熱應激對魚類生命活動影響的研究進展

黃天晴，董福霖,2，劉恩慧，徐革鋒，王高超，姚作春，王炳謙，谷偉

（1.中國水產科學研究院黑龍江水產研究所，農業農村部淡水水產生物技術與遺傳育種重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150070；2.上海海洋大學水產與生命學院，上海 200120）

近年來，隨著全球變暖養殖水體溫度升高，對魚類的熱應激日愈增加。水溫是水產養殖中最關鍵的環境因素之一，而日常或季節性熱波動和培養水溫的變化顯著影響魚的生長。水產養殖中高溫脅迫造成魚體疾病爆發頻率升高、代謝及免疫能力下降等一系列危害，直接影響養殖的經濟效益。本文綜述了熱應激對魚類生命活動影響的最新研究成果，包括代謝與生長、抗氧化能力以及熱休克蛋白等，以期為魚類生產實踐及相關生理生態研究提供參。

1 應激

1.1 應激的概念

1936 年加拿大麥吉爾大學的病理學家Hans Selye 首次提出[1]：應激是生物在長期進化過程中產生的適應性和保護性的機制，主要作用是維持機體的穩態。機體對應激有一定的適應范圍，刺激超出這個范圍時，機體的穩態就會被破壞[2]，長期或者過度的刺激對機體的生理[3]和心理[4]產生不利影響。達到一定的強度，引起機體非特異性應答反應的刺激稱之為應激源[2]。按照應激源的性質，水產養殖中的應激源可分為三大類：管理脅迫、物理脅迫以及生物脅迫。其中管理脅迫包括養殖病害處理、運輸、性別分選、捕捉、分池和養殖的不當操作[5]等。物理脅迫包括鹽度、氨氮、pH、光照以及溫度等。生物脅迫包括病原生物的入侵以及擁擠等[6]。

1.2 應激的種類

目前，對魚類應激反應的研究已十分深入和廣泛。根據反應發生的組織水平，生理應激反應分為初級、二級和三級應激反應[7]。初級應激反應發生在機體內分泌系統和神經系統水平上。它是在應激源刺激機體后立即出現的反應。與哺乳動物相似，魚類包括兩個應激激素反應系統：交感—腎上腺髓質系統和下丘腦—垂體—腎間組織軸[8]。當魚類受到應激時，首先激活交感—腎上腺髓質系統。該系統合成和分泌大量去甲腎上腺素。其次，也會激活下丘腦—垂體—腎間組織軸，促進皮質醇的合成與分泌，腎上腺激素和皮質醇分別通過擴散作用和血液流動作用于靶器官或靶組織，引起一系列的代謝和生理變化，起到特定的生物學功能[9]。刺激反應是應激激素調控的生理生化以及免疫過程，包括呼吸系統、心血管系統、能量代謝以及電解質平衡等生物學功能的改變。三級應激反應發生在二級應激反應的基礎上，是魚類個體或群體水平上的變化，魚體適應了應激源或隨著應激水平的提升發生了抗病能力、繁殖能力以及生長能力的變化[5]。

1.3 熱應激

熱應激是高溫下，機體對熱刺激所做的一系列非特異性生理反應的總和[10]。魚類都是變溫動物，溫度是影響魚類生存的重要環境因素。它可以影響魚類的代謝率、生長率以及攝食率等[11]。熱應激的影響增加了水產養殖的困難，研究熱應激對魚類的影響十分必要。

2 熱應激對魚類的影響

2.1 熱應激對魚類代謝與生長的影響

溫度是顯著影響魚類生長發育的重要因素之一。大多數魚都是水生變溫動物，無法靠自身獲取穩定的熱量；體表和鰓不停地與外界進行熱量交換，無法保持與外界水溫不同，所以，溫度就成為影響魚類生長發育和代謝的重要因素之一[12]。水溫還通過影響環境中其他生物的生長和物質能量循環來影響魚類的生長發育和代謝[10,13]。

水溫過高或過低都會影響魚類的正常生長。在最適溫度范圍內，魚類的攝食率和生長率隨水溫的升高而升高，當溫度超過了生存上限溫度后，生長率就開始下降，甚至大量死亡。魚類的生長速度依賴于攝食量及魚類活動代謝和基礎代謝后的剩余能量[14]。徐冬冬等[15]研究表明，對褐牙鲆（Paralichthys olivaceus）的最適生長溫度為25℃，當超過此溫度時，褐牙鲆的特定生長率與攝食率開始下降，并與水溫的平方呈顯著的負相關，即特定生長率和攝食率隨水溫的升高而下降。

消化酶活性是反映魚類消化生理機能的重要指標之一。熱應激使美洲鰣（Alosa sapidissima）消化酶活性降低，影響魚體的代謝速率[16]。而徐奇友[17]的研究表明，水溫不僅直接影響消化酶的活性，還間接地通過影響魚類消化酶的分泌量、體內離子含量等來影響魚類消化酶的活性。在10℃～40℃內，大黃魚（Larimichthys crocea）除了前腸外，肝臟、胰臟、胃以及后腸中蛋白酶的活性均先上升、后下降[18]。

在適宜溫度范圍內，魚類的代謝速率也隨溫度的升高逐漸上升[19]。這是因為在水溫升高的過程中，維持魚體生命活動的各種代謝酶活性、呼吸頻率[20]增強，新陳代謝加快，代謝速率上升[21]。在陳婉情等對花斑刺鰓鮨（Plectropomus leopardus）、駝背鱸（Chromileptes altivelis）、棕點石斑魚（Epinephelus fuscoguttatus）等五種海水養殖魚類的研究發現，雖然對溫度變化的敏感性不一致，但是五種魚類的呼吸頻率均隨著水溫的升高而升高[22]。

2.2 熱應激下魚類血液指標變化

魚類的血液生理指標與魚類的營養狀況、代謝以及疾病密切相關。當魚體受到外界應激源刺激發生生理變化時，就會從血液生理指標上反映出來[23]。在不同的環境溫度下，血液生理指標可以反映組織器官的功能狀態、代謝以及魚類的健康狀況和對環境的適應性[13]。

血細胞在血液中數量最多，是魚體內運輸氧氣等物質的最主要媒介。血液中紅細胞的數量受多種因素的影響，但Collazos 等[24]研究表明，水溫是影響魚類體內紅細胞數量最主要的因素。管標[25]研究表明，虹鱒（Oncorhynchus mykiss）急性熱應激后0 h 和6 h 時，血液中紅細胞的數量明顯低于對照組，直到熱應激48 h 后，紅細胞數量才恢復正常。

血清當中含有白蛋白和球蛋白，二者合稱總蛋白。血清總蛋白主要起維持血漿pH 和滲透壓平衡、運輸、凝血、供應能量以及免疫等功能[26]。何福林等[28]研究中發現，虹鱒血液中總蛋白的含量隨溫度升高而升高，而鳙（Hypophthalmichthys nobilis）的總蛋白在23℃時大幅度減少[27]。溫度對羅非魚（Oreochromis mossambicus）血液中總蛋白含量影響不顯著，說明了魚類血液中總蛋白的含量是否受溫度影響與魚的種類有關。

正常情況下，谷草轉氨酶（AST）和谷丙轉氨酶（ALT）主要存在于各種細胞中，特別是心臟和肝臟中，只有少量在血液中，在脂肪、蛋白質、糖類三大物質循環中起重要作用。魚受到刺激時，兩種酶被釋放到血液中，影響魚類。夏斌鵬等[23]對虹鱒研究顯示，AST 和ALT 在26℃時活性顯著高于18℃。在冀德偉等[29]對大黃魚的研究中也發現了AST 和ALT活性隨溫度升高而升高的現象。

2.3 熱應激對魚類抗氧化能力的影響

在正常狀況下，魚類體內活性氧（ROS）的濃度會保持在一定的范圍內，當魚類受到溫度應激時，ROS 產量增加，進一步產生過量脂質過氧化物（LPO），損傷膜和酶活性，影響細胞活性，加速細胞衰老、核酸和蛋白質的凋亡和氧化，進一步傷害魚體[30]。魚體內存在兩種消除過多ROS 的途徑：酶聯通路和非酶聯通路。前者涉及到多種抗氧化酶，例如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等，以減少魚類體內氧化代謝時產生的多余ROS[30]。

在熱應激期間，吉富羅非魚（Oreochromis mossambicus）、牙鲆、大菱鲆（Scophthalmus maximus）、虹鱒和硬頭鱒等多種魚的抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px活性均表現出不同程度的升高，對熱應激做出應答，以防治氧化損傷。

2.4 熱應激下魚類熱休克蛋白（HSP）的表達變化

熱休克蛋白（HSP）是一類在多種生物和非生物應激源作用下表達的蛋白質家族，也被稱為應激蛋白[32]。主要的熱休克蛋白分子質量在15～110 kDa之間，依大小和功能被分成不同的家族[33]。對模式物種的廣泛研究揭示了熱休克蛋白的三個主要家族：熱休克蛋白90（85～90 kDa）、熱休克蛋白70（68～73 kDa）和低分子量熱休克蛋白（16～47 kDa）[34]。

HSP70 家族蛋白質功能至關重要，包括折疊、細胞內定位、調節、分泌和蛋白質降解等[35]，研究得最廣。HSP70 是最保守的熱休克蛋白家族之一，在所有被研究的細胞中都發現了它，不同生物間的氨基酸序列同一性值在42%～57%之間[36]。目前已克隆和測序了多種魚類的HSP70 的基因序列，包括大黃魚[37]、虹鱒[38]、團頭魴（Megalobrama amblycephala）[39]、羅非魚[40]以及鯉（Cyprinus carpio）[41]等。自被發現以來，熱應激后魚類HSP70 的表達一直是其研究的熱點。強俊等[42]發現，溫度顯著影響羅非魚肝臟HSP70 的表達水平。在35℃下，HSP70 的表達呈先上升后下降的趨勢，在熱應激后12 h HSP70 的表達最高。柳意樊等[43]比較了大菱鲆在熱應激后不同組織中HSP70 的表達情況，發現與最初水平相比較，各組織中的HSP70 的表達水平均上調，肌肉中上調最高，其次是肝、腸、鰓、心、脾、胃、腎和腦。同樣，Wang 等[44]對鯉熱應激的研究中發現，輕度和中度熱應激都會導致心臟和腎臟中HSP70 表達上調，也呈現出了先上升后下降的趨勢，這與強俊等對羅非魚的研究相一致。

對魚類HSP90 的研究晚于對HSP70 的研究，直到2008 年才證實魚類HSP90 中存在HSP 90α和HSP90β 兩種構型[45]。HSP90 是一種豐富的分子伴侶，參與真核細胞的細胞保護。在非應激下，它占總蛋白質的1%～2%[46]。HSP90α 是HSP90 的誘導形式，它折疊、穩定并調節許多細胞蛋白的功能[47]。HSP90β 具有廣泛的伴侶功能，是真核細胞中表達量最高的熱休克蛋白[48]。Moon-Kyeong Shin 等研究發現，斑點鱸的熱應激HSP90α 在肝臟、肌肉以及鰓組織中的表達量均隨水溫的升高和暴露時間的延長而增加[49]。而虹鱒中的HSP90β 表達在非應激組的腦、肝和心臟的基礎表達水平明顯高于其他組織，熱應激12 h 后，心臟、頭腎、腦和鰓的HSP90β水平分別是非應激組的4.76 倍、4.03 倍、3.08 倍和2.70 倍[48]。

2.5 熱應激對魚類免疫的影響

魚具有完整的非特異性和特異性免疫能力[20]，可以通過黏膜屏障、血液和組織中各種免疫因子和細胞協同抵御外來病原體的侵害[50]。在各種免疫應答中，溶菌酶是魚類中至關重要的非特異性免疫參數。溶菌酶活性受溫度、應激和毒物的刺激[51]。吞噬作用也是一種主要的非特異性免疫應答。它將大顆粒吞噬入細胞液泡內以除去病原微生物，是評價魚類健康狀況和免疫能力的主要免疫學指標[52]。

羅非魚在持續的高溫刺激下，溶菌酶的活性顯著低于對照組[53]。在24℃、25℃時，虹鱒溶菌酶的活性也顯著低于18～23℃時[23]。半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）在27℃應激96 h 后，溶菌酶的活性上升[54]，說明溶菌酶同其他的酶相似，在一定的溫度范圍內，活性隨溫度升高而增強，當溫度超過上限時，機體受到破壞，溶菌酶活性下降。

3 小結

水溫影響水產養殖中魚類生命活動的各個方面，水溫過時，魚類生長率和代謝速率下降，甚至會死亡，最終影響魚類的產量。過高的水溫還會導致魚體內熱休克蛋白量增加以及免疫能力的下降。因此在水產養殖過程中要嚴格調控水溫，避免對魚體造成刺激，保證最終的經濟收益。