基于AMPK-GLUT4 軸探討桑葉生物堿對妊娠糖尿病小鼠糖耐量異常及胰島素抵抗的作用機制研究

喬艷華 白章瑩 王俊芳 李曉敏 田 瑩

1.河北省邯鄲市婦幼保健院保健科，河北邯鄲 056000；2.河北省邯鄲市婦幼保健院產科，河北邯鄲 056000；3.河北省邯鄲市婦幼保健院檢驗科，河北邯鄲 056000；4.河北省邯鄲市婦幼保健院兒科，河北邯鄲 056000；5.河北工程大學附屬醫院婦產科，河北邯鄲 056001

妊娠糖尿病（gestational diabetes mellitus，GDM）是妊娠期一種常見并發癥，在妊娠期首次發現或出現糖代謝異常，其中胰島素抵抗（insulin resistance，IR）是GDM 重要特征，IR 與葡萄糖和脂質代謝調節異常密不可分[1]。目前，臨床治療GDM 主要方法為日常生活飲食、運動干預和胰島素注射等，由于治療效果差且長期服用降糖藥物存在潛在的副作用，故不適合GDM 治療。中藥能有效改善IR，桑葉作為治療糖尿病常用藥物之一，因其能減緩IR 作用引起眾多學者關注[2]。桑葉富含人體必需氨基酸，還包括多糖、黃酮、生物堿類等活性成分，具有抑菌、降血糖、抑制腫瘤、緩解炎癥、抗氧化等作用[3-5]。桑葉生物堿是從桑葉中提取的活性成分，具有降血糖、改善動物腎損傷、氧化損傷等藥理作用[6-7]。本實驗以GDM 小鼠為研究對象，分析桑葉生物堿對小鼠糖耐量異常及IR 作用，旨在發掘桑葉生物堿在GDM 治療中的潛在價值。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級C57BL/6 雌性小鼠60 只和雄性小鼠30只，體重（20±3）g，6 周齡，購于上海南方模式生物科技股份有限公司，生產許可證：SCXK（滬）2021-0010，合格證號：SCXK（滬）2021-0010，購入后保持室內溫度（23±2）℃，空氣濕度（50±5）%，光照晝夜交替12 h，適應性飼養1 周。本研究經河北省邯鄲市婦幼保健院醫學倫理委員會批準。

1.2 藥物、主要試劑和儀器

桑葉生物堿（生產批號：19130-96-2，純度：98%）購于陜西斯諾特生物技術有限公司；二甲雙胍（生產批號：100664-202106）購于中美上海施貴寶制藥有限公司；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（貨號：S8050）購于北京Solarbio 公司；C 反應蛋白（C-reactive protein，CRP）（貨號：DG-Elisa）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）[貨號：YY（bio）-elisa-012145]酶聯免疫吸附試驗試劑盒購于美國R＆D 公司；蛋白BCA試劑盒（貨號：BCA1-1KT）購于美國Sigma 公司；兔抗鼠腺苷酸蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）、磷酸化腺苷酸蛋白激酶（p-hosphorylated AMP-activated protein kinase，p-AMPK）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）單抗、葡萄糖轉運體4（glucose transporters 4，GLUT4）多抗、羊抗兔二抗-HRP 購于英國Abeam 公司；80W-Mini-protean tetra 電泳儀、XCell ⅡBlot Module 小型轉印模塊垂直電泳槽購于美國SatanCruz 公司。

1.3 研究方法

1.3.1 建模、分組 按照隨機數字表法取50 只處于發情期雌性小鼠，高糖脂飲食喂養6 周后與25 只雄性小鼠同籠過夜，次日，顯微鏡觀察雌性小鼠出現精子或黏液栓現象，即妊娠成功，記為妊娠第1 天，取受孕成功45 只雌性小鼠（5 只未受孕），妊娠5 d 后禁食12 h，腹腔注射35 mg/kg STZ 溶液，誘導GDM 模型[8]。造模后，禁食12 h，小鼠尾部取血，測其空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）；25%葡萄糖1 ml 灌胃，2 h 后于小鼠尾部采血，測其2 h 餐后血糖（2-hour postprandial blood glucose，2hPBG），若7.8 mmol/L≤2hPBG＜11.1 mmol/L 且持續1 周即造模成功[9]。

取建模成功的40 只小鼠依據隨機數字表法分為模型組、桑葉生物堿低劑量組、桑葉生物堿高劑量組、陽性藥物組，每組10 只；選余下10 只未參與造模且妊娠成功的雌性小鼠做對照組。

1.3.2 干預方法 建模成功后，依據參考文獻[5]的用量，桑葉生物堿低、高劑量組及陽性藥物組分別尾靜脈注射100、200、100 mg/kg 藥物溶液；對照組及模型組給予等體積無菌生理鹽水。1 次/d，共計8 周。

1.3.3 口服葡萄糖耐量試驗（oral glucose tolerance test，OGTT）給藥第7 周進行OGTT，各組小鼠禁食、不禁水12 h，25%葡萄糖溶液（2 g/kg 體重）灌胃后，采用尾部采血方法，測定并記錄小鼠0.5、1、2 h的血糖值。

1.3.4 生化指標檢測 給藥第8 周依次通過血糖儀、全自動分析儀檢測小鼠血清FBG 和空腹胰島素（fasting insulin，FINs），計算胰島素抵抗指數穩態模型評估法（homeostasis model assessment for insulin resistance，HOMA-IR），穩態模型胰島β 細胞功能指數（homeostasis model assessment-pancreatic β-cell function，HOMA-β）。HOMA-IR=FBG（mmol/L）×FINs（μIU/ml）/22.5，HOMA-β=20×FINs（mU/L）/[FBG（mmol/L）-3.5][10]。

1.3.5 細胞相關因子檢測 生化指標檢測結束后，酶聯免疫吸附試驗法檢測血清CRP、TNF-α、IL-6 水平。抗體包被過夜（100 μl，37℃、60 min），加樣（100 μl，37℃、60 min），添加酶標抗體（100 μl，37℃、60 min），底物液顯色（90 μl，37℃、10 min），終止液停止反應（50 μl），酶標儀測450 nm 處吸光度值，根據標準曲線計算CRP、TNF-α、IL-6 水平。

1.3.6 RT-PCR 檢測肝臟組織AMPK、GLUT4 mRNA 表達處死小鼠，取肝臟組織，勻漿，用Trizol 法提取RNA，測純度及濃度，逆轉錄得cDNA。反應體系：1.5 μl Taq聚合酶、0.5 μl 正反向引物、4 μl 模板cDNA、13.5 μl ddH20。擴增條件：預變性（95℃，30 s）、變性（95℃，5 s）、退火（59℃，30 s），共40 個循環，加熔解曲線，降溫（50℃，30 s）。GAPDH 為內參對照，采用2-△△Ct法，反復多次，取Ct 均值。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3.7 Western blot 檢測肝臟組織AMPK、p-AMPK、GLUT4 蛋白表達 處死小鼠，取肝臟組織，加RIPA 裂解液，離心（6 000 r/min，15 min，離心半徑為20 cm）取上清液，蛋白BCA 試劑盒測總蛋白濃度，樣品電泳分離（100 V，80 min）、轉至PVDF 膜，5%脫脂牛奶磷酸鹽緩沖液封閉2 h，樣品與AMPK（1∶200）、p-AMPK（1∶100）、GLUT4（1∶500）一抗4℃過夜孵育，TBST 緩沖液洗膜，加HRP 標記IgG 二抗室溫孵育2 h（1∶2 000），洗膜、曝光、顯影。Image J 軟件測樣品及GAPDH 條帶灰度值。目標蛋白相對表達水平計算，即目標條帶與GAPDH 條帶灰度比值。

1.4 統計學方法

采用SPSS 24.0 統計學軟件進行數據分析。計量資料用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較進行LSD-t 檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠OGTT 血糖比較

整體分析發現：對照組與模型組血糖時間、組間、交互作用比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。組內比較：對照組2 h 血糖低于0.5、1 h，差異有統計學意義（P＜0.05）；模型組不同時間點血糖兩兩比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。組間比較：模型組0.5、1、2 h 血糖高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 對照組與模型組不同時間點OGTT 血糖比較（mmol/L，±s）

表2 對照組與模型組不同時間點OGTT 血糖比較（mmol/L，±s）

注 與本組0.5 h 比較，aP＜0.05；與本組1 h 比較，bP＜0.05；與對照組同期比較，cP＜0.05。OGTT：口服葡萄糖耐量試驗。

整體分析發現：模型組與給藥組血糖時間、組間、交互作用比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。組內比較：桑葉生物堿低、高劑量組不同時間點血糖兩兩比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。組間比較：桑葉生物堿低、高劑量組0.5、1、2 h 血糖低于模型組；桑葉生物堿高劑量組0.5、1、2 h 血糖低于桑葉生物堿低劑量組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 模型組與給藥組不同時間點OGTT 血糖水平比較（mmol/L，±s）

表3 模型組與給藥組不同時間點OGTT 血糖水平比較（mmol/L，±s）

注：與本組0.5 h 比較，aP<0.05；與本組1 h 比較，bP＜0.05；與模型組同期比較，cP＜0.05；與桑葉生物堿低劑量組同期比較，dP＜0.05。OGTT：口服葡萄糖耐量試驗。

2.2 各組小鼠HOMA-IR、HOMA-β 比較

模型組HOMA-IR 高于對照組，HOMA-β 低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；桑葉生物堿低、高劑量組HOMA-IR 低于模型組，HOMA-β 高于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05）；桑葉生物堿高劑量組HOMA-IR 低于桑葉生物堿低劑量組，HOMA-β 高于桑葉生物堿低劑量組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表4。

表4 各組小鼠HOMA-IR、HOMA-β 比較（±s）

表4 各組小鼠HOMA-IR、HOMA-β 比較（±s）

注 與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與桑葉生物堿低劑量組比較，cP＜0.05。HOMA-IR：胰島素抵抗指數穩態模型評估法；HOMA-β：穩態模型胰島β 細胞功能指數。

2.3 各組小鼠血清CRP、TNF-α、IL-6 水平比較

模型組血清CRP、TNF-α、IL-6 水平高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；桑葉生物堿低、高劑量組血清CRP、TNF-α、IL-6 水平低于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05）；桑葉生物堿高劑量組血清CRP、TNF-α、IL-6 水平低于桑葉生物堿低劑量組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表5。

表5 各組小鼠血清CRP、TNF-α、IL-6 水平比較（±s）

表5 各組小鼠血清CRP、TNF-α、IL-6 水平比較（±s）

注 與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與桑葉生物堿低劑量組比較，cP＜0.05。CRP：C 反應蛋白；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL-6：白細胞介素-6。

2.4 各組小鼠肝臟組織AMPK、GLUT4 mRNA 比較

各組肝臟組織AMPK mRNA 比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。模型組肝臟組織GLUT4 mRNA 低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；桑葉生物堿低、高劑量組肝臟組織GLUT4 mRNA 高于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05）；桑葉生物堿高劑量組肝臟組織GLUT4 mRNA 高于桑葉生物堿低劑量組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表6。

表6 各組小鼠肝臟組織AMPK、GLUT4 mRNA 水平比較（±s）

表6 各組小鼠肝臟組織AMPK、GLUT4 mRNA 水平比較（±s）

注 與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與桑葉生物堿低劑量組比較，cP＜0.05。AMPK：腺苷酸蛋白激酶；GLUT4：葡萄糖轉運體4。

2.5 各組小鼠肝臟組織AMPK、p-AMPK、GLUT4 蛋白水平比較

各組肝臟組織AMPK 蛋白水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。模型組肝臟組織p-AMPK、GLUT4蛋白水平低于對照組（P＜0.05）；桑葉生物堿低、高劑量組肝臟組織p-AMPK、GLUT4 蛋白水平高于模型組（P＜0.05）；桑葉生物堿高劑量組肝臟組織p-AMPK、GLUT4 蛋白水平高于桑葉生物堿低劑量組（P＜0.05）。見圖1、表7。

表7 各組小鼠肝臟組織AMPK、p-AMPK、GLUT4 蛋白水平比較（±s）

表7 各組小鼠肝臟組織AMPK、p-AMPK、GLUT4 蛋白水平比較（±s）

注 與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與桑葉生物堿低劑量組比較，cP＜0.05。AMPK：腺苷酸蛋白激酶；p-AMPK：磷酸化腺苷酸蛋白激酶；GLUT4：葡萄糖轉運體4。

3 討論

IR 指胰島素靶組織對胰島素敏感性及葡萄糖代謝能力下降，是代謝綜合征中心環節[11]。GDM 主要病理生理特征和2 型糖尿病類似，即出現明顯IR 現象和胰島素分泌不足，使得機體糖脂代謝紊亂，氧化應激及炎癥反應被異常激活[12-13]。因妊娠晚期機體內激素變化使得胰島素敏感性減弱，胎盤分泌胰島素酶促進機體胰島素降解，進而導致生理性IR；妊娠前機體內已存在IR 的患者，妊娠后期因胎盤分泌拮抗胰島素的激素增加，致使血糖升高、IR 增強，即病理性IR[14]。

被過度激活的母體炎癥及氧化應激反應能影響胰島素信號傳導，引起IR 從而導致糖脂代謝紊亂[15]。炎癥在IR 中發揮重要作用。CRP 作為炎癥標志物，直接參與炎癥過程從而引起IR[16]。本研究結果顯示，桑葉生物堿可調控葡萄糖吸收速率，明顯提升GDM 小鼠口服葡萄糖耐量；且能有效抑制IR 發生，使血清HOMA-β 水平升高，HOMA-IR、CRP、TNF-α、IL-6 水平降低。提示桑葉生物堿能夠修復胰島細胞功能損傷、調節血糖、改善小鼠糖耐量異常與IR 作用。

參與IR 生物信號傳導途徑眾多，AMPK 是一種代謝主調節劑，與許多代謝疾病密不可分[17]。AMPK即AMP 依賴的蛋白激酶，廣泛參與糖、脂肪、蛋白質等多種物質代謝過程，是以IR 為主要病理基礎的代謝性疾病臨床治療新靶點[18-19]。GLUT4 是AMPK 通路中胰島素調節葡萄糖轉運蛋白，脂肪組織中GLUT4高表達可增強胰島素敏感性及葡萄糖耐量；GLUT4通路又在治療糖尿病中取得新進展[20]。AMPK 可通過誘導GLUT4 向漿膜轉移或經其磷酸化后啟動GLUT4因子表達。且AMPK 磷酸化后可激活GLUT4 并促進糖代謝[21]。AMPK 在調節糖脂代謝、抑制炎癥反應、抗氧化應激、維持線粒體穩態等多方面發揮改善機體IR 的作用[22]。中藥提取物基于AMPK 改善IR[23-24]。高迎春等[25]發現，桑葉提取物能夠發揮抑制IR 作用，通過介導AMPK 上下游信號通路級聯，改善IR。本研究結果顯示，桑葉生物堿各劑量組肝臟組織p-AMPK蛋白、GLUT4 mRNA 和蛋白水平均較模型組升高。提示桑葉生物堿可能是通過AMPK-GLUT4 軸調控葡萄糖代謝，降低IR。

綜上所述，桑葉生物堿可改善GDM 小鼠炎癥反應、調控血糖并抑制IR，其作用機制可能與激活AMPKGLUT4 途徑有關。桑葉是藥食同源的一種物質，開發桑葉活性功能成分，治療GDM 有較大的臨床應用價值，前景廣闊。