做好標記并密封，包裝表面噴灑消毒劑后于-20 ℃保存，根據實驗室檔案資料保存規范保存一定期限后再進行無害化處理。

2.4 核酸提取

2.4.1 樣本的核酸提取可選擇商品化病毒核酸提取試劑盒并按照試劑盒說明書的步驟進行操作，有條件的實驗室也可使用核酸提取儀進行操作。

2.4.2 使用核酸提取試劑盒進行操作時，提前根據樣品數量將核酸提取所需離心管置于管架上，檢測過程中盡量不用手直接拿取離心管，如有需要，可用鑷子夾取。

2.4.3 檢測過程中不同的核酸提取步驟都應選擇容量適宜的移液器和帶濾芯的吸頭，取樣加樣等過程要動作輕柔，防止加樣過程中液體過多導致回流進而污染移液器。離心管內的樣品量不宜過多且離心管開閉過程中動作要輕，防止管內液體溢出或造成氣溶膠污染。

2.4.4 核酸提取過程中產生的廢棄物、廢棄吸頭及離心管等要集中裝在生物安全柜的廢液桶內，廢液桶內提前加入消毒劑并使廢棄物浸泡在消毒液里。

2.4.5 操作過程應全程穿戴無粉無菌乳膠手套，若發生樣本液體溢出等污染風險時必須及時更換手套并進行消毒，核酸提取步驟結束后更換乳膠手套進行下一步操作。

2.4.6 核酸提取后在室溫環境容易降解，最好提取后立即進行PCR 檢測。若不立即進行PCR 反應，需保存于-80 ℃，并盡快完成檢測。

2.5 PCR 擴增反應

2.5.1 PCR 擴增反應可選擇商品化非洲豬瘟PCR 檢測試劑盒并按照試劑盒說明書進行反應體系配制及反應條件設置等操作，提前30 min 將PCR 檢測試劑盒置于室溫，需等到試劑盒內各反應液均充分回溫溶解后開始檢測。

2.5.2 檢測人員將提取后的核酸送至核酸擴增區，人員在實驗室內的流動按照準備區-核酸提取區-核酸擴增區的順序單向活動，通過各區域間的傳遞倉定向傳遞樣本，防止在樣本轉接過程中對環境造成污染。

2.5.3 提前根據檢測樣品量計算反應體系內各反應液的用量，選擇容量適宜的移液器和濾芯吸頭進行操作，加樣加至PCR 反應管底部，應避免產生氣泡，確保加樣量和檢測結果的準確性。

2.5.4 配制PCR 反應體系時必須使用帶濾芯的吸頭，最先加陰性對照并蓋上PCR 管蓋，所有待檢樣品核酸加完后，最后加陽性對照，所有加樣完成后檢查PCR 管蓋是否蓋緊。

2.5.5 PCR 擴增反應結束后不要打開PCR 管蓋，直接棄置于醫療廢棄物袋中，防止氣溶膠污染，按照實驗室生物安全相關要求進行處置。

3 檢測后處理

3.1 檢測廢棄物處理

檢測結束后，將所有廢棄物品集中裝于醫療廢棄物袋中并密封，外表噴灑消毒后經121 ℃高壓滅菌處理后移出實驗室，按照醫療廢棄物途徑銷毀。處理樣本使用到的剪刀、鑷子等可重復使用的物品，應放入塑料或不銹鋼盒內，用消毒液浸泡30 min后再進行高壓處理，處理結束后放回原處。

3.2 環境消毒

生物安全柜使用結束后用核酸祛除劑或75%酒精對內部及外部進行全面擦拭消毒，柜內通風運行10 min 后開啟紫外燈照射消毒30 min。檢測室內的地面、墻面及實驗臺桌面在檢測結束后用核酸祛除劑或75%酒精整體噴灑消毒，人員離開檢測室后開啟紫外燈進行室內消毒。檢測專用工作服需定期用消毒液浸泡清洗，且不得隨意穿出檢測室。

3.3 檔案管理

檢測結束后，如實填寫檢測報告和相關記錄。若出現陽性結果，應按照《非洲豬瘟疫情應急實施方案（第五版）》相關要求和規定處置及溯源。檢測記錄和檢測報告應真實、規范、完整，存檔不少于24 個月。

4 小結

實驗室檢測技術已成為非洲豬瘟防控的關鍵環節之一。養殖場逐步規范和完善樣本采集和實驗室檢測操作流程，可確保檢測數據的真實可靠，對防控非洲豬瘟發揮重要作用，同時避免造成環境和樣本的污染，以期指導生產工作，有條件的養殖場也可病原檢測和抗體檢測工作同時展開，為非洲豬瘟等重大疫病的監測提供科學準確的參考依據。