基于網絡藥理學探討真武湯合葶藶大棗瀉肺湯治療急性心力衰竭的作用機制*

張和針，劉培中，賴天偉，劉 思，艾長江

廣東省中醫院珠海醫院，廣東 珠海 519000

急性心力衰竭是各種心臟疾病進展出現嚴重臨床癥狀或晚期階段，死亡率和再住院率顯著升高。發達國家的心衰發病率為1.5%～2.0%，70 歲以上人群發病率≥10%［1］。2003年流行病學調查顯示，我國35～74 歲成年人中心力衰竭發病率為0.9%［2］。目前，急性心力衰竭及基于慢性心力衰竭的急性發作是全世界主要的公共疾病問題之一。流行病學調查顯示，目前不斷升高的醫療水平使患心臟疾病患者生存期延長，一定程度上致使我國心衰發病率呈持續升高趨勢［3］。與治療慢性心力衰竭相比，治療急性心力衰竭的藥物研究近幾十年來無較大進展，而改善癥狀、穩定血流動力學狀態，可以爭取更多治療時間，讓醫生能更充分予患者綜合性治療，有利于改善患者生活質量及遠期預后。

《黃帝內經》論述心力衰竭的病因病機比較復雜，時令異常可致病，臟腑經脈傳變、飲食不節、七情內傷、氣血失調亦可致病。《傷寒雜病論》認為，心衰與少陰相關（指足少陰腎與手少陰心），與氣化不利、心腎陽虛、水液不化、凌心射肺以及氣虛血瘀、血不利則為水等有關。現代各名醫大家對于心衰病因病機的認知已基本形成共識［4］，大多認為心衰病位在心，五臟相關，為本虛標實之證，以氣虛、陽虛、陰虛為本虛，水停、血瘀、痰飲為標實。

真武湯與葶藶大棗瀉肺湯兩方都來源于《傷寒雜病論》，其曰：“太陽病……其人仍發熱，振振欲……真武湯主之”“肺癰胸滿脹……喘鳴迫塞，葶藶大棗瀉肺湯主之”［5］。此二方均有利水功效，葶藶大棗瀉肺湯主要瀉心肺、逐水飲，而真武湯為溫陽化氣利水劑。真武湯合葶藶大棗瀉肺湯溫陽化氣而治本，利水逐飲以治標，標本兼治，諸藥合用起溫壯心腎之陽氣、利水消腫，共奏溫陽化氣利水之功效。藥理學研究表明，真武湯方中附子、白術、茯苓均有利尿作用［6］，其中附子是通過強心、擴血管而利尿；白術是直接作用于電解質的排泄而起利尿作用；茯苓可通過降低抗利尿激素分泌且提高滲透壓的調定點而利尿。另外研究表明，真武湯可增強心肌收縮力、減輕前后負荷、改善心臟舒縮功能［7］。葶藶大棗瀉肺湯具有強心、減慢心率、增強心肌收縮力、提高衰竭心臟的心輸出量、降低靜脈壓、松弛血管平滑肌、減少肺血管阻力、縮小擴大的心臟等作用［8］。因此，兩方并用不僅可改善心衰患者的臨床癥狀、體征，還可擴張血管、改善心肌舒縮功能，對改善心臟功能具有重要價值。

真武湯合葶藶大棗瀉肺湯成分復雜，靶點眾多，其作用機制尚不明確。因此，本研究通過利用網絡藥理學方法，建立真武湯合葶藶大棗瀉肺湯-急性心力衰竭-靶點互作網絡，詮釋急性心力衰竭治療急性心力衰竭的可能作用機制，以期為治療急性心力衰竭提供新的治療方法。

1 資料與方法

1.1 真武湯合葶藶大棗瀉肺湯成分與潛在靶點篩選本研究采用中藥系統藥理學分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）檢索附子、生姜、茯苓、白術、白芍、葶藶子、大棗7 味中藥的全部化學成分，TCMSP 數據庫以化合物口服生物利用度（oral bioactivity，OB）≥30%和類藥性（drug likeness，DL）≥0.18 作為活性化合物的篩選條件。同時利用中醫分子機理生物學信息分析工具（BATMANTCM，http：//bionet.ncpsb.org.cn/batmantcm/）對這7 味藥進行檢索，檢索條件為score cutoff≥20，P-value cutoff＜0.05；檢索的化合物成分須符合OB≥30%和類DL≥0.18，得到對應的化合物靶點。將兩個數據庫的成分預測靶點去重合并，建立真武湯合葶藶大棗瀉肺湯化學成分-靶點數據庫。

1.2 急性心力衰竭疾病靶點的確定通過藥物靶標數據庫（Therapeutic Target Database，TTD）（http：//db.idrblab.net/ttd/），比較毒理基因組學數據庫（The Comparative Toxicogenomics Database，CTD）（http：//ctdbase.org/），在線人類孟德爾遺傳數據庫（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM0）（https：//www.omim.org/）及GenCards（http：//www.genecards.org/）檢索與急性心力衰竭相關靶點。將4個數據庫的成分預測靶點去重合并，建立急性心力衰竭疾病靶點數據庫。

1.3 獲取真武湯合葶藶大棗瀉肺湯與急性心力衰竭疾病的共同靶點利用Uniprot（https：//www.uniprot.org/）將真武湯合葶藶大棗瀉肺湯靶點轉換為標化靶點，獲得swiss-prot ID，將藥物與疾病靶點輸入Venny2.1（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）繪制韋恩圖，獲得共同靶點。

1.4 蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction，PPI)網絡的構建將真武湯合葶藶大棗瀉肺湯-急性心力衰竭疾病共同作用靶點導入STRING（https：//string-db.org/cgi/input.pl）數據庫中，以置信度分數score＞0.9 為條件進行篩選，并隱藏網絡中無聯系的節點，余參數不變，獲取真武湯合葶藶大棗瀉肺湯-急性心力衰竭疾病PPI網絡。

1.5 基因本體(gene ontology，GO)功能與KEGG信號通路富集分析利用David 6.8 數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp）對真武湯合葶藶大棗瀉肺湯和急性心力衰竭疾病共同作用靶點蛋白進行GO 功能和KEGG 通路富集分析。GO 功能分析主要用于描述基因靶點的功能，包括細胞功能、分子功能和生物功能。KEGG 富集分析可以得到真武湯合葶藶大棗瀉肺湯和急性心力衰竭疾病共同靶點所富集的信號通路。利用Cytoscape 3.8.2 軟件構建“藥物-活性化學物質-疾病-作用靶點-作用途徑”網絡圖，藥物活性成分、作用靶點、疾病以“節點”表示，節點之間的相互作用以“邊”表示。

2 結果

2.1 藥物-疾病靶點的獲取結果在TCMSP 及BATMAN-TCM 數據庫中查詢真武湯合葶藶大棗瀉肺湯治療疾病的活性成分作用靶點，根據OB≥30%和DL≥0.18，共獲得631個，去除重復靶標后，共獲得196個潛在靶標。見表1。

表1 真武湯合葶藶大棗瀉肺湯中OB值前10的化合物基本信息

2.2 急性心力衰竭疾病靶點篩選通過在TTD，CTD，OMIM 和GenCards 數據庫檢索，并結合相關文獻，限定Score≥10，共得到與AS 疾病相關人類靶點2271個。

2.3 真武湯合葶藶大棗瀉肺湯與急性心力衰竭疾病共同作用靶點預測利用Venny 2.1 繪制韋恩圖，篩選出真武湯合葶藶大棗瀉肺湯與急性心力衰竭疾病的共同的靶點，得到共同靶點127 個，有HTR3A、MMP2、ACHE、AKR1B1、ADRA2B、ADRA2C、AR、SLPI、BAX、BCL2等。見圖1。

圖1 真武湯合葶藶大棗瀉肺湯與急性心力衰竭疾病靶點的匹配韋恩圖

2.4 關鍵靶點的PPI構建將127個真武湯合葶藶大棗瀉肺湯與急性心力衰竭疾病共同靶點的潛在靶點錄入STRING數據庫中，進行分析得到PPI，見圖2A。該網絡圖共包含127 個節點，394 條邊，平均節點度為6.4，平均局部聚類系數為0.45，其中節點表示蛋白，每條邊則表示蛋白與蛋白之間的相互作用關系，線條越多表示關聯度越大。導入Cytoscape 軟件，利用Cytoscape 中cytoHubba插件，挖掘hub 基因，ESR1、AKT1、JUN、MYC、MAPK1、MAPK14、CXCL8、FOS、IL-1B、IL-6 為排名前十的基因，這些靶基因可能是PPI 網絡中的樞紐節點，也很可能是白芍總苷治療OLP 的核心靶點，見圖2B。

圖2 STRING數據庫分析蛋白的相互作用

2.5 共同作用靶點的GO富集分析和KEGG通路分析GO 富集分析：P值代表富集的顯著性，相應的P值越小，其顏色越偏向紅色，反之顏色偏向藍色；橫坐標表示富集數目。提示真武湯合葶藶大棗瀉肺湯-急性心力衰竭疾病-基因的生物過程（BP）顯著富集在脂多糖、細菌源、金屬離子、營養水平、氧自由基、抗生素反應等；分子功能（MF）主要富集在血紅素結合、兒茶酚胺結合、四吡咯結合、磷酸酶結合、細胞因子受體結合等。細胞組分（CC）主要富集在膜筏、膜微結構域、膜區域、小凹、質膜筏、囊腔等。見圖3A—C。

圖3 真武湯合葶藶大棗瀉肺湯與急性心力衰竭疾病靶點的生物功能分析

KEGG 富集分析：將得的127 個共作靶點通過DAVID 數據庫進行KEGG 通路富集分析，運行后得到147條通路。將通路排名前20位的結果繪制得到條形圖，見圖4。橫坐標表示靶點數，縱坐標表示通路名稱，顏色表示P值，P值越小顏色越偏向紅色，P值越大則越偏向藍色。結果顯示，真武湯合葶藶大棗瀉肺湯治療急性心力衰竭疾病靶點主要富集的是AGE-RAGE 糖尿病并發癥中的信號通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、流體剪切應力和動脈粥樣硬化（fluid shear stress and atherosclerosis）、腫瘤壞死因子信號通路、IL-17 信號通路（IL-17 signaling pathway）、TLR 信號通路（toll-like receptor signaling pathway）等，提示真武湯合葶藶大棗瀉肺湯治療急性心力衰竭疾病可能通過以上多條信號通路起到協同作用。

圖4 真武湯合葶藶大棗瀉肺湯治療急性心力衰竭的KEGG富集分析

2.6 真武湯合葶藶大棗瀉肺湯-成分-作用靶點-通路-急性心力衰竭疾病網絡構建采用Cytoscape軟件構建真武湯合葶藶大棗瀉肺湯-成分-作用靶點-通路-急性心力衰竭疾病的網絡模型。其中黃色菱形節點代表疾病、紅色菱形節點代表藥物、粉紅色橢圓形節點代表成分，藍色長方形節點代表共同作用靶點，黃色三角形代表KEGG，綠色橢圓形代表通路，邊代表相互作用關系。其中檞皮素、β-谷固醇、山柰酚、芍藥苷、β-胡蘿卜素、光千金藤堿能與60 個以上靶點相連接，推測這6 個成分是真武湯合葶藶大棗瀉肺湯中多靶點治療急性心力衰竭疾病的主要活性成分。ESR1、AKT1、JUN、MYC、MAPK1、MAPK14、CXCL8、FOS、IL-1B、IL-6 這些靶點可能在急性心力衰竭疾病治療中發揮重要的作用。以上結果可以得出真武湯合葶藶大棗瀉肺湯的各個成分通過多靶點、多信號通路來治療急性心力衰竭疾病。見圖5。

圖5 中藥-成分-潛在性靶標-通路-疾病網絡圖

3 討論

急性心力衰竭發作時，以穩定血流動力學、糾正低氧，維護各臟器灌注和功能、治療急性心力衰竭的病因和誘因、預防血栓栓塞等為治療目標。前期臨床研究提示，真武湯合葶藶大棗瀉肺湯可在西醫基礎治療上進一步提高陽虛水泛型急性心力衰竭患者的治療作用。目前真武湯合葶藶大棗瀉肺湯藥效物質基礎和作用機制不十分明確。

本研究結果顯示，通過TCMSP 數據庫共篩選出真武湯合葶藶大棗瀉肺湯活性成分主要有檞皮素、β-谷固醇、山柰酚、芍藥苷、β-胡蘿卜素、光千金藤堿等。山柰酚（kaempferol）屬于黃酮類化合物，主要來源于姜科植物山柰的根莖，又名山柰黃酮醇、山柰素、四羥基黃酮、山柰酚-3 等，具有抗癌、防癌、抗病毒、抗菌、抗氧化、抗炎等多種作用［9-10］。槲皮素是一種黃酮類化合物，具有很強的生物活性，可通過減少氧化應激、干擾腎素-血管緊張素-醛固酮系統和下調活性氧介導的下游信號通路等方式，發揮抗氧化、抗腫瘤、抗炎癥、抗菌和保護心血管等藥理作用［11］。提示這些活性成分在治療急性心力衰竭疾病中發揮著顯著效果。這與目前基礎研究的結果相同，證實了本研究預測結果的可靠性。

通過STRING 數據庫構建靶點交互作用網絡，分析得到排名前10 位的靶點有ESR1、AKT1、JUN、MYC、MAPK1、MAPK14、CXCL8、FOS、IL-1B、IL-6，提示這些靶點可能是治療急性心力衰竭中的重要靶點。E2通過膜ESR 而與胞內信號轉導蛋白發生作用，它發揮心血管保護作用是由ESR1 非轉錄途徑介導的，可以活化內皮細胞中的一氧化氮合酶［12］。AKT1 作用通道調控細胞增殖和生長，參與包括細胞凋亡和葡萄糖代謝在內的細胞過程。JUN 是重要的絲裂原活化蛋白激酶，是把細胞外信號轉到細胞內的關鍵酶，參與細胞的生長、發育、分裂、死亡等多種生理反應過程［13］。缺氧可導致動脈血管內皮細胞損傷有關的基因的表達水平發生變化，通過下調缺氧條件下細胞中FOS 基因的表達，可以抑制NR4A1基因，并降低由于缺氧升高的p38的磷酸化，從而起到減輕動脈血管內皮細胞損傷的作用［14］。綜上所述，真武湯合葶藶大棗瀉肺湯可能通過調節上述基因靶點的表達，減輕由其引發的細胞凋亡、細胞代謝、炎癥反應，從而延緩急性心力衰竭進展。

GO 功能富集分析顯示，關鍵靶點的生物過程顯著富集在脂多糖、細菌源、金屬離子、營養水平、氧自由基、抗生素反應等；分子功能主要富集在血紅素結合、兒茶酚胺結合、四吡咯結合、磷酸酶結合、細胞因子受體結合等。細胞組分主要富集在膜筏、膜微結構域。這些生物學功能在上述活性成分及關鍵靶點涉及的通路都有所體現。

KEGG 通路富集結果提示，真武湯合葶藶大棗瀉肺湯可能是AGE-RAGE 糖尿病并發癥中的信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、IL-17 信號通路、TLR 信號通路，起到治療急性心力衰竭的作用。AGEs-RAGE 信號通路激活NF-κB，可引起大量黏附分子、生長因子、促炎細胞因子（如白細胞介素6、白細胞介素8、腫瘤壞死因子α）等的表達和釋放，最終引起慢性細胞活化和組織損傷［15］。糖尿病并發癥AGE-RAGE途徑與心腎綜合征發病密切相關［16］。晚期糖基化終末產物（advanced glycation end products，AGEs）與不同組織RAGE 受體結合會誘發炎癥反應、內皮功能障礙等，是心腎綜合征主要發病機制之一［17］。AGEs 水平增高是急性心力衰竭患者死亡的獨立危險因素［18］。IL-17 信號通路一是具有聚集和激活中性粒細胞、單核細胞等炎癥細胞的功能；二是通過核因子κB 途徑促進多種炎癥遞質的釋放，從而放大炎癥反應，加重組織損傷［19］。TNF 信號通路不僅與炎癥、凋亡密切相關，而且其與PI3K-Akt 信號通路間的交叉作用參與細胞周期調節［20］。可見真武湯合葶藶大棗湯中的活性成分對急性心力衰竭的生物過程及多條信號通路具有調控作用。

多項研究提示，網絡藥理學研究可以闡明中藥“多成分-多靶標”的作用特點。本研究經過網絡藥理學分析預測發現，真武湯合葶藶大棗瀉肺湯通過主要活性化合物檞皮素、β-谷固醇、山柰酚、芍藥苷等的靶標調節機制和AGE-RAGE、IL-17等信號通路，發揮治療急性心力衰竭的作用，這為更深入探討其作用機制提供了新方向，但仍需更多的實驗及臨床研究進行驗證。