對牛源性成分鑒定的特異性SSR標記的篩選

李麗 李艷情 吳震洋

(銅仁學院，貴州 銅仁 554300)

牛肉制品具有獨特的風味和豐富的營養，深受廣大消費者的歡迎[1]。但牛肉價格較高，一些商家為謀取利益，在牛肉中摻入其他畜禽肉，或用其他肉類代替，以次充好，極大地損害了消費者的正當利益，影響了消費者的身體健康，使市場秩序受到影響[2]。針對食品市場上肉品摻假的問題，消費者只能通過視覺、嗅覺、觸覺、味覺等傳統方法鑒定肉的外觀、氣味、色澤、硬度等，但使用香精香料已經可以使其他肉類具有牛肉的感官特征，因此傳統的檢測方法已經不能滿足肉品鑒定的要求[3]，所以提出一種快速有效的鑒別方法，對鑒定牛肉真偽意義重大。

目前食監部門常見的肉種類鑒別方法主要有以下幾種：感官評估(通過觀察肉品的酮體、肌纖維性狀、肌肉及脂肪的顏色及硬度，包括觸摸硬度及彈性等因素來鑒別)[4]、蛋白質鑒定技術[5]和分子生物學技術等[6]。感官鑒定不夠精確，而蛋白質鑒定技術雖然在鑒別生鮮肉類的品種上應用比較成功，但經過深加工后，肉類蛋白質發生變性，導致蛋白質鑒定技術的可靠性變差[7]，同時該方法要求操作者具有相當豐富的實際操作經驗，且十分耗時。相比之下，從組織中提取的核酸具有較高的熱穩定性，對加工后的肉類鑒別較為準確。于是，以物種間基因差異為基礎的分子學鑒定方法，就成了學者們研究的熱門領域[8]。

隨著分子生物學技術的發展，動植物鑒定中大量使用了微衛星DNA。微衛星(Simplesequencerepeat，SSR)又稱簡單短串聯重復序列，簡單重復序列，通常由1～6個核苷酸組成，最常見的是二核苷酸重復序列(CA或GT)n，n為重復次數，通常為15～60次[9]。微衛星DNA具有分布廣泛，多態性豐富，易于檢測，特異性強等特點，是目前最常用的遺傳標記之一[10，11]。侯東軍等[12]對引物進行了特異性試驗、靈敏度試驗和人工配制樣品的檢測，結果表明，該方法可以定性不定量的同時檢測出食品中鴨、牛、豬的成分。陳文炳等[13]應用軟件設計7對引物，經PCR篩選確定引物HT-1可在8個用于建立河豚PCR檢測的供檢河豚樣品本中全部檢出目的DNA片段；該方法的河豚魚特異性是通過PCR檢測河豚魚與非河豚魚的比較來驗證的。任君安[14]用數字PCR技術定量研究摻假動物源性成分的肉類及其制品。高志強等[15]對模擬混合生鮮牛肉進行雙重PCR擴增檢測并建立現行模型，證明雙重實時熒光PCR可用于牛源性成分含量的測定。金鷺等[16]采用組合RPCR和DDPCR的方法，以DNA拷貝數和樣品質量為基礎，建立了用于羊肉定量含量的線性關系。經模擬摻雜樣品、市售樣品等進行檢驗，可對所檢樣品中羊肉含量的5%以上進行精確測定。PCR與實時熒光PCR方法，尤其是根據線粒體基因組DNA序列差異設計物種特異性引物所建立的方法，已有大量報道，且進入了中國權威的檢測技術標準[17]。孫金婷[18]對牛、綿羊、豬、鴨4種動物的特異性標記引物進行篩選，并用篩選出的引物對混合肉進行定量鑒定。史瑩瑩等[19]以羊線粒體細胞色素B為基因，以實時熒光相對定量法，設計出具有特異性引物的冷鮮羊肉制品中羊肉成分含量定量檢測方法。本研究旨在篩選出能靈敏、準確、快速地檢測出牛源性成分的微衛星特異性引物，進行PCR擴增，用于牛源性成分的研究，從而保護消費者和合法經營者的合法權益。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Taq酶、6x loading Buffer、血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技有限公司；瓊脂糖，廈門太陽馬生物工程有限公司；微衛星引物，武漢天一輝遠生物科技有限公司；無水乙醇，成都金山化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

電泳凝膠成像分析系統(Tanon1600)，上海天能科技有限公司；電泳槽(RDY-600A)，北京榮陽經典科技有限公司；電熱恒溫水浴鍋(HH-S6)，北京科偉永興儀器有限公司；掌上離心機(HR-220)，北京鼎昊源科技有限公司；溫度梯度PCR儀(Eppendorf nexus)，德國艾本德股份有限公司；高速離心機(TG16K-II)，長沙東旺實驗儀器有限公司；制冰機(IMS-20)，常熟市雪科電器有限公司；漩渦振蕩器(QL-861)，其林貝爾儀器制造有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品采集及處理

從市場采集雞、鴨、豬、山羊、綿羊、牛的肌肉組織，95%乙醇硬化，低溫保存，備用。

1.3.2 DNA提取及PCR擴增

利用試劑盒提取DNA。4℃冰箱中保存備用。PCR擴增體系及條件見表1、表2。

表1 PCR擴增體系

表2 PCR擴增條件

1.3.3 微衛星引物的篩選

本實驗從劉博[20]所做的24個微衛星引物中隨機抽取11個牛微衛星引物位點，用2%的瓊脂糖凝膠電泳對擴增物質進行檢測，通過牛引物PCR擴增牛肌肉組織DNA。目的片段符合的條帶根據所查文獻引物片段范圍進行選取，擴增產物條帶無拖尾現象，條帶清晰，條帶光亮。微衛星位點與反應條件見表3。

表3 牛微衛星引物序列信息

1.3.4 PCR體系優化

為獲得最好的擴增產物，保持其他條件不變，選擇50℃、52.4℃、54.7℃、57.6℃、60℃、61.3℃、62℃為反應的退火溫度對PCR進行優化。

1.3.5 不同肌肉基因組DNA擴增

利用經過篩選的牛微衛星引物，PCR擴增雞、鴨、豬、山羊、綿羊和牛的肌肉基因組DNA。

2 結果與分析

2.1 DNA的提取及選擇

從雞、鴨、豬、山羊、綿羊和牛的肌肉組織DNA中提取試劑盒，經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖1所示，牛樣DNA條帶較暗，其余5個樣本DNA條帶清晰光亮且無降解，可供后續微衛星標記使用。

注：1～6分別為牛、綿羊、山羊、豬、雞、鴨肌肉組織DNA。圖1 肌肉組織DNA電泳檢測

2.2 PCR體系優化

同位點引物在同一系統不同溫度條件下進行擴增，結果如圖2所示，擴增條帶可在50～62℃范圍內被檢測到，其大小與目的片段相近。但在62℃、61.3℃的溫度下，擴增的帶子更清晰、明亮。所以擴增時選擇62℃為退火溫度。

注：M為DNA Maker(100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp～1000bp)。圖2 PCR擴增及優化產物電泳檢測

2.3 牛肌肉組織DNA擴增

牛肌肉組織DNA在9對牛微衛星引物上擴增產物凝膠電泳檢測結果見圖3。由圖3可以看出，微衛星引物在牛DNA上擴增出清晰且特異性擴增少的條帶。其序列和片段大小如表3所示。

注：1.IDVGA44；2.CSRM60；3.BM1225；4.BM2113；5.BM1224；6.INRA026；7.ETH10；8.BM1818；9.CSSM66；10.DNA Maker(100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp)；圖4、圖7、圖8同。圖3 牛肌肉組織DNA擴增

2.4 雞肌肉組織DNA擴增

雞肌肉組織DNA在9對牛微衛星引物上擴增產物凝膠電泳檢測結果見圖4。從圖4可以看出，雞源成分的樣品在其微衛星位點IDVGA44、CSRM60、BM2113、BM1224、INRA026、ETH10的引物上都有擴增的條帶，而且跑膠條的大小和目的片段的大小差不多；微衛星位點為BM1225，BM1818，CSSM66，不帶擴增條帶。其序列和片段大小如表3所示。

圖4 雞肌肉組織DNA擴增

2.5 綿羊肌肉組織DNA擴增

綿羊肌肉組織DNA在9對牛微衛星引物上擴增產物凝膠電泳檢測結果見圖5。從圖5可以看出，綿羊源成分的樣品在其微衛星位點BM1225、BM1818、INRA026、CSSM66的引物上均有擴增條帶，且擴增條帶清晰，運行膠條帶大小近似目的片段；微衛星的位點為IDVGA44、CSRM60、BM2113、ETH10、BM1224，不帶擴增條帶。其序列和片段大小如表3所示。

注：1.IDVGA44；2.CSRM60；3.BM1225；4.BM2113；5.BM1818；6.INRA026；7.ETH10；8.BM1224；9.CSSM66；10.DNA Maker(100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp)。圖5 綿羊肌肉組織DNA擴增

2.6 山羊肌肉組織DNA擴增

山羊肌肉組織DNA在9對牛微衛星引物上擴增產物凝膠電泳檢測結果見圖6。羊源成分的樣品在其微衛星位點BM1225、INRA026、CSSM66、IDVGA44、CSRM60、BM2113、ETH10、BM1224的引物上均有擴增條帶，且擴增條帶清晰，跑膠條帶與目的片段大小相近；微衛星位點為BM1818無延長帶。且山羊肌肉組織DNA在牛引物上的擴增與綿羊的擴增結果相似。其序列和片段大小及退火溫度如表3所示。

注：1.IDVGA44；2.INRA026；3.ETH10；4.BM2113；5.BM1818；6.BM1224；7.BM1225；8.CSSM66；9.CSRM60；10.DNA Maker(100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp)。圖6 山羊肌肉組織DNA擴增

2.7 鴨肌肉組織DNA擴增

鴨肌肉組織DNA在9對牛微衛星引物上擴增產物凝膠電泳檢測結果見圖7。鴨源成分的樣品在其微衛星位點IDVGA44、CSRM60、BM2113、BM1224、INRA026、ETH10的引物上都有擴增的條帶，其運行膠條的大小和目的片段差不多；微衛星位點為BM1225、BM1818、CSSM66，不帶擴增條帶。其序列和片段大小及退火溫度如表3所示。

圖7 鴨肌肉組織DNA擴增

2.8 豬肌肉組織DNA擴增

豬肌肉組織DNA在9對牛微衛星引物上擴增產物凝膠電泳檢測結果見圖8。豬源性成分的樣品在其微衛星位點為BM1225、BM2113、INRA026的引物上均有擴增條帶，且跑膠條帶大小與目的片段大小相近；微衛星位點為IDVGA44、CSRM60、BM1224、ETH10、BM1818、CSSM66無擴增條帶。其序列和片段大小如表3所示。

圖8 豬肌肉組織DNA擴增

2.9 微衛星標記的選取及結果分析

牛的微衛星標記IDVGA44、CSRM60、BM1225、BM2113、BM1224、INRA026、ETH10、BM1818、CSSM66的電泳結果統計見表4。9個微衛星標記都出現了目的條帶。擴增山羊、綿羊時，其微衛星標記BM1818、BM1225、BM1224、INRA026、CSSM66；雞鴨在微衛星標記IDVGA44、CSRM60、BM2113、BM1224、INRA026、ETH10上，豬在微衛星標記BM1225、BM2113、INRA026上，也有目的片段大小的條帶。表明這些微衛星標記在牛、羊、山羊、豬、雞、鴨之間有一定的同源性。但9個位點微衛星引物均在其他5種畜禽肉有擴增條帶。被淘汰的原因是微衛星標記擴增產品的電泳表現不是很理想。

表4 9個牛微衛星標記檢測6種家畜的樣品的結果統計表

3 結論

牛的微衛星標記IDVGA44在牛、山羊、雞、鴨基因組DNA上均擴增出清晰明亮的條帶，無法辨別屬于那種動物源性，故而被淘汰。同樣，位點CSRM60和BM2113在牛、山羊、豬、雞、鴨基因組DNA上均擴增出清晰明亮的條帶；位點BM1225在牛、山羊、豬、綿羊基因組DNA上均擴增出清晰明亮的條帶；位點BM1224和ETH10在牛、山羊、雞、鴨基因組DNA上均擴增出清晰明亮的條帶；位點INRA026在6種動物基因組DNA上均擴增出清晰明亮的條帶；位點BM1818在牛、綿羊基因組DNA上均擴增出清晰明亮的條帶；位點CSSM66在牛、綿羊基因組DNA上均擴增出清晰明亮的條帶，且擴增條帶大小與目的片段大小相近，引物沒有特異性，9個位點微衛星引物都不能明確鑒定動物源性成分，所以被淘汰掉。對牛源成分鑒定不能作為特異性引物的9個位點微衛星引物。應用于鑒定牛源成分的研究，對引物的篩選也有待拓展。