皺葉山姜組織培養(yǎng)技術(shù)研究

鄧小果何柔靜李貴雨

(1.海南開放大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村學(xué)院，海南 海口 570208；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院海口實(shí)驗(yàn)站，海南 海口 571101)

皺葉山姜(Alpinia rugosa S.J.Chen &Z.Y.Chen)是姜科山姜屬新種，皺葉山姜產(chǎn)自海南吊羅山，生長在陰暗潮濕的山谷森林；海拔600～800m。皺葉山姜假莖0.5～1.2m，葉舌皮質(zhì)，雙葉，長約1cm，具長硬毛；葉柄1～5cm，短柔毛；葉片長圓，葉面無毛，背面密被短柔毛，極具皺紋，基部深心形重疊。總狀花序直立，密花，有9～20朵花，蒴果橢圓形。自1990年引種到華南植物園后，國內(nèi)的西雙版納植物園和國外夏威夷自華南植物園引種。夏威夷已將皺葉山姜繁殖應(yīng)用。該植物以其葉皺縮，具有極高的園藝觀賞性，是姜科新型園藝觀賞作物。

植物組織培養(yǎng)廣泛應(yīng)用于植物脫毒和快速繁殖[1-5]、倍性育種[6-8]、種質(zhì)資源保存[9]等研究。皺葉山姜可采用分株繁殖的方式進(jìn)行種苗繁殖，此方法雖能保持母體的性狀，但繁殖系數(shù)較低。目前關(guān)于皺葉山姜組織培養(yǎng)方面的研究尚未有報道。本研究以皺葉山姜吸芽為試驗(yàn)材料，探討了1/2MS、MS基本培養(yǎng)基、激素及其濃度對芽的誘導(dǎo)、增殖及生根培養(yǎng)的影響，篩選出最佳培養(yǎng)基，建立了皺葉山姜組織培養(yǎng)技術(shù)，不僅為其快速繁殖、工廠化生產(chǎn)提供技術(shù)基礎(chǔ)，還有利于保持母株的優(yōu)良性狀。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為皺葉山姜健壯吸芽。

1.2 方法

1.2.1 外植體的采取及處理

在晴朗天氣的10：00左右，選擇健壯的母株，取約10cm大小一致的吸芽作為外植體，切下來的吸芽用自來水洗掉其上面的泥土，然后用解剖刀將其葉鞘撥除，后用自來水沖洗5min，置于超凈工作臺上，準(zhǔn)備消毒。

1.2.2 外植體的滅菌

將處理好的吸芽置于超凈工作臺上，用沾有75%的棉花擦拭處理好的吸芽，放入75%的酒精中輕輕搖動10s，用無菌水浸洗1～2次。接著，將吸芽放入0.1%升汞溶液中消毒8min，再用無菌水浸洗3～4次。

1.2.3 誘導(dǎo)培養(yǎng)

將經(jīng)過消毒好的吸芽，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。設(shè)置1/2 MS、MS為基本培養(yǎng)基，在2種培養(yǎng)基中分別加入不同濃度的6-BA，6-BA濃度分別為0mg·L-1、1.0mg·L-1、2.0mg·L-1、3.0mg·L-1、4.0mg·L-1。30d后統(tǒng)計誘導(dǎo)發(fā)芽率。

發(fā)芽率(%)=發(fā)芽數(shù)/(接種數(shù)-污染數(shù))×100%

1.2.4 增殖培養(yǎng)

將經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后形成的芽，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的6-BA和TDZ組合，6-BA濃度為1.0mg·L-1、2.0mg·L-1，TDZ濃度為0mg·L-1、1.0mg·L-1、2.0mg·L-1、3.0mg·L-1、4.0mg·L-1。30d后統(tǒng)計增殖系數(shù)。

增殖系數(shù)=產(chǎn)生芽數(shù)/接種芽數(shù)

1.2.5 生根培養(yǎng)

叢生芽經(jīng)過數(shù)次繼代增殖之后，可進(jìn)行壯苗生根。當(dāng)叢生苗上有4片葉子并且苗高為3cm時，將叢生苗分株后，轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中，基本培養(yǎng)基為1/2 MS，在培養(yǎng)基中加入NAA濃度分別0.1mg·L-1、0.2mg·L-1、0.3mg·L-1、0.4mg·L-1。30d后統(tǒng)計生根率。

生根率(%)=生根株數(shù)/接種株數(shù)×100%

1.2.6 培養(yǎng)條件

本試驗(yàn)配置的誘導(dǎo)、增殖及生根培養(yǎng)基均加入30g·L-1蔗糖和7.5g·L-1卡拉膠，pH值為5.8，在121℃、1.1kg·cm-2的高溫高壓下滅菌22min。培養(yǎng)室光照強(qiáng)度為1000～1200lx；溫度26℃左右。

2 結(jié)果與分析

2.1 1/2 MS、MS基本培養(yǎng)基及不同6-BA濃度對叢生芽誘導(dǎo)的影響

將接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中吸芽放置培養(yǎng)室中進(jìn)行7d的暗培養(yǎng)，后給予光照培養(yǎng)。培養(yǎng)4周后，觀察不同處理的生長情況。結(jié)果見表1，在1/2 MS培養(yǎng)基中，6-BA濃度在1.0～3.0mg·L-1，隨著濃度的增加，發(fā)芽率越高，當(dāng)6-BA濃度為4.0mg·L-1時，發(fā)芽率反而下降。在同一6-BA濃度下，相比MS培養(yǎng)基，1/2MS培養(yǎng)基比MS培養(yǎng)基發(fā)芽率均高。當(dāng)培養(yǎng)基為1/2MS，6-BA的濃度為3.0mg·L-1，發(fā)芽率最高為82.61%，叢生芽長勢好。綜上所述，最適宜皺葉山姜芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1/2 MS加6-BA 3.0mg·L-1加TDZ 2.0mg·L-1加NAA 0.1mg·L-1。

表1 1/2 MS、MS培養(yǎng)基及6-BA濃度對叢生芽誘導(dǎo)的影響

2.2 增殖培養(yǎng)

用誘導(dǎo)形成的叢生芽轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基上。在轉(zhuǎn)接時，要將新長出的葉片切掉，注意切時不要傷到生長點(diǎn)，將叢生芽轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基上，30d后觀察芽增殖情況。

從表2可以看出，不同濃度6-BA和TDZ組合，對皺葉山姜組培增殖系數(shù)均有影響。在沒有添加任何激素的培養(yǎng)基上，芽的增殖系數(shù)最低為1.12，芽長勢弱，褐化較嚴(yán)重；當(dāng)6-BA為1.0mg·L-1，叢生芽的增殖系數(shù)隨著TDZ濃度增加而增加，增殖系數(shù)最高為2.88；當(dāng)6-BA為2.0mg·L-1時，TDZ濃度在0～2.0mg·L-1，增殖系數(shù)隨著TDZ濃度增加而增加，當(dāng)TDZ濃度在3.0～4.0mg·L-1時，增殖系數(shù)反而下降。當(dāng)6-BA濃度為2.0mg·L-1、TDZ濃度在2.0mg·L-1時，叢生芽增殖系為4.04，叢生芽生長健壯。綜上所述，最適的增殖培養(yǎng)基為1/2 MS加6-BA 2.0mg·L-1加TDZ 2.0mg·l-1加NAA 0.1mg·l-1。

表2 激素濃度配比對叢生芽增殖的影響

2.3 生根培養(yǎng)

當(dāng)叢生苗長有3～4片葉子，并且高為3cm時，轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，在轉(zhuǎn)接時，要將叢生的小苗一株株分開，已長出的根系切掉。小苗培養(yǎng)30d后，統(tǒng)計生根率及根系生長情況。結(jié)果見表3，當(dāng)培養(yǎng)基中沒有添加NAA時，植株生根率為86%，為所有培養(yǎng)基中生根率最低。當(dāng)NAA濃度為0.1mg·L-1時，生根率達(dá)到99%，植株長勢健壯，根多且粗。當(dāng)NAA濃度為0.2mg·L-1時，生根率反而下降，且NAA濃度越高，生根率反而下降。綜上所述，最佳生根培養(yǎng)基為1/2 MS加NAA 0.1mg·L-1。

圖1 叢生芽 圖2 生根小苗

表3 NAA的濃度對皺葉山姜的影響

3 討論與結(jié)論

植物組織培養(yǎng)和快繁技術(shù)已應(yīng)用于姜科花卉及姜科藥用植物種苗的快繁中[10-13]。不同物種在組織培養(yǎng)過程中，對基本培養(yǎng)基的要求也不同。組織培養(yǎng)最常用的基本培養(yǎng)基是MS和1/2 MS，兩者的區(qū)別在于大量元素含量，在配置培養(yǎng)基時，1/2 MS是將MS大量元素減半，其他元素不變。本研究選用MS和1/2 MS培養(yǎng)基作為皺葉山姜芽誘導(dǎo)的基本培養(yǎng)。試驗(yàn)表明，在同一添加植物生長調(diào)節(jié)劑的條件下，1/2 MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)效果比MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)效果好。

植物生長調(diào)節(jié)劑是指具有激素活性的人工合成的化學(xué)物質(zhì)，已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、林業(yè)及園藝作物，并獲得了顯著效果，其在組織培養(yǎng)中起著關(guān)鍵的作用。為了促進(jìn)植物體的快速生長，在培養(yǎng)基中加入植物生長調(diào)節(jié)劑，誘導(dǎo)培養(yǎng)是組織培養(yǎng)成功的關(guān)鍵，增殖培養(yǎng)是獲得更多植株的基礎(chǔ)，生根培養(yǎng)是提高植株移栽成活率的重要因素。本試驗(yàn)在1/2 MS培養(yǎng)基中加入6-BA 3.0mg·L-1、TDZ 2.0mg·L-1和NAA 0.1mg·L-1對誘導(dǎo)皺葉山姜吸芽產(chǎn)生叢生芽時效果最好；6-BA 2.0mg·L-1、TDZ 2.0mg·L-1濃度最適合叢生芽增殖生長，TDZ濃度過高或過低則不利于皺葉山姜叢生芽增殖；NAA濃度對皺葉山姜生根有很大的影響，不添加NAA和高濃度的NAA生根率較低，本試驗(yàn)中NAA濃度為0.1mg·L-1時生根率最高，根系生長健壯。

以皺葉山姜吸芽為外植體，通過研究1/2 MS、MS基本培養(yǎng)基、激素及其濃度對芽的誘導(dǎo)、增殖及生根培養(yǎng)的影響，篩選出最佳培養(yǎng)基，最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1/2 MS加6-BA 3.0mg·L-1加TDZ 2.0mg·L-1加NAA 0.1mg·L-1，增殖培養(yǎng)基為1/2 MS加6-BA 2.0mg·L-1加TDZ 2.0mg·L-1，生根培養(yǎng)基為1/2 MS加NAA 0.1mg·L-1。