基于網絡藥理學和分子對接技術研究祛風藥對徐長卿-川芎治療心房顫動的作用機制*

侯 寧，張振賢，陳若宏，黃 瑤

1 上海中醫藥大學，上海 201203； 2 上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院，上海 200437

心房顫動（atrial fibrillation，AF）是心房正常節律失去秩序而發生混亂，具有難愈性和復雜性的特點，是臨床常見心律失常種類之一。目前國內缺乏大規模AF 流行病學調查，故準確發病率尚不可知。AF 患者易并發缺血性腦卒中，具有高致殘及致死率，加之目前射頻消融手術費用昂貴，絕大部分患者需長期口服各類抗凝血藥物，給家庭和社會帶來了巨大的經濟負擔［1］。根據AF的臨床表現，可將其歸屬于中醫學“心悸”“怔忡”等范疇。初發AF多以陣發性AF形式出現，具有突發突止的特點，且常伴有心慌、胸悶、乏力等癥狀?！端貑枴わL論篇》有云：“風者，善行而數變”，體現中醫“風邪”致病的游移不定和變化無常，這正與陣發性AF 特點相類似。因此，國內多位醫家以此為理，選擇從風邪角度論治AF，臨床獲效頗豐［2-3］。

徐長卿-川芎是臨床常用祛風藥對。徐長卿（Cynanchumpaniculatum）為蘿藦科植物徐長卿帶根的全草，其藥性味溫、辛，入肝、胃兩經，具有祛風利濕、活血止痛、解毒消腫等功效［4］。臨床常用于治療風濕關節和皮膚瘙癢等疾病?，F代藥理學研究發現從徐長卿干燥根中可提取的一種活性單體成分——丹皮酚，對鈣通道具有阻斷作用，可使動作電位的持續時間減少，從而發揮抗心律失常的作用［5］。川芎（Ligusticum chuanxiongHort）是傘形科藁本屬植物川芎的干燥根莖，藥味溫、辛，歸肝、膽、心包經。川芎具有活血行氣、祛風止痛的功效［4］。臨床中川芎被普遍用于治療心腦和風濕關節等疾病，且療效顯著。藥理學研究表明，川芎嗪、阿魏酸、西地利特和木本內酯等川芎有效成分均對心肌缺血有保護作用［6］。其中川芎嗪在體外細胞實驗中具有開放三磷酸腺苷敏感鉀通道和（或）小電導鈣激活鉀通道的作用［7］，可在離子通道的開閉方面與徐長卿產生協同作用。但是目前有關祛風藥對徐長卿-川芎治療AF的物質基礎和靶點的研究較少，具體機制尚不明確。故深入研究祛風藥對徐長卿-川芎治療AF 的分子機制具有重要意義。

網絡藥理學是一個新興的學科，它融合了多學科及技術，包括基因組學、拓撲學和計算組學等，其通過建立多種網絡模型來探索中藥與疾病間的潛在機制及關系，有助于探索中藥制劑安全性和多藥聯用的分子機制，為研究藥物機制和新藥開發提供了新途徑［8］。本研究采用網絡藥理學方法研究祛風藥對川芎-徐長卿主要活性成分和干預AF 可能的目標靶點，并用分子對接技術進行部分驗證以闡述其可能的作用機制。

1 資料與方法

1.1 藥物的化學成分及預測靶點收集首先，通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）檢索徐長卿、川芎化學成分，同時根據藥物的吸收、分布、代謝和排泄分析，以口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30% 及 類 藥 性（drug-likeness,DL）≥0.18 篩選兩種藥物的主要化學成分［9］；其次，根據Pubchem 數據庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）確定主要化學成分的SMILES號，并將其導入Swiss target prediction 數據庫（http：//www.swisstarget-prediction.ch/），選定物種屬性“Homo sapiens”。將與徐長卿和川芎小分子化學物質交互作用概率排名前50 位的靶點定為有效預測靶點。隨后，將篩選出的主要化學成分及有效預測靶點導入Cytoscape 3.6.1 構建成分-靶點可視化網絡。

1.2 疾病的靶點收集通過GeneCards 數據庫（https：//www.genecards.org/）和OMIM 數據庫（https：//www.omim.org/）檢索關鍵字“atrial fibrillation”，選擇種屬為“homosapiens”進行匯總、篩選AF相關基因，然后進行基因規范與去重。

1.3 藥物-疾病共同靶點可視化及拓撲屬性分析通過Venny 2.1.0 在線軟件（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）將藥物效應靶點和AF 有關靶點交集重疊，發現藥物與AF 的交集基因。然后，用Cytoscape 3.6.1 軟件構建“中藥-成分-重合靶點”網絡并利用軟件中“Networkanalyze”功能進行拓撲屬性分析。

1.4 蛋白相互作用網絡構建及核心靶點收集將“1.3”項中經Venny 2.1.0 在線軟件做出的重合靶點導入String數據庫（https：//stringdb.org/）進行檢索，將“物種”設置為“Homo sapiens”，設置最低相互作用得分等于0.400。獲得蛋白相互作用的結果，導入Cytoscape 3.6.1軟件從而構建PPI 網絡。與此同時，通過Cytoscape 3.6.1 軟件中“Networkanalyze”功能對網絡進行拓撲分析，分析內容包括度值（Degree）、接近中心性（closeness centrality，CC）、介度中心性（betweenness centrality，BC）。首先計算出Degree 中位數值，篩選出大于該值2倍的所有節點，將其定義為“big hubs”，然后從中選擇其他2 個指標均大于該節點中位數的目標節點，將最終篩選出的節點定義為藥物-疾病的核心靶點［10］。

1.5 生物通路富集分析為研究核心靶點在生物信號通路中發揮的作用，本研究利用基因注 釋工具Metascape（http：//metascape.org）對“1.4”項中篩選出的核心靶點進行有關通路的富集分析。分析主要生物通路，探討祛風藥對徐長卿-川芎治療AF可能的作用機制。

1.6 分子對接分子對接是評價藥物活性成分與靶點結合能力的方法［11］。首先，通過TCMSP 下載“1.1”項篩選出的主要化學成分分子結構，保存為“mol2”格式作為配體；其次，篩選藥物-疾病核心靶點Degree 排名前5 位的基因靶點，并利用PDB 數據庫查找相對應靶蛋白3D 晶體結構［12］作為受體；最后通過CB-Dock網站［13］（http：//cao.labshare.cn/cb-dock/）進行分子對接。此外，再利用Originlab2019 將化合物以及對應靶蛋白對接得到的Vina 得分構建熱圖，從而篩選最佳對接構象并進行部分展示。

2 結果

2.1 有效成分及靶點通過TCMSP 數據庫篩選徐長卿、川芎化學成分，符合OB≥30%和DL≥0.18的條件，共得到6 個徐長卿有效化學成分，7 個川芎有效化學成分，其中1 個為兩藥共有化學成分（MOL000359）。見表1。

表1 徐長卿-川芎藥對有效化學成分基本信息

分別將12 種有效化學成分的SMILES 號導入Swiss target prediction 數據庫篩選交互作用概率排名前50位的靶點。結果一種成分（MOL002140）無有效預測靶點，余有效化學成分共篩選出379個靶點，其中徐長卿和川芎有效化學成分重合靶點124 個。構建藥物活性成分-潛在靶點網絡。見圖1。

圖1 徐長卿-川芎藥對活性成分-潛在靶點網絡

2.2 疾病有關靶點及交集靶點的篩選通過GeneCards 和OMIM 數據庫，以“atrial fibrillation”為檢索詞，收集、匯總和剔重靶點，共得到2924 個相關靶點，再利用Venny 2.1.0 在線軟件得到與藥物活性成分-潛在靶點交集靶點，共144個，此可能為川芎-徐長卿治療AF 的潛在作用靶點。見圖2。

圖2 徐長卿-川芎藥對靶點與AF靶點交集韋恩圖

2.3 中藥-成分-重合靶點網絡構建和拓撲屬性分析利用Cytoscape 3.6.1 軟件的“Networkanalyze”功能分析得出，該網絡共包括157 個節點和254 條邊，其中2 種中藥節點，11 種化學成分節點，144 種靶點節點。網絡中BC 均值為0.016、CC 均值為0.291、Degree 均值為3.24。而目標靶點的Degree 均值1.68。其中毛紅厚殼內酯A（Tomentolide A）和徐長卿甙B_qt（cynatratosideB_qt）同時 位 列Degree 值 首 位（Degree 值29）。中藥-成分-重合靶點網絡見圖3。

2.4 蛋白相互作用網絡構建及核心靶點收集將144個交集靶點上傳至STING數據庫，將蛋白-蛋白互作結果導入至Cytoscape 3.6.1 軟件，見圖4。該網絡共包括142 個節點和1267 條邊，其中兩個靶點無蛋白相互作用。利用“Networkanalyze”功能分析其網絡拓撲學屬性，結果分析得出Degree 中位數為12，CC 中位數為0.462，BC中位數為0.002。根據大于2 倍Degree 中位數和大于其他指標中位數的篩選標準，共篩選出34 個關鍵靶點。見表2。

圖4 徐長卿-川芎藥對治療AF的PPI網絡

表2 核心靶點及網絡拓撲學信息表

2.5 生物通路富集分析將徐長卿-川芎治療AF的PPI網絡中篩選出的34個關鍵靶點導入Metascape數據庫，對其進行生物通路富集分析，結果發現徐長卿-川芎治療AF的通路主要涉及癌癥途徑、內分泌抵抗、卡波西氏肉瘤相關皰疹病毒感染、生長因子受體和第二信使信號轉導，還可能涉及血流動力學、炎癥因子表達等信號通路。此外，富集分析發現多個調控細胞和調控酶生物過程也參與其中。見圖5—6。

圖5 徐長卿-川芎藥對治療AF生物通路熱圖

圖6 徐長卿-川芎治療AF富集分析

2.6 分子對接驗證CB-Dock 是一種界面友好的在線分子對接工具，它通過AutodockVina 對接程序完成分子對接?！癡ina score”代表通過Vina程序所獲得的口袋參數對受體和配體分子對接產生的復合得分，“Vina score”越低反應受體和配體親密性越高［14］。經篩選，藥物-疾病核心靶點Degree排名前5位的基因靶點為SRC、APP、CASP3、REN、HSP90AA1。通過PDB 數據庫查詢它們所對應的靶蛋白分別為：2SRC、3DXC、3DEH、2REN、3HZ5。由圖7 可知，各有效化學成分比較，徐長卿所含毛紅厚殼內酯A 與靶蛋白2SRC、3DEH 及3HZ5 結合Vina score 平均分值最低，提示該化合物與靶蛋白具有良好的親和力。毛紅厚殼內酯A 與三種靶蛋白具體分子對接模式見圖8。

圖7 徐長卿-川芎藥對有效化學成分和核心靶點對接得分熱圖

3 討論

《黃帝內經》曰：“風者百病之長也。”多種疾病的發生、發展都與“風”關系密切，而風又有內外之分。外風襲心可致心悸、怔忡。早在《諸病源候論》就有云：“風邪搏于心，則驚不自安，驚不已，則悸動不定。”肝陽化風、陰虛風動所致的內風也可導致心悸發生，正如《景岳全書》中記載：“命門水虧，真陰不足而怔忡不已者，左歸飲?！币虼嗽谂R床辨證論治AF 的過程中酌加祛風、熄風之藥有助病情改善。徐長卿和川芎正是兩種代表性的祛風藥物。李中梓《醫宗必讀》曰：“治風先治血，血行風自滅”，兩者同時兼有活血之功效，是治療AF 的優選藥物。此外，風邪與炎癥細胞因子致病廣泛相似，且兩者多數是同一種疾病中西醫兩方面的致病因素［15］。而炎癥細胞因子是AF 重要病因之一［16］。徐長卿和川芎的中藥藥理作用中恰有抗炎和抗氧化應激的作用［17-18］。這加深了研究祛風藥對徐長卿-川芎治療AF的意義。

本研究共收集徐長卿-川芎有效化學成分12種，具有治療靶點的活性成分11 種，潛在干預AF靶點144 個。徐長卿所含的有效化學成分毛紅厚殼內酯A 和徐長卿甙B_qt（cynatratosideB_qt）具有最多的潛在靶點，因此推斷徐長卿在干預AF 多靶點的過程中發揮更大作用。經潛在干預靶點PPI 網絡拓撲學分析，進一步篩選出34 個核心靶點。排名前五位的是SRC、APP、CASP3、REN、HSP90AA1。其中部分靶點已經證明在AF 的發病和病情的演變過程中有重要作用。首先，MEIJERING 等［19］發現改變SRC 所產生的激酶的藥理學作用可能為臨床治療AF 提供新的治療可能性；其次，APP 所表達的β-淀粉樣蛋白通過其對鈣穩態和調節蛋白的直接作用顯示出致心律失常活性，從而通過肺靜脈中淀粉樣蛋白的沉積在AF 的發生中發揮潛在作用［20］。此外，CASP3 蛋白表達的遺傳抑制可導致AF 相關凋亡的抑制［21］，表明CASP3 在致心律失常性心房重構的發病機制中起重要作用。LUO 等［22］調查了889 名AF 患者和1015名對照者中CASP3 基因多態性，發現該基因與中國漢族人群AF 風險獨立相關。此外，REN 為表達腎素的重要基因，臨床中使用腎素-血管緊張素系統抑制劑可緩解AF 患者病情［23］。雖然核心靶點HSP90AA1 尚未有直接的實驗證明其在AF 中的作用，但動物實驗研究表明HSP90AA1 是心肌缺血再灌注時miR-1 的新靶點，HSP90AA1 的恢復可能對缺血的心肌產生保護作用，也表明該靶點在心血管疾病研究中的重要地位［24］。

徐長卿-川芎各有效化學成分間有密切的協同關系，其核心靶點在AF 中發揮著至關重要的作用。為進一步研究徐長卿-川芎治療AF 的作用機制，將34 個核心靶點進行生物通路富集分析。發現生長因子受體和第二信使的信號轉導及IL-17信號通路最有可能是徐長卿-川芎治療AF 的關鍵通路。此外，機制中可能還涉及炎癥因子表達和血流動力學等方面的信號通路。其中生長因子受體和第二信使的信號轉導中有AKT1、PIP2、PIP3、PI3K 等重要信號節點參與，它們均與AF 關系密切。其中大量血管緊張素Ⅱ可激活AKT1 以及TGF-β-Smad2/3 信號通路，最終激活NF-kB 靶基因［25］。而大量血管緊張素Ⅱ誘導AF 模型經高通量測序過程中發現有1719 個基因在心房中有差異化表達，其主要參與調節細胞遷移、細胞黏附、補體活化和炎癥反應等［26］。KCNQ 相對應的基因突變是導致AF 重要原因之一，其碳末端的關鍵區域似乎是由PIP2 調節以穩定通道開放狀態［27-28］。PIP3 則可以增強胰島素信號從而增加鈉離子電流，最終降低AF 的易感性和持續時間［29］。CHONG等［30］研究發現，上調PI3K、AKT 表達可起到治療心衰兔模型中AF 的作用。促炎癥因子IL-17 參與AF的發展過程，可能與IL-17參與體內炎癥、氧化應激和心肌纖維化等多個途徑有關［31］。這證明祛風藥對徐長卿-川芎在治療AF 過程中有抗炎機制參與，且與中醫祛風理論密切相關。GO 富集分析提示水解酶活性的正調控生物過程可能參與其中。故有研究發現作為基質金屬蛋白水解酶9 和基質金屬蛋白水解酶2的表達上調與AF患者心房結構重構的高調控指標呈正相關，證明兩者均參與AF的發生、發展過程［32］。

分子對接驗證發現，徐長卿所含毛紅厚殼內酯A 與靶蛋白2SRC、3DEH 及3HZ5 結合Vina score平均分值最低，提示該化合物與靶蛋白具有良好的親和力，且該化合物存在最多潛在靶點。因此，推斷徐長卿在治療AF 過程中發揮更大作用，但該推斷尚需進一步實驗驗證。

本研究通過網絡藥理學和分子對接的方法研究祛風藥對徐長卿-川芎治療AF 的機制，進一步證實了中藥通過多靶點及復雜途徑治療疾病的過程。徐長卿-川芎治療AF活性成分主要是毛紅厚殼內酯A等12種。而SRC、APP、CASP3、REN、HSP90AA1等34 個核心靶點可能通過生長因子受體和第二信使的信號轉導及IL-17 信號通路，以及多種調控細胞和調控酶的參與下，起到減少AF 患者炎癥反應，保護心肌細胞，改善心肌重構等作用。本研究可為祛風藥對徐長卿-川芎治療AF 提供一定的依據，也可為中西醫融合發展研究提供思路。