左金方中吳茱萸藥材UPLC 指紋圖譜的建立及藥材質量評價*

李艷英，郭敏群，魏宏偉，王洪成，楊秀偉

1 北京盈科瑞創新醫藥股份有限公司，北京 102200； 2 北京大學，北京 102200；3 盈科瑞（天津）創新醫藥研究有限公司，天津 300000

左金方出自《丹溪心法》，由黃連、吳茱萸兩味藥材組成，以疏肝清肝、苦寒的黃連為君藥，使肝氣條達且不上沖犯胃，佐以少量性味辛熱的吳茱萸，辛開苦降、相反相成［1］。目前，左金方主要用于治療消化系統疾病，如幽門桿菌感染、消化性潰瘍等［2］。除此之外，臨床及實驗研究發現，用左金方或加減配伍，或調整黃連、吳茱萸的用量比例，或與其他藥物聯合使用，能廣泛治療消化道疾病以外的屬“肝經火旺”證的諸多疾病，如失眠、高脂血癥、高血壓、眩暈、巔頂痛、脅痛、乳房疼痛、牙痛、妊娠期嘔吐、睪丸腫痛、尿毒癥、梅核氣、小兒臍炎等［3］。

吳茱萸來源于蕓香科植物吳茱萸Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth.、石虎Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth.var.officinalis（Dode）Huang 或疏毛吳茱萸Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth.var.bodinieri（Dode）Huang 的干 燥近成熟果實［4］。研究表明，吳茱萸含有生物堿、苦味素、揮發油、黃酮等成分，其中生物堿和苦味素為其主要有效成分［5］。產地來源和采收時期不同易出現藥材質量差異，直接影響方劑的藥效。本研究建立吳茱萸UPLC 指紋圖譜并進行主成分分析，結合有效成分含量測定評價不同產地吳茱萸的整體質量，探討影響吳茱萸藥材質量的因素，為左金方中吳茱萸藥材的質量提供依據。

1 材料與儀器

1.1 試藥及試劑檸檬苦素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110800-201406，規格：20 mg，純度99.91%）；吳茱萸堿對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110802-201409，規格：20 mg，純度99.7%）；吳茱萸次堿對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110801-201608，規格：20 mg，純度99.4%）；去氫吳茱萸堿對照品（上海詩丹德標準技術服務有限公司，批號：5451，規格：20 mg，純度99.8%）。乙腈為質譜級（賽默飛公司）；甲醇為色譜級（天津賽孚瑞有限公司）；三氟乙酸為分析純（shanghai titian scientific 公司）；水為屈臣氏蒸餾水；鹽酸為分析級（北京益利精細化學品有限公司）；乙醇為分析純（北京化工廠）。

吳茱萸樣品來源信息見表1，經盈科瑞（天津）創新醫藥研究有限公司中藥資源研究中心主任何燕峰鑒定均為蕓香科植物吳茱萸Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth.的干燥近成熟果實。17批吳茱萸藥材分別編號為S1～S17。

1.2 實驗儀器Infinity 1290 Ⅱ型超高效液相色譜儀（UPLC）連接G6530C 型四極桿-飛行時間串聯質譜儀（安捷倫公司）；S6000 型高效液相色譜儀（華譜科儀科技公司）；MS-204TS 型梅特勒-托利多儀器公司（萬分之一）電子分析天平；XPE-105 型梅特勒-托利多儀器公司（十萬分之一）電子分析天平；WT3002CF 型常州萬泰天平儀器有限公司（百分之一）電子分析天平；KQ-800DB 型昆山市超聲儀器有限公司超聲清洗器。

2 方法與結果

2.1 指紋圖譜

2.1.1 色譜條件 采用Ultimate UHPLC AQ-C18色譜柱（2.1×100 mm，1.8 μm）；以乙腈為流動相A，以0.01%三氟乙酸水溶液為流動相B，按下表中的規定進行梯度洗脫（0～25 min，5%～11% A；25～35 min，11% A；35～50 min，11%～13% A；50～60 min，13%～20% A；60～70 min，20%～55% A；70～75 min，55%～90% A；75～80 min，90% A）；流速0.4 mL/min；檢測波長300 nm，柱溫30 ℃，進樣量1 μL［6］。

2.1.2 對照品溶液的制備 取去氫吳茱萸堿對照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.21 mg的溶液，即得。

2.1.3 供試品溶液制備 取本品粉末（過三號篩）約0.1 g，精密稱定，置錐形瓶中，加入甲醇-鹽酸（100∶1）的混合溶液100 mL，超聲處理（功率320 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.1.4 測定法 分別精密吸取參照物溶液與供試品溶液各1 μL，注入液相色譜儀，測定，記錄色譜圖，即得。

2.1.5 方法學考察

2.1.5.1 空白試驗 取甲醇-鹽酸（100∶1）的混合溶液注入超高效液相色譜儀，按“2.1.1”項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖，結果表明空白溶劑無色譜峰，對測定無干擾。

2.1.5.2 精密度試驗 取編號S11 批的吳茱萸樣品，按“2.1.3”項下方法制備成供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件連續進樣6 次，記錄色譜圖，以去氫吳茱萸為參照峰（S 峰）計算各主要特征峰（可指認的色譜峰）的相對保留時間和相對峰面積的RSD，結果供試品指紋圖譜呈現與參照物色譜峰保留時間相同的色譜峰，并呈現14 個主要色譜峰，其相對保留時間和相對峰面積的RSD 分別為≤0.23%和4.72%，表明儀器精密度良好。

2.1.5.3 穩定性試驗 取編號S11 批次的吳茱萸樣品，按“2.1.3”項下方法制備成供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件分別在供試品溶液制備后的0、3、6、8、12、24 h 進樣測定，記錄色譜圖，以去氫吳茱萸堿為參照峰（S 峰），計算各主要特征峰（可指認的色譜峰）的相對保留時間和相對峰面積的RSD。結果表明，14 個主要特征峰其相對保留時間和相對峰面積的RSD分別≤1.02%和4.50%，表明24 h內穩定性良好。

2.1.5.4 重復性試驗 取6份編號S13批次的吳茱萸樣品，按“2.1.3”項下方法制備成6 份供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件依次進樣，記錄色譜圖，以去氫吳茱萸堿為參照峰（S 峰），計算各主要特征峰（可指認的色譜峰）的相對保留時間和相對峰面積的RSD。結果表明，14 個主要特征峰其相對保留時間和相對峰面積的RSD分別≤1.24%和4.84%，表明本方法重復性良好。

2.1.6 指紋圖譜方法的建立

2.1.6.1 共有峰的標定 取表1 中的17 個批次的吳茱萸樣品，按“2.1.1”項下方法制備成34 份供試品溶液（每批制備兩份平行樣），分別按“2.1.1”項下色譜條件依次進樣，記錄色譜圖，將數據導入國家藥典委員會發布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件系統2012 年版”軟件進行分析，以17批吳茱萸藥材UPLC圖譜色譜峰進行自動匹配，選擇17批（34份）吳茱萸指紋圖譜中穩定性較好、響應值適宜的色譜峰為共有峰，共標定了14個峰共有峰。見圖1。

圖1 17批吳茱萸藥材指紋圖譜

2.1.6.2 參照物的選擇及對照指紋圖譜的建立 去氫吳茱萸堿色譜峰吸收強度及保留時間適中，響應穩定，達到基線分離，故選擇去氫吳茱萸堿為參照峰，標記為S 峰，同時將去氫吳茱萸堿對照品作為參照物，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件系統，以17批吳茱萸UPLC圖譜色譜峰進行自動匹配，形成共有模式圖，并建立對照圖譜。見圖2。

圖2 吳茱萸指紋圖譜共有模式

2.1.6.3 相似度的計算 采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件系統，以共有峰對17 批供試品與對照指紋圖譜的相似度進行計算。相似度計算結果見表2。

表2 17批吳茱萸藥材相似度分析結果

結果：17 個批次吳茱萸藥材指紋圖譜輪廓基本一致，相似度在0.821～0.976 之間，表明不同來源的吳茱萸藥材指紋圖譜輪廓基本一致，化學成分種類基本一致，S3、S5、S8、S10、S13、S17 批次的相似度低于0.90，其余批次相似度高于0.90。

2.1.6.4 共有峰的指認 通過對照品比對，對14 個共有峰進行指認，確認峰9（S）為去氫吳茱萸堿，峰10 為吳茱萸堿，峰11 為吳茱萸次堿。其余為質譜分析指認。流動相為乙腈（A）-0.05%甲酸水（B），梯度等其它色譜條件同指紋方法“2.1.1”項下質譜檢測分別在正、負離子模式下進行，干燥氣溫度350 ℃，干燥氣流速10 L/min，霧化氣壓力35 psi，鞘氣溫度350 ℃，鞘氣流速12 L/min，毛細管電壓4000 V（正模式）和3500 V（負模式）。一級質譜選用MS模式，質量掃描范圍100～1300 m/z。二級質譜選用Auto-MS/MS 模式，碰撞電壓為10、20、30 V。所 得LC-MS 數 據 由Agilent Mass-Hunter（B.08.00）軟件采集［6］。數據處理采用Agilent 軟件Qualitative Navigator（B.08.00）和Qualitative Workflows（B.08.00），14 個化合物質譜分析結果見表3。

表3 吳茱萸指紋圖譜化學成分的MS/MS分析

2.1.6.5 指紋圖譜的化學計量學分析 為了更加直觀地評價不同產地吳茱萸藥材的質量，采用SIMCA 13.0，以14個共有峰為變量對17批吳茱萸藥材進行PCA分析，以主成分特征值大于1為提取原則，本研究提取了3 個主成分，累積貢獻率達98.5%，表明該3 個主成分能代表14 個共有峰在17 批樣品中的98.5%的信息，見表4。以主成分1、主成分2的得分分別為橫、縱坐標，生成17批藥材的主成分得分圖，見圖3。17 批樣品主要分為兩類，其中外觀顏色為褐色的、成熟度較高的S3、S5、S8、S10、S13、S17 樣品投影點聚集在一起；其余外觀顏色為暗黃綠色及暗黃綠色至褐色、成熟度較低的S1、S2、S4、S6、S7、S9、S11、S12、S14、S15、S16 樣品投影點聚在一起，與相似度評價結果一致，推斷吳茱萸藥材顏色深淺與藥材質量存在一定的關聯性。

圖3 吳茱萸藥材樣品PCA分析得分圖

表4 特征值及方差分析

按PCA 分析結果將17 批吳茱萸藥材分為2組，成熟度高的果實標記為紅色，成熟度較低的果實標記為藍色，以峰面積為縱坐標，峰的序號為橫坐標作圖，見圖4。可以看出，成熟度較低的果實峰1、2、3、5、7、8 含量高于成熟度高的果實；而峰10、11、12、13、14 含量低于成熟度高的果實。由表3 可知，峰1、2、3、5、7、8 為酚酸類成分，峰10、11、12、13、14為生物堿成分。

圖4 17批吳茱萸樣品成分含量比較圖

2.2 吳茱萸堿、吳茱萸次堿及檸檬苦素的含量測定

2.2.1 色譜條件 按照《中華人民共和國藥典》2015 年 版 的 方 法［4］，采 用ZORBA SB-C18色 譜 柱（4.6×250 mm，5.0 μm）；以［乙腈-四氫呋喃（25∶15）］-0.02%磷酸溶液（35∶65）為流動相；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長215 nm，進樣量10 μL。

2.2.2 對照品溶液的制備 取吳茱萸堿對照品、吳茱萸次堿對照品、檸檬苦素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含吳茱萸堿80 μg、吳茱萸次堿50 μg和檸檬苦素0.1 mg的混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品粉末（過三號篩）約0.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇25 m，稱定質量，浸泡1 h，超聲處理（功率300 W，頻率40 KHz）40 min，放冷，再稱定質量，用70%乙醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2.4 含量測定結果 根據《中華人民共和國藥典》2015年版吳茱萸藥材含量測定項下方法，對吳茱萸堿、吳茱萸次堿及檸檬苦素的含量進行檢測，結果均符合規定，檸檬苦素含量范圍為0.50%～2.11%；吳茱萸堿含量范圍為0.09%～1.19%；吳茱萸次堿含量范圍為0.07%～0.61%；吳茱萸堿和吳茱萸次堿總含量范圍為0.16%～1.63%。進一步分析發現外觀顏色為暗黃綠色、顏色較淺的樣品檸檬苦素含量較高，吳茱萸堿和吳茱萸次堿總量較低；而外觀顏色為褐色的、顏色較深的藥材吳茱萸堿和吳茱萸次堿總量較高，檸檬苦素含量較低；外觀顏色為暗黃綠色至褐色的，吳茱萸堿和吳茱萸次堿的總量、檸檬苦素的含量介于前兩者之間，說明果實的成熟度對吳茱萸藥材生物堿含量有較大影響。見表5。

表5 吳茱萸藥材中3種成分的含量測定（%）

2.3 檢查項、浸出物含量測定根據《中華人民共和國藥典》2015 年版吳茱萸藥材檢查和浸出物項下方法對雜質、水分、總灰分、浸出物含量進行檢測，結果均符合規定。

3 討論

吳茱萸產于江西、四川、湖南、湖北、陜西、浙江、廣西等地，主產于江西［7-10］。近幾年隨著市場價格的上漲，主要產區大面積擴種，據統計2017年吳茱萸種植面積達到20萬畝，預計2～3年后產量將突破30 000 噸。但由于地理位置、氣候條件、栽培條件、采收時間、環境及采收時間等因素而存在品質差異。

通過對收集的吳茱萸藥材檢測發現，收集的17 批吳茱萸藥材雜質、水分、總灰分、二氧化硫、浸出物、檸檬苦素、吳茱萸堿和吳茱萸次堿總量均符合《中華人民共和國藥典》2015 年版規定；17 個批次吳茱萸藥材指紋圖譜輪廓基本一致，相似度在0.821～0.976之間。進一步結合17批吳茱萸藥材的指紋圖譜化合計量學分析結果和吳茱萸堿、吳茱萸次堿、檸檬苦素含量測定結果，發現外觀為暗黃綠色、成熟度較低的批次中酚酸類及檸檬苦素含量較高，吳茱萸堿和吳茱萸次堿總量較低；而外觀為暗黃綠褐色、成熟度較高的批次與之相反，這與此前文獻報道的果初期吳茱萸果實中的檸檬苦素含量達到峰值，但隨著果實成熟，其含量下降；而吳茱萸堿、吳茱萸次堿在果初期時含量較低，隨著果實成熟，逐漸上升至峰值［11-13］，與采收時期密切相關。酚酸類成分屬于化感物質，溫度、紫外線、光照、雨霧等因素都可以影響酚酸類物質的合成和代謝［14-15］，可能采收中后期開始氣候等因素導致吳茱萸果實中酚酸類成分含量下降。因此在吳茱萸藥材采收時，應重點關注吳茱萸藥材果實的成熟度，控制好采收時期以保證藥材質量的均一穩定。